靶向進(jìn)化枝2.3的h5流感病毒上的中和表位的單克隆抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及靶向進(jìn)化枝2.3的H5流感血凝素的主要中和表位的鼠單克隆抗體C、F以及H和其活性片段。本發(fā)明還涉及使用鼠單克隆抗體C、F或H或其活性片段預(yù)防和治療H5N1流感的方法和組合物。本發(fā)明另外涉及利用鼠單克隆抗體C、F或H或其片段和互補(bǔ)性鼠單克隆抗體或其活性片段提供通用的針對H5流感病毒的保護(hù)的方法和組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用這些鼠單克隆抗體或其片段表征和定量H5表達(dá)的方法和組合物。
【專利說明】靶向進(jìn)化枝2.3的H5流感病毒上的中和表位的單克隆抗體
[0001]序列提交
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【背景技術(shù)】
[0003]本發(fā)明涉及對進(jìn)化枝2.3的H5流感血凝素的主要中和表位具有特異性的鼠單克隆抗體C、F和H以及其活性片段。本發(fā)明還涉及使用鼠單克隆抗體C、F或H或其活性片段預(yù)防和治療H5N1流感的方法和組合物。此外，本發(fā)明還涉及使用鼠單克隆抗體C、F或H或其片段以及互補(bǔ)性鼠單克隆抗體或其活性片段，提供通用的針對H5流感病毒的保護(hù)的方法和組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用這些鼠單克隆抗體或其片段表征和定量H5表達(dá)的方法和組合物。
[0004]用于說明本發(fā)明的背景或提供關(guān)于實(shí)踐的其他詳情的出版物和其他材料通過引用并入本文，并且出于便利，將其分別列于參考文獻(xiàn)目錄中。
[0005]最近，甲型流感病毒H5N1毒株的出現(xiàn)和其對人造成的高死亡率已引起人們對未來流感大流行的可能性的關(guān)注。為了預(yù)防另一流行病的爆發(fā)，在全球范圍內(nèi)對針對散布性(circulating)H5N1毒株的預(yù)防性措施和治療性措施投入了極大的興趣和努力。現(xiàn)在的疫苗策略已經(jīng)受到流感毒株抗原變異的阻礙?，F(xiàn)在的疫苗策略需要抗體的內(nèi)源性合成，如果發(fā)生流行性疾病，無法提供針對H5N1感染的直接保護(hù)。目前，獲得許可的抗病毒藥物包括M2離子通道抑制劑(金剛乙胺和金剛胺)和神經(jīng)氨酸酶抑制劑(奧司他韋和扎那米韋)。已知H5N1病毒對M2離子通道抑制劑有抗性(Biegel et al.，2005)。正分離較新的H5N1病毒毒株，其對神經(jīng)氨酸酶抑制劑即奧司他韋和扎那米韋也有抗性(Le et al., 2008 ；deJong et al.，2005)。神經(jīng)氨酸酶抑制劑要求高劑量和長期治療(de Jong and Hien, 2006),增加有害副作用的可能性。因此，用于治療流感的替代策略是必要的。
[0006]作為治療許多感染性疾病的可行選項(xiàng)，考慮過使用單克隆抗體的被動免疫治療。目前，已經(jīng)大量關(guān)注使用針對流感病毒HAl蛋白的中和抗體的治療方法。因?yàn)樵摰鞍踪|(zhì)位于病毒的表面，因此易于靶向，并且針對這種蛋白質(zhì)的抗體能夠有效中和病毒。因此，針對H5血凝素(HA)的中和表位的單克隆抗體(Mab)可能是人主動接種疫苗的有吸引力的備選方案，特別是對于流感感染風(fēng)險(xiǎn)高的個體，即不能很好地響應(yīng)主動免疫的免疫功能不全的患者或老年人。重要的是，任何Mab產(chǎn)物都應(yīng)當(dāng)提供針對傳播性H5N1流感毒株的廣泛保護(hù)，并且應(yīng)當(dāng)防止體內(nèi)的中和逃逸突變體選擇。一種提高針對傳播性H5N1流感毒株保護(hù)和防止逃逸突變體的技術(shù)是使用互補(bǔ)性Mab的聯(lián)合療法(Prabakaran et al., 2009)。
[0007]需要鑒定靶向進(jìn)化枝2.3的H5流感血凝素的主要中和表位的單克隆抗體。還需要鑒定能夠用于預(yù)防和治療H5N1流感的單克隆抗體。進(jìn)一步，需要鑒定能夠用于提供通用的針對H5流感病毒的保護(hù)的單克隆抗體。還需要鑒定能夠用于鑒定、表征和/或定量H5表達(dá)的單克隆抗體。
[0008]發(fā)明概述
[0009]本發(fā)明涉及靶向進(jìn)化枝2.3的H5流感血凝素的主要中和表位的鼠單克隆抗體C、F以及H和其活性片段。本發(fā)明還涉及使用鼠單克隆抗體C、F或H或其活性片段預(yù)防和治療H5N1流感的方法和組合物。本發(fā)明另外涉及使用鼠單克隆抗體C、F或H或其片段以及互補(bǔ)性鼠單克隆抗體或其活性片段提供通用的針對H5流感病毒的保護(hù)的方法和組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用這些鼠單克隆抗體或其片段表征和定量H5表達(dá)的方法和組合物。
[0010]因此，在第一方面，本發(fā)明提供對H5流感血凝素的主要中和表位具有特異性的單克隆抗體和其活性片段即抗原結(jié)合片段(在本文中也稱為抗體片段)。在一些實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或其片段與H5血凝素(HA)的構(gòu)象表位特異性結(jié)合，其中所述構(gòu)象表位包含成熟HA蛋白的氨基酸152Lys、184Ala以及190Pro。在另一實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或其片段與H5血凝素的構(gòu)象表位特異性結(jié)合，該構(gòu)象表位與鼠單克隆抗體C特異性結(jié)合。在另一實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體C。在另外的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠雜交瘤C產(chǎn)生的鼠單克隆抗體C。
[0011]在其他實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或其片段與H5血凝素(HA)的構(gòu)象表位特異性結(jié)合，其中所述構(gòu)象表位包含成熟HA蛋白的氨基酸152Lys和221Gly。在另一實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或其片段與H5血凝素的構(gòu)象表位特異性結(jié)合，該構(gòu)象表位與鼠單克隆抗體F特異性結(jié)合。在另一實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體F。在另外的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠雜交瘤F產(chǎn)生的鼠單克隆抗體F。
[0012]在另外的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或其片段與H5血凝素(HA)的構(gòu)象表位特異性結(jié)合，其中所述構(gòu)象表位包含成熟HA蛋白的氨基酸141Ρι.ο和152Lys。在另一實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或其片段與H5血凝素的構(gòu)象表位特異性結(jié)合，該構(gòu)象表位與鼠單克隆抗體H特異性結(jié)合。在另一實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體H。在另外的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠雜交瘤H產(chǎn)生的鼠單克隆抗體H。
[0013]在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼本文所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段的核酸。在一實(shí)施方案中，所述核酸編碼鼠單克隆抗體C或其抗原結(jié)合片段。在另一實(shí)施方案中，所述核酸編碼鼠單克隆抗體F或其抗原結(jié)合片段。在另外的實(shí)施方案中，所述核酸編碼鼠單克隆抗體H或其抗原結(jié)合片段。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含所述核酸的載體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含并表達(dá)所述載體的細(xì)胞。
[0014]在第二方面，本發(fā)明提供使用本文所述的鼠單克隆抗體或其片段預(yù)防和治療H5N1流感的方法和組合物。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含本文所述的單克隆抗體和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或運(yùn)載體的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體C。在其他實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體F。在另外的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體H。在另外的實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含本文所述的單克隆抗體的抗原結(jié)合片段和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或運(yùn)載體。在一些實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合片段是鼠單克隆抗體C的抗原結(jié)合片段。在其他實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合片段是鼠單克隆抗體F的抗原結(jié)合片段。在另外的實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合片段是單克隆抗體H的抗原結(jié)合片段。在另外的實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含編碼所述抗體或抗體片段的核酸分子和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或運(yùn)載體。在另外的實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含載體和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或運(yùn)載體，所述載體包含所述核酸。在另一實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含表達(dá)所述載體的細(xì)胞和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或運(yùn)載體。在另外的實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含編碼所述抗體或抗體片段的核酸分子和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或運(yùn)載體。在另一實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含載體和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或運(yùn)載體，所述載體包含所述核酸。在另一實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含表達(dá)所述載體的細(xì)胞和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或運(yùn)載體。
[0015]在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供減少個體的H5N1流感病毒感染或降低個體中H5N1流感病毒感染風(fēng)險(xiǎn)，抑制個體被進(jìn)化枝2.3的一種或多種H5N1流感病毒毒株或分離株感染，或預(yù)防進(jìn)化枝2.3的一種或多種H5N1流感病毒毒株或分離株的流感感染或疾病的方法。在該實(shí)施方案中，所述方法包括向有需要的個體施用治療有效量的本文所述的單克隆抗體其抗原結(jié)合片段、包含編碼所述抗體或抗體片段的多核苷酸的核酸分子、包含所述多核苷酸的載體或表達(dá)所述載體的細(xì)胞。在一實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體C。在另一實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體F。在另外的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體H。在一實(shí)施方案中，所述個體是免疫功能不全的，是嬰兒，是幼兒或是老年人。在另一實(shí)施方案中，施用提供了治療效果。在另外的實(shí)施方案中，治療效果包括抑制流感病毒效價(jià)的增加，降低流感病毒效價(jià)，抑制流感病毒復(fù)制的增加，降低流感病毒復(fù)制，抑制流感病毒增殖的增加或降低流感病毒增殖，或降低個體中與流感病毒感染相關(guān)的一種或多種癥狀或并發(fā)癥的進(jìn)展、嚴(yán)重性、頻率、持續(xù)時(shí)間或概率。在一實(shí)施方案中，癥狀或并發(fā)癥選自發(fā)冷、發(fā)燒、咳嗽、咽喉痛、鼻塞、鼻竇阻塞、鼻感染、鼻竇感染、身體疼痛、頭疼、疲勞、肺炎、支氣管炎、耳部感染、耳疼和死亡。在另一實(shí)施方案中，所述治療效果包括加速個體由H5N1流感病毒感染康復(fù)。在另外的實(shí)施方案中，給所述個體施用的藥劑在個體感染H5N1流感病毒之前、基本上同時(shí)或之后施用。
[0016]在一實(shí)施方案中，在預(yù)防和治療H5N1流感的方法和組合物中，本文所述的鼠單克隆抗體或其片段與至少一種互補(bǔ)性單克隆抗體或其抗體片段結(jié)合使用。根據(jù)該實(shí)施方案，互補(bǔ)性Mab的使用提高了針對H5N1流感病毒傳播毒株的保護(hù)并防止逃逸突變。在一些實(shí)施方案中，在所述方法和組合物中，本文所述的第一鼠單克隆抗體或其活性片段與第二互補(bǔ)性鼠單克隆抗體或其活性片段使用結(jié)合。在一實(shí)施方案中，所述第一鼠單克隆抗體是單克隆抗體C。在另一實(shí)施方案中，所述第一鼠單克隆抗體是單克隆抗體F。在另外的實(shí)施方案中，所述第一鼠單克隆抗體是單克隆抗體H。在一實(shí)施方案中，所述第二互補(bǔ)性鼠單克隆抗體是鼠單克隆抗體2D9。除了所述方法和組合物使用互補(bǔ)性單克隆抗體或其片段之外，如本文所述的組合物和方法是關(guān)于單個單克隆抗體或其片段的。
[0017]在第三方面，本發(fā)明提供使用本文所述的單克隆抗體或其片段，表征和/或定量樣品中H5表達(dá)的方法和組合物。在一些實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體C。在其他實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體F。在另外的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體H。在一實(shí)施方案中，H5表達(dá)涉及H5N1流感病毒HA的表達(dá)。在一實(shí)施方案中，所述組合物包含本文所述的單克隆抗體或其片段。在一些實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體C。在其他實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體F。在另外的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體H。在另一實(shí)施方案中，所述方法包括檢測H5與本文所述的單克隆抗體或其片段的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體C。在其他實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體F。在另外的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體H。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及涉及免疫熒光測定(IFA)、免疫組織化學(xué)測定和利用這類結(jié)合蛋白的其他方法，包括ELISA、血細(xì)胞凝集抑制(HI)測定和病毒中和(VN)測定。
[0018]在第四方面，本發(fā)明提供用于檢測生物學(xué)標(biāo)本中甲型流感病毒的試劑盒和方法。在一實(shí)施方案中，所述檢測涉及H5N1流感病毒的檢測。在另一實(shí)施方案中，所述檢測涉及進(jìn)化枝2家族H5N1流感病毒的檢測。在另外的實(shí)施方案中，所述檢測涉及進(jìn)化枝2.3的H5N1流感病毒的檢測。在一實(shí)施方案中，所述方法包括使標(biāo)本與第一抗體接觸，所述第一抗體是本文所述的單克隆抗體或其抗體片段。在一些實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體C。在其他實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體F。在另外的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體H。在另一實(shí)施方案中，所述方法還包括使所述標(biāo)本與第二抗體接觸，所述第二抗體與甲型流感病毒H5血凝素的表位特異性結(jié)合，其中所述第二抗體含有可檢測元件或與之綴合。在一些實(shí)施方案中，所述第二抗體含有放射性原子，與熒光分子綴合，或與酶綴合。在其他實(shí)施方案中，將第一抗體固定化于固相表面。
[0019]在一實(shí)施方案中，所述試劑盒包含第一抗體和用于進(jìn)行檢測甲型流感病毒的測定的說明書，所述第一抗體是本文所述單克隆抗體或其抗體片段。在一實(shí)施方案中，所述試劑盒涉及H5N1流感病毒的檢測。在另一實(shí)施方案中，所述試劑盒涉及進(jìn)化枝2家族的H5N1流感病毒的檢測。在另外的實(shí)施方案中，所述試劑盒涉及進(jìn)化枝2.3的H5N1流感病毒的檢測。在一些實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體C。在其他實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體F。在另外的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體H。在另一實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括與甲型流感病毒H5血凝素的表位特異性結(jié)合的第二抗體，其中所述第二抗體含有可檢測元件或與之綴合。在一些實(shí)施方案中，所述第二抗體含有放射性原子，與熒光分子綴合，或與酶綴合。在其他實(shí)施方案中，將所述第一抗體固定化于固相表面。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1顯示在安徽H5感染的MDCK細(xì)胞中，mAb C、F或H針對H5毒株的反應(yīng)性，所述反應(yīng)性用IFA測定。用Mab或PBS，和二抗對感染并固定的細(xì)胞進(jìn)行，所述二抗是抗小鼠FITC0
[0021]發(fā)明詳述
[0022]本發(fā)明涉及靶向進(jìn)化枝2.3的H5流感血凝素的主要中和表位的鼠單克隆抗體C、F以及H和其活性片段。本發(fā)明還涉及使用鼠單克隆抗體C、F或H或其活性片段預(yù)防和治療H5N1流感的方法和組合物。本發(fā)明另外涉及使用鼠單克隆抗體C、F或H或其片段以及鼠單克隆抗體2D9或其活性片段，提供通用的針對H5流感病毒的保護(hù)的方法和組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用這些鼠單克隆抗體或其片段表征和定量H5表達(dá)的方法和組合物。
[0023]“分離的”表示生物分子不含至少一些天然狀態(tài)下與其一起存在的組分。
[0024]本文所用的術(shù)語“抗體(antibody) ”或“抗體(antibodies) ”是本領(lǐng)域公認(rèn)的術(shù)語，并且理解為指與已知抗原結(jié)合的分子或分子的活性片段，特別是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有與抗原特異性結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)的分子。免疫球蛋白是包含一條或多條多妝的蛋白質(zhì)，所述多妝基本上由免疫球蛋白K和λ、α、y、δ、ε以及μ恒定區(qū)基因以及各種各樣的免疫球蛋白可變區(qū)基因編碼。輕鏈分為K或λ。重鏈分為Y、μ、α、δ或ε，其依次分別限定免疫球蛋白的類別IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。重鏈的亞類也是已知的。例如，人IgG重鏈可以是IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亞類中的任意一個。本發(fā)明的免疫球蛋白可以是任何類別(IgG、IgM、IgD、IgE、IgA以及IgY)或亞類(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl以及IgA2)的免疫球蛋白分子。
[0025]提到抗體時(shí)，本文所用的“特異性結(jié)合”表示抗體與靶抗原結(jié)合的親和性比其與不同結(jié)構(gòu)的抗原結(jié)合的親和性更大。
[0026]已知典型的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)單元包含四聚體。每一四聚體由兩對相同的多肽鏈構(gòu)成，每一對具有一條“輕”鏈(約25kD)和一條“重”鏈(約50-70kD)。每一條鏈的N末端約100-110或更多個主要負(fù)責(zé)抗原識別的氨基酸定義為可變區(qū)。術(shù)語可變輕鏈和可變重鏈(Vh)分別指這些輕鏈和重鏈。
[0027]抗體作為全長完整抗體或作為用各種肽酶或化學(xué)制品消化而產(chǎn)生的若干充分表征的片段存在。因此，例如胃蛋白酶在鉸鏈區(qū)二硫鍵下方消化抗體，從而產(chǎn)生F (ab’) 2，其是Fab 二聚體，所述Fab自身是通過二硫鍵與Vh-CH1連接的輕鏈。F(ab’)2可以在溫和條件被還原，破壞鉸鏈區(qū)的二硫鍵，從而將F(ab’)2 二聚體轉(zhuǎn)化為Fab’單體。Fab’單體實(shí)質(zhì)上是具有部分鉸鏈區(qū)的Fab片段(有關(guān)其他抗體片段的更詳細(xì)描述，參見FundamentalImmunology, ff.E.Paul, ed., Raven Press, N.Y.(1993))。盡管根據(jù)完整抗體的消化，定義了各種抗體片段，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解可以通過化學(xué)方法或利用重組DNA方法重新合成各種抗體片段中的任何片段。因此，本文所用的術(shù)語抗體還包括通過全抗體的修飾所產(chǎn)生的或重新合成的抗體片段或使用重組DNA方法獲得的抗體和片段。
[0028]在本發(fā)明的范圍內(nèi)“抗體”是要包括嵌合或人源化單克隆抗體以及其活性片段。與已知抗原結(jié)合的分子的活性片段的實(shí)例包括分開的輕鏈和重鏈，F(xiàn)ab、Fab/c、Fv、Fab’以及F(ab’)2片段，包括Fab免疫球蛋白表達(dá)文庫的產(chǎn)物和上述任何抗體和片段的表位結(jié)合片段。
[0029]可以通過許多技術(shù)由本發(fā)明的抗體衍生這些活性片段。例如，可以利用酶如胃蛋白酶裂解單克隆抗體，并進(jìn)行HPLC凝膠過濾。接著可以收集含有Fab片段的合適流分并通過膜過濾等進(jìn)行濃縮。用于分離抗體活性片段的通用技術(shù)的進(jìn)一步描述，參見例如Khaw etal.(1982) ；Rousseaux et al.(1986)。
[0030]重組制備的抗體可以是常規(guī)的全長抗體、已知的來自蛋白水解消化的活性抗體片段、獨(dú)特的候選抗體片段如Fv或單鏈Fv (scFv)、結(jié)構(gòu)域刪除的抗體等。Fv抗體的大小約為50Kd，包含輕鏈和重鏈的可變區(qū)。單鏈Fv( “scFv”)多肽是共價(jià)連接的VH::VL異二聚體，其可以由核酸表達(dá)，所述核酸包括直接連接的或通過編碼肽的接頭連接的VH和VL編碼序列。參見Huston et al. (1988)。用于將抗體V區(qū)的天然聚集的但是在化學(xué)上分離的輕多肽鏈和重多肽鏈轉(zhuǎn)化為scFv分子的許多結(jié)構(gòu)，會折疊成基本上與抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)相似的三維結(jié)構(gòu)。參見例如美國專利第5，091，513號、第5，132，405號和第4，956，778號
[0031]結(jié)合部位(combining site)指抗體分子的參與抗原結(jié)合的部分?？乖Y(jié)合位點(diǎn)由重(“H”)鏈和輕(“L”)鏈N末端可變(“V”)區(qū)的氨基酸殘基形成?？贵w可變區(qū)包括三個稱為“高變區(qū)”或“互補(bǔ)決定區(qū)(CDR) ”高度不同的段，它們插入更保守的稱為“框架區(qū)”(FR)的側(cè)翼段之間。在抗體分子中，輕鏈的三個高變區(qū)(IXDR1、IXDR2以及IXDR3)和重鏈的三個高變區(qū)(HCDR1、HCDR2以及HCDR3)在三維空間中彼此相關(guān)排列，形成抗原結(jié)合表面或口袋(pocket)。因此抗體的結(jié)合部位代表構(gòu)成抗體的CDR的氨基酸和構(gòu)成結(jié)合位點(diǎn)口袋的任何框架殘基。
[0032]具體抗體中構(gòu)成結(jié)合部位的氨基酸殘基的相同性，可以使用本領(lǐng)域熟知的方法測定。參見例如美國專利申請公開第2010/0080800號。具體抗體中的氨基酸殘基的相同性，可以使用本領(lǐng)域熟知的方法如分子建模和X射線晶體學(xué)測定，所述氨基酸殘基位于CDR外，但是具有作為結(jié)合部位內(nèi)層(lining)的一部分的側(cè)鏈,從而構(gòu)成所述結(jié)合部位的一部分(即其對于通過結(jié)合部位連接是可行的)。參見例如Riechmann et al.(1988)。
[0033]嵌合抗體是這樣的抗體，其中抗體的一個或多個區(qū)域來自一個動物物種且抗體的一個或多個區(qū)域來自不同的動物物種。優(yōu)選的嵌合抗體是包括靈長類免疫球蛋白的區(qū)域的抗體。用于人臨床用途的嵌合抗體，通常理解為具有來自非人動物如嚙齒類的可變區(qū)和來自人的恒定區(qū)。相比之下，人源化抗體使用來自非人抗體的CDR，而其大部分或所有可變框架區(qū)和所有恒定區(qū)來自人免疫球蛋白。人嵌合抗體通常理解為具有來自嚙齒類的可變區(qū)。典型的人嵌合抗體具有人腫瘤恒定區(qū)和人輕鏈恒定區(qū)，重鏈和輕鏈的可變區(qū)來自嚙齒類抗體。嵌合抗體可以包括人恒定區(qū)天然氨基酸序列和天然嚙齒類可變區(qū)序列的某些變化。嵌合抗體和人源化抗體可以通過本領(lǐng)域熟知的方法制備，包括CDR移植方法(參見例如美國專利第 5,843，708 號、第 6，180，370 號、第 5,693, 762 號、第 5，585,089 號、第 5，530，101號)、鏈替換策略(參見例如美國專利第5，565，332號；Rader et al.(1998))、分子建模策略(美國專利第5，639，641號)等。
[0034]在雙鏈抗體的情況下，本文所用的“人源化抗體”是至少一條鏈人源化的抗體。人源化抗體鏈具有其中一個或多個框架區(qū)是人框架區(qū)的可變區(qū)。單鏈人源化抗體是鏈中具有可變區(qū)的抗體，所述可變區(qū)的一個或多個框架區(qū)是人框架區(qū)。人源化抗體鏈或其片段的可變區(qū)的非人部分源自非人來源，特別是非人抗體，通常是嚙齒類來源。人源化抗體的非人部分通常是至少一個散布于源自一個(或多個)人免疫球蛋白的框架區(qū)之間的CDR區(qū)。另外，可以改變框架支持殘基，以維持結(jié)合親和性。
[0035]人源化抗體還可以包含恒定區(qū)(例如，在輕鏈的情況下，至少一個恒定區(qū)或其一部分，且在重鏈的情況下優(yōu)選三個恒定區(qū))。如果存在，人源化抗體的恒定區(qū)通常是人恒定區(qū)。獲得“人源化抗體”的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。參見，例如，美國專利申請公開第 2010/0080800 號。
[0036]本文所用的術(shù)語恒定區(qū)(CR)指免疫球蛋白恒定區(qū)基因。所述恒定區(qū)基因編碼抗體分子的賦予效應(yīng)子功能的一部分。對于嵌合人抗體和人源化抗體而言，通常以人恒定區(qū)取代非人(例如鼠)恒定區(qū)。所述嵌合抗體或人源化抗體的恒定區(qū)通常源自人免疫球蛋白。所述重鏈恒定區(qū)可以選自五種同種型中的任意一種:α、δ、ε、Y或μ。此外，各種亞類的重鏈(例如重鏈的IgG亞類)負(fù)責(zé)不同的效應(yīng)子功能，因此，通過選擇想要的重鏈恒定區(qū)，可以產(chǎn)生具有想要的效應(yīng)子功能的抗體?？梢杂糜诒景l(fā)明范圍內(nèi)的恒定區(qū)是Yl(IgGl),特別是Yl(IgGl)同種型的Fe區(qū)，Y3(IgG3)以及特別是Y4(IgG4)。所述輕鏈恒定區(qū)是K或λ類型，優(yōu)選地，是K類。在一實(shí)施方案中，所述輕鏈恒定區(qū)是人K恒定鏈(Hieteret al.(1980)),所述恒定重鏈?zhǔn)侨薎gG4恒定鏈。
[0037]本文所用的術(shù)語可變區(qū)(VR)指抗體的每對輕鏈和重鏈中直接參與抗體與抗原的結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。每一重鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)域(Vh)隨后是一些恒定結(jié)構(gòu)域。每一輕鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)域(VJ，并在其另一端具有恒定結(jié)構(gòu)域；所述輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域與所述重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域?qū)R，且所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與所述重鏈的可變結(jié)構(gòu)域?qū)R。
[0038]本文所用的術(shù)語框架區(qū)(FR)指抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)內(nèi)的一個或多個框架區(qū)(參見 Kabat et al.(1992) ； Johnson and Wu (2001) ；http colon backslash backslashimmuno dot bme dot nwa dot edu)。這些表述包括插入抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)內(nèi)⑶R之間的氨基酸序列區(qū)。
[0039]根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)序列定義(Kabat et al.(1992))和結(jié)構(gòu)定義(如在Chothia andLesk(1987)中)，確定⑶R和FR殘基。如果這兩種方法導(dǎo)致⑶R的鑒定稍微不同，則優(yōu)選結(jié)構(gòu)定義，但是通過序列定義方法鑒定的殘基被視為用于確定將哪個框架區(qū)殘基輸進(jìn)共有序列的重要FR殘基。
[0040]術(shù)語“單克隆抗體”是本領(lǐng)域公認(rèn)的，指一種抗體，其是產(chǎn)生單一克隆的抗體的細(xì)胞的產(chǎn)物。單克隆抗體通常通過將正常的短期存活的產(chǎn)抗體B細(xì)胞與快速生長的細(xì)胞如癌細(xì)胞(有時(shí)稱為“永生”細(xì)胞)融合而制備。所得的雜合細(xì)胞或雜交瘤快速繁殖，從而生成產(chǎn)生抗體的克隆。
[0041]術(shù)語“片段”指抗體或抗體鏈的、所包含的氨基酸殘基比完整或全長抗體或抗體鏈少的部分(part)或部分(port1n)。可以通過對完整或完全抗體或抗體鏈進(jìn)行化學(xué)處理或酶促處理獲得片段。還可以通過重組方式獲得片段。片段的實(shí)例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fabc和/或Fv片段。 術(shù)語“抗原結(jié)合片段”指免疫球蛋白或抗體的多肽片段，其與抗原結(jié)合，或在抗原結(jié)合(即特異性結(jié)合)方面與完整抗體(即與衍生所述抗原結(jié)合片段的完整抗體)競爭。結(jié)合片段通過重組DNA技術(shù)或通過酶促或化學(xué)裂解完整免疫球蛋白而產(chǎn)生。結(jié)合片段包括Fab、Fab’、F (ab’).sub.2、Fabc、Fv、單鏈以及單鏈抗體。
[0042]免疫原性降低的人源化抗體指相對于親本抗體，例如，鼠抗體，表現(xiàn)出免疫原性降低的人源化抗體。
[0043]基本上保留了親本抗體的結(jié)合特性的人源化抗體指，保留了與抗原特異性結(jié)合的能力的人源化抗體，用于產(chǎn)生這類人源化抗體的親本抗體識別所述抗原。優(yōu)選地，所述人源化抗體會表現(xiàn)出與親本抗體相同或基本上相同的抗原結(jié)合親和性和親和力。理想地，所述抗體的親和性不少于親本抗體親和性的10%，更優(yōu)選地，不少于約30%，以及最優(yōu)選地，親和性不少于親本抗體的50%。測定抗體親和性的方法是本領(lǐng)域熟知的，包括半最大結(jié)合測定、競爭測定以及斯卡查德分析。
[0044]術(shù)語“互補(bǔ)性單克隆抗體”指這樣一些單克隆抗體,其中一個Mab與特定抗原的一部分相互作用而其他Mab能夠與所述特定抗原的剩余部分或不止剩余部分相互作用?；パa(bǔ)對在診斷或治療中充當(dāng)特定抗原如H5N1的通用試劑。兩個Mab的活性范圍(active field)可以具有重疊區(qū)，但是不相同?；パa(bǔ)性抗H5單克隆抗體的實(shí)例由Prabakaran et al.(2009)描述?；パa(bǔ)性抗H5單克隆抗體的另一實(shí)例由He et al.(2010)描述。
[0045]此外，術(shù)語“治療有效量”指當(dāng)給人或動物施用抗體時(shí)足以在所述人或動物中導(dǎo)致治療效果的抗體的量。按照常規(guī)程序，本領(lǐng)域技術(shù)人員會容易地確定所述有效量。
[0046]本文所用的術(shù)語“治療(treat) ”、“預(yù)防(prevent) ”、“預(yù)防(preventing) ”以及“預(yù)防(prevent1n) ”指由于施用預(yù)防劑或治療劑而防止個體的病癥的一個或多個癥狀的復(fù)發(fā)或發(fā)作。
[0047]通過表位作圖，本申請描述對一組抗進(jìn)化枝2.3的H5的中和Mab的各自表位的表征。本申請還描述對這些Mab在抑制血細(xì)胞凝集和中和病毒方面治療功效的評估。本申請進(jìn)一步描述確定這些Mab與Mab 2D9 一起針對不同進(jìn)化枝的H5N1病毒的通用的治療功效。在本發(fā)明之前，當(dāng)前可用的Mab針對進(jìn)化枝2.3的H5流感病毒的中和效價(jià)低。現(xiàn)有Mab的針對進(jìn)化枝2.3的H5流感病毒的中和效價(jià)低的問題通過本發(fā)明的Mab，即針對進(jìn)化枝2.3的H5流感病毒的中和效價(jià)高的Mab C、F以及H，得到解決。這些Mab在IFA、ELISA、HI以及病毒中和中與進(jìn)化枝2.3的H5流感病毒有效反應(yīng)。鑒于它們有效中和進(jìn)化枝2.3和幾個其他進(jìn)化枝的H5流感病毒，本發(fā)明的Mab能夠構(gòu)成通用的治療性單克隆抗體對的一部分，所述通用治療性單克隆抗體對提供的保護(hù)比目前通用的治療性Mab對更好。另外，本發(fā)明的Mab靶向進(jìn)化枝2.3的H5病毒上的新的中和表位。如本文所示，Mab C、F以及H都顯示出比Mab 2D9更高的對進(jìn)化枝2.3的H5N1流感病毒反應(yīng)性，且Mab C、F以及H各自對進(jìn)化枝2.3的H5N1流感病毒的反應(yīng)性都顯示比對其他進(jìn)化枝的病毒的反應(yīng)性更高。鑒于MabC、F以及H的這些特征，這三種Mab的主要用途都是與2D9形成互補(bǔ)性Mab對，用于通用性檢測或治療。
[0048]在第一方面，本發(fā)明提供對H5流感血凝素的主要中和表位具有特異性的單克隆抗體和其活性片段即抗原結(jié)合片段(在本文中也稱為抗體片段)。在一些實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或其片段與H5血凝素(HA)的構(gòu)象表位特異性結(jié)合，其中所述構(gòu)象表位包含成熟HA蛋白的氨基酸152Lys、184Ala以及190Pro。在另一實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或其片段與H5血凝素的構(gòu)象表位特異性結(jié)合，所述構(gòu)象表位與鼠單克隆抗體C特異性結(jié)合。在另外的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體C。在另一實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是屬雜交瘤C產(chǎn)生的鼠單克隆抗體C。鼠雜交瘤C于2011年11月16日根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于 CellBank Australia, 214Hawkesbury Road, Westmead NSW 2145，Australia,保藏號為CBA20110011。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生鼠單克隆抗體C的鼠雜交瘤。在另一實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是嵌合或人源化單克隆抗體。特別是，所述嵌合或人源化單克隆抗體與H5血凝素的構(gòu)象表位特異性結(jié)合，所述構(gòu)象表位與鼠單克隆抗體C特異性結(jié)合。在一實(shí)施方案中，單克隆抗體(鼠單克隆抗體或嵌合或人源化單克隆抗體)或其片段與H5血凝素(HA)的構(gòu)象表位特異性結(jié)合，其中所述構(gòu)象表位包含成熟HA蛋白的氨基酸152Lys、184Ala以及190Proo
[0049]在其他實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或其片段與H5血凝素(HA)的構(gòu)象表位特異性結(jié)合，其中所述構(gòu)象表位包含成熟HA蛋白的氨基酸152Lys和221Gly。在另一實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或其片段與H5血凝素的構(gòu)象表位特異性結(jié)合，所述構(gòu)象表位與鼠單克隆抗體F特異性結(jié)合。在另外的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體F。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠雜交瘤F產(chǎn)生的鼠單克隆抗體F。鼠雜交瘤F于2011年11 月 16 日根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于 CellBank Australia, 214Hawkesbury Road, WestmeadNSW 2145，Australia，保藏號為CBA20110012。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生鼠單克隆抗體F的鼠雜交瘤。在另一實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是嵌合或人源化單克隆抗體。特別是，所述嵌合或人源化單克隆抗體與H5血凝素的構(gòu)象表位特異性結(jié)合，所述構(gòu)象表位與鼠單克隆抗體F特異性結(jié)合。在一實(shí)施方案中，所述單克隆抗體(鼠單克隆抗體或嵌合或人源化單克隆抗體)或其片段與H5血凝素(HA)的構(gòu)象表位特異性結(jié)合，其中所述構(gòu)象表位包含成熟HA蛋白的氨基酸152Lys和221Gly。
[0050]在另外的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或其片段與H5血凝素(HA)的構(gòu)象表位特異性結(jié)合，其中所述構(gòu)象表位包含成熟HA蛋白的氨基酸141Ρι.ο和152Lys。在另一實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或其片段與H5血凝素的構(gòu)象表位特異性結(jié)合，所述構(gòu)象表位與鼠單克隆抗體H特異性結(jié)合。在另外的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體H。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠雜交瘤H產(chǎn)生的鼠單克隆抗體H。鼠雜交瘤H于2011年11 月 16 日根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于 CellBank Australia, 214Hawkesbury Road, WestmeadNSW 2145，Australia，保藏號為CBA20110013。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生鼠單克隆抗體H的鼠雜交瘤。在另一實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是嵌合或人源化單克隆抗體。特別是，所述嵌合或人源化單克隆抗體與H5血凝素的構(gòu)象表位特異性結(jié)合，所述構(gòu)象表位與鼠單克隆抗體H特異性結(jié)合。在一實(shí)施方案中，所述單克隆抗體(鼠單克隆抗體或嵌合或人源化單克隆抗體)或其片段與H5血凝素(HA)的構(gòu)象表位特異性結(jié)合，其中所述構(gòu)象表位包含成熟HA蛋白的氨基酸141Pro和152Lys。
[0051]在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼本文所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段的核酸。在一實(shí)施方案中，所述核酸編碼鼠單克隆抗體C或其抗原結(jié)合片段。在另一實(shí)施方案中，所述核酸編碼鼠單克隆抗體F或其抗原結(jié)合片段。在另外的實(shí)施方案中，所述核酸編碼鼠單克隆抗體H或其抗原結(jié)合片段。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含所述核酸的載體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含和表達(dá)所述載體的細(xì)胞。
[0052]在一實(shí)施方案中，使用本文所述的技術(shù)以及本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，通過將人重鏈和輕鏈恒定區(qū)與小鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)組合，制備人源化抗體。在另一實(shí)施方案中，制備人源化抗體，其中合成編碼人源化\和Vh序列的DNA序列，所述人源化\和Vh序列含有本文所述的鼠單克隆抗體的小鼠輕鏈和重鏈輕鏈可變區(qū)的CDR。在一實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是單克隆抗體C。在另一實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是單克隆抗體F。在另外的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是單克隆抗體H。
[0053]合成編碼序列已知的蛋白質(zhì)的DNA方法是本領(lǐng)域熟知的。使用這類方法，合成編碼本發(fā)明的人源化抗體的DNA序列，然后在適合表達(dá)重組抗體的載體系統(tǒng)中表達(dá)。這可以在為本發(fā)明的人源化抗體序列準(zhǔn)備的任何載體系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)，例如表達(dá)融合蛋白，其包含人恒定結(jié)構(gòu)域序列和小鼠可變結(jié)構(gòu)域序列，上述序列相關(guān)聯(lián)而產(chǎn)生功能性(抗原結(jié)合)抗體的。
[0054]適合表達(dá)重組抗體，特別是人源化抗體的表達(dá)載體、宿主細(xì)胞，以及適合表達(dá)這類抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的。參見，例如，美國專利第7，074，406號。
[0055]作為實(shí)例，已知能表達(dá)功能性免疫球蛋白的宿主細(xì)胞尤其包括哺乳動物細(xì)胞如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、COS細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞，細(xì)菌如大腸桿菌(Escherichia coli)，酵母細(xì)胞如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在這些宿主細(xì)胞中，眾多研究人員使用CHO細(xì)胞，其能有效地表達(dá)和分泌免疫球蛋白。
[0056]基本上，重組表達(dá)人源化抗體是通過兩種通用方法中的一種實(shí)現(xiàn)的。在第一種方法中，用單個載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，所述載體是為表達(dá)與選定的恒定區(qū)融合的重鏈可變區(qū)序列和輕鏈可變區(qū)序列而準(zhǔn)備的。在第二種方法中，用兩個載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，所述兩個載體分別表達(dá)與選定的恒定區(qū)融合的可變重鏈序列或可變輕鏈序列。
[0057]在第二方面，本發(fā)明提供使用本文所述的鼠單克隆抗體或其片段預(yù)防和治療H5N1流感的方法和組合物。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含本文所述的單克隆抗體和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或運(yùn)載體的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體C。在其他實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體F。在另外的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體H。在另一實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含本文所述的單克隆抗體的抗原結(jié)合片段和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或運(yùn)載體。在一些實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合片段是鼠單克隆抗體C的抗原結(jié)合片段。在其他實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合片段是鼠單克隆抗體F的抗原結(jié)合片段。在另外的實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合片段是單克隆抗體H的抗原結(jié)合片段。在另外的實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含編碼所述抗體或抗體片段的核酸分子和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或運(yùn)載體。在另一實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含載體和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或運(yùn)載體，所述載體包含所述核酸。在另一實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含表達(dá)所述載體的細(xì)胞和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或運(yùn)載體。在另外的實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含編碼所述抗體或抗體片段的核酸分子和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或運(yùn)載體。在另一實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含載體和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或運(yùn)載體，所述載體含有所述核酸。在另一實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含表達(dá)所述載體的細(xì)胞和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或運(yùn)載體。
[0058]在一實(shí)施方案中，本發(fā)提供減少個體的H5N1流感病毒感染，或降低個體中H5N1流感病毒感染風(fēng)險(xiǎn)，抑制個體被進(jìn)化枝2.3的一種或多種H5N1病毒毒株或分離株感染，或預(yù)防進(jìn)化枝2.3的一種或多種H5N1流感病毒毒株或分離株的流感感染或疾病的方法。在該實(shí)施方案中，所述方法包括，給有需要的個體施用治療有效量的本文所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，包含編碼所述抗體或抗體片段的多核苷酸的核酸分子，包含所述多核苷酸的載體，或表達(dá)所述載體的細(xì)胞。在一實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體C。在另一實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體F。在另外的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體H。在一實(shí)施方案中，所述個體是免疫功能不全的，是嬰兒，是幼兒或是老年人。在另一實(shí)施方案中，施用提供治療效果。在另外的實(shí)施方案中，治療效果包括抑制流感病毒效價(jià)的增加，降低流感病毒效價(jià)，抑制流感病毒復(fù)制的增加，降低流感病毒復(fù)制，抑制流感病毒增殖的增加或降低流感病毒增殖，或降低個體中與流感病毒感染相關(guān)的一種或多種癥狀或并發(fā)癥的進(jìn)展、嚴(yán)重性、頻率、持續(xù)時(shí)間或概率。在一實(shí)施方案中，癥狀或并發(fā)癥選自發(fā)冷、發(fā)燒、咳嗽、咽喉痛、鼻塞、鼻竇阻塞、鼻感染、鼻竇感染、身體疼痛、頭疼、疲勞、肺炎、支氣管炎、耳部感染、耳疼和死亡。在另一實(shí)施方案中，所述治療效果包括加速個體由H5N1流感病毒感染康復(fù)。在另外的實(shí)施方案中，給所述個體施用的藥劑在個體感染H5N1流感病毒之前，基本上同時(shí)或之后施用。
[0059]可以使用已知的技術(shù)將本發(fā)明的抗體制成生理可接受的劑型，并且可以包含藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體、稀釋劑和/或賦形劑。例如，將本發(fā)明的和本文所述的抗體，包括其任何功能等同抗體或功能性部分，與藥學(xué)上可接收的載體、稀釋劑和/或賦形劑組合，形成治療組合物。合適的藥學(xué)運(yùn)載體、稀釋劑和/或賦形劑是本領(lǐng)域熟知的，包括，例如，磷酸緩沖鹽溶液、水、乳液如油/水乳液、各種類型的濕潤劑、無菌溶液等。
[0060]本發(fā)明藥物組合物的配制可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法完成。參見，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Ed.D.B.Troy, Lippincott, ffilliams&ffilkins, Baltimore, 2006,通過引用并入本文。
[0061]可以以固體、液體或氣霧劑的形式，以藥學(xué)有效劑量，給個體施用本發(fā)明的組合物。固體組合物的實(shí)例包括丸劑、霜劑以及可植入的劑量單位。丸劑可以口服施用。治療性霜劑可以局部施用?？芍踩氲膭┝繂挝豢梢跃植渴┯?，例如，在腫瘤位點(diǎn)，或可以植入(例如，皮下)，用于系統(tǒng)釋放所述治療性組合物。液體組合物的實(shí)例包括適于肌肉內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)注射的劑型和用于局部和眼內(nèi)給藥的劑型。氣霧劑的實(shí)例包括向肺給藥的吸入劑型。
[0062]所述組合物可以通過標(biāo)準(zhǔn)給藥途徑施用。通常，可以通過局部、口服、直腸、鼻、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)或胃腸外(例如，靜脈內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi))途徑施用所述組合物。此外，可以將所述組合物并入緩釋基質(zhì)如生物可降解多聚體中，將所述多聚體植入想要遞送的位點(diǎn)附近，例如，腫瘤位點(diǎn)。所述方法包括單劑量施用、以預(yù)定時(shí)間間隔重復(fù)劑量施用以及預(yù)定時(shí)段緩釋施用。本文所用的緩釋基質(zhì)是由可通過酶水解和酸/堿水解而降解的材料制成的基質(zhì)，所述材料通常是多聚體。插入體內(nèi)之后，酶和體液作用于基質(zhì)。理想地，緩釋基質(zhì)選自生物相容性材料，如脂質(zhì)體、聚乳酸(聚乳酸)、聚乙交酯(羥基乙酸多聚體)、聚乳酸共羥基乙酸(乳酸和羥基乙酸的共聚物)、聚酸酐、聚原酸酯、多肽、透明質(zhì)酸、膠原蛋白、硫酸軟骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸)、多核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。優(yōu)選的生物可降解基質(zhì)是下述基質(zhì)之一:聚交酯、聚乙交酯或聚乳酸共羥基乙酸(乳酸和羥基乙酸的共聚物)。
[0063]所述組合物可以與其他組合物聯(lián)合施用，所述其他組合物包含生物學(xué)活性物質(zhì)或化合物以及本發(fā)明的抗體，和任選地，藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體和/或稀釋劑和/或賦形劑以及疾病治療程序，特別地，所述生物學(xué)活性物質(zhì)或化合物是至少一種選自下列化合物的化合物:抗氧化壓力化合物、抗凋亡化合物、金屬螯合劑、DNA修復(fù)抑制劑如哌侖西平和代謝物、3-氨基-1-丙磺酸(3APS)、I, 3-丙烷基二磺酸(I, 3PDS)、α -分泌酶激活劑、β -和Y-分泌酶抑制劑、τ蛋白、神經(jīng)遞質(zhì)、β -片層打碎劑(β-sheet breaker)、β淀粉樣蛋白清除/消耗細(xì)胞組分的引誘劑、N末端截短的β淀粉樣蛋白(包括焦谷氨酸化的β淀粉樣蛋白3-42)抑制劑、抗炎分子、“非典型抗精神病藥物”(例如氯氮平、齊拉西酮、利培酮、阿立哌唑或奧氮平或膽堿酯酶抑制劑(ChEIs)如他克林、卡巴拉汀、多奈哌齊和/或加蘭他敏)、Ml激動劑和包括任何淀粉樣蛋白或τ修飾藥物的其他藥物，以及營養(yǎng)補(bǔ)充劑(如維生素Β12、半胱氨酸、乙酰膽堿前體、卵磷脂、膽堿、銀杏、乙?；?L-肉堿、艾地苯醌、丙戊茶堿或黃嘌呤衍生物)。
[0064]藥學(xué)上有活性的蛋白質(zhì)物質(zhì)可以以每劑Ing至1mg的量存在。通常，給藥方案的范圍為0.1 μ g至1mg本發(fā)明的抗體,特別是1.0 μ g至1.0mg，更特別是1.0 μ g至100 μ g,落入這些范圍內(nèi)的所有數(shù)值也是本發(fā)明的一部分。如果通過連續(xù)輸注進(jìn)行施用，則更適當(dāng)?shù)膭┝糠秶鸀?.01 μ g至1mg/公斤體重/小時(shí)，落入這些范圍內(nèi)的所有數(shù)值也是本發(fā)明的一部分。
[0065]通常進(jìn)行胃腸外施用，例如靜脈內(nèi)施用。用于胃腸外施用的制劑包括無菌水溶液或非水性溶液、懸浮劑以及乳劑。非水性溶劑包括但不限于丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，以及可注射的有機(jī)酯如油酸乙酯。水性溶劑可以選自水、醇/水溶液、乳劑或懸浮劑，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。胃腸外運(yùn)載媒介包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏液或不揮發(fā)性油。靜脈內(nèi)運(yùn)載媒介包括液體和營養(yǎng)補(bǔ)充物、電解質(zhì)補(bǔ)充物(如基于林格氏葡萄糖的那些電解質(zhì)補(bǔ)充物)及其他。也可以存在防腐劑，如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等。
[0066]所述藥物組合物可以進(jìn)一步包含蛋白質(zhì)運(yùn)載體,如血清白蛋白或免疫球蛋白，特別是人源的。在本發(fā)明的藥物組合物中，可以存在其他生物學(xué)活性劑，這取決于預(yù)期用途。
[0067]在一實(shí)施方案中，用于預(yù)防和治療H5N1流感的方法和組合物將本文所述的鼠單克隆抗體或其片段與至少一種互補(bǔ)性單克隆抗體或其抗體片段組合使用。根據(jù)這一實(shí)施方案，互補(bǔ)性Mab的使用增加了針對H5N1流感傳播毒株的保護(hù)并防止逃逸突變。在一些實(shí)施方案中，所述方法和組合物將本文所述的第一鼠單克隆抗體或其活性片段與第二互補(bǔ)性鼠單克隆抗體或其活性片段組合使用。在一實(shí)施方案中，所述第一鼠單克隆抗體是單克隆抗體C。在另一實(shí)施方案中，所述第一鼠單克隆抗體是單克隆抗體F。在另外的實(shí)施方案中，所述第一鼠單克隆抗體是單克隆抗體H。在一實(shí)施方案中，所述第二互補(bǔ)性鼠單克隆抗體是單克隆抗體2D9。單克隆抗體2D9在Prabakaran et al.(2009)或PCT國際公開申請第WO 2009/035420號中進(jìn)行了描述。在一實(shí)施方案中，所述單克隆抗體2D9由鼠雜交瘤2D9產(chǎn)生。鼠雜交瘤2D9于2007年7月10日根據(jù)布達(dá)佩斯條件保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，10801University Blvd., Manassas, VA 20110，USA，指定的登錄號為 PTA-9396。本文描述了關(guān)于使用除了用于所述方法和組合物中的互補(bǔ)性單克隆抗體或其片段之外的單一單克隆抗體或其片段的組合物和方法。
[0068]在第三方面，本發(fā)明提供使用本文上所述的單克隆抗體或其片段表征和/或定量H5表達(dá)的方法和組合物。在一些實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體C。在其他實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體F。在另外的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體H。在一實(shí)施方案中，H5表達(dá)涉及H5N1流感病毒的HA表達(dá)。在一實(shí)施方案中，所述組合物包含本文所述的單克隆抗體或其片段。在一些實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體C。在其他實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體F。在另外的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體H。在另一實(shí)施方案中，所述方法包括檢測H5與本文所述的單克隆抗體或其片段的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體C。在其他實(shí)施方案中，所述單克隆抗體鼠單克隆抗體F。在另外的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體H。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及免疫熒光測定(IFA)、免疫組織化學(xué)測定以及利用這類結(jié)合蛋白的其他方法，包括ELISA、血細(xì)胞凝集抑制(HI)測定和病毒中和(VN)測定。
[0069]在第四方面，本發(fā)明提供用于檢測生物學(xué)標(biāo)本中甲型流感病毒的試劑盒和方法。在一實(shí)施方案中，所述檢測涉及H5N1流感病毒的檢測。在另一實(shí)施方案中，所述檢測涉及進(jìn)化枝2家族H5N1流感病毒的檢測。在另一實(shí)施方案中，所述檢測涉及進(jìn)化枝2.3的H5N1流感病毒檢測。在一實(shí)施方案中，所述方法包括使所述標(biāo)本與第一抗體接觸，所述第一抗體是本文所述的單克隆抗體或其抗體片段。在一些實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體C。在其他實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體F。在另外的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體H。在另一實(shí)施方案中，所述方法還包括使所述標(biāo)本與第二抗體接觸，所述第二抗體與甲型流感病毒的H5血凝素的表位特異性結(jié)合，其中所述第二抗體含有可檢測元件或與之綴合。在一些實(shí)施方案中，所述第二抗體含有放射性原子，與熒光分子綴合，或與酶綴合。在其他實(shí)施方案中，將所述第一抗體固定化于固相表面。
[0070]在一實(shí)施方案中，所述試劑盒包含第一抗體，其是本文所述的單克隆抗體或其抗體片段，以及用于進(jìn)行試驗(yàn)來檢測甲型流感病毒的說明書。在一實(shí)施方案中，所述試劑盒涉及H5N1流感病毒的檢測。在另一實(shí)施方案中，所述試劑盒涉及進(jìn)化枝2家族H5N1流感病毒的檢測。在另一實(shí)施方案中，所述試劑盒涉及進(jìn)化枝2.3的H5N1流感病毒的檢測。在一些實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體C。在其他實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體F。在另外的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體H。在另一實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含與甲型流感病毒H5血凝素的表位特異性結(jié)合的第二抗體，其中所述第二抗體含有可檢測元件或與之綴合。在一些實(shí)施方案中，所述第二抗體含有放射性原子，與熒光分子綴合，或與酶綴合。在其他實(shí)施方案中，將所述第一抗體固定化于固相表面。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒涉及免疫熒光測定(IFA)、免疫組織化學(xué)測定以及其利用此類結(jié)合蛋白的其他方法，包括ELISA、血細(xì)胞凝集抑制(HI)測定以及病毒中和(VN)測定。所有這些測定是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
[0071]在一些實(shí)施方案中，所述方法和試劑盒將本文所述的第一鼠單克隆抗體或其活性片段與第二互補(bǔ)性鼠單克隆抗體或其活性片段組合使用。在一實(shí)施方案中，所述第一鼠單克隆抗體是單克隆抗體C。在另一實(shí)施方案中，所述第一鼠單克隆抗體是單克隆抗體F。在另外的實(shí)施方案中，所述第一鼠單克隆抗體是單克隆抗體H。在一實(shí)施方案中，所述第二互補(bǔ)性鼠單克隆抗體是單克隆抗體2D9。本文描述了關(guān)于使用除了用于所述方法和試劑盒中的互補(bǔ)性單克隆抗體或其片段之外的單一單克隆抗體或其片段的試劑盒和方法。除非另外說明，本發(fā)明的實(shí)施使用化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)基因生物學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)都在本領(lǐng)域的技能范圍內(nèi)。參見，例如，Maniatis et al., 1982, MolecularCloning(Cold Spring H arbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,New York)；Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning, 2nd Ed.(Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, New York) ；Sambrook and Russell, 2001, MolecularCloning, 3rd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork) ；Ausubel et al., 1992, Current Protocols in Molecular B1logy (Johnffiley&Sons,包括定期更新)；Glover, 1985，DNA Cloning(IRL Press, Oxford)；Russell,1984,Molecular b1logy of plants:a laboratory course manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) ；Anand, Techniquesfor the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992) ；Guthrieand Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular B1logy(Academic Press,NewYork,1991) ；Harlow and Lane, 1988, Antibodies, (Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, New York) ；Nucleic Acid Hybridizat1n(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984) !Transcript1n And Translat1n(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984) ；Culture Of Animal Cells (R.1.Freshney, Alan R.Liss, Inc., 1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986) ；B.Perbal, A Practical Guide ToMolecular Cloning (1984)；專著:Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.) ；Methods In EnzymologyjVols.154and 155(Wu et al.eds.), ImmunochemicalMethods In Cell And Molecular B1logy(Mayer and Walker, eds., AcademicPress,London, 1987) ；Handbook Of Experimental Immunology, Volumes 1-1V(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds., 1986) ；R1tt, Essential Immunology,6thEdit1n,Blackwell Scientific Publicat1ns, Oxford, 1988 ；Fire et al.，RNAInterference Technology:From Basic Science to Drug Development, CambridgeUniversity Press，Cambridge，2005 ;Schepers，RNA Interference in Practice, Wiley -VCHj 2005 ；Engelke, RNA Interference (RNAi): The Nuts&Bolts of siRNA Technology, DNAPress,2003 ;Gott，RNA Interference,Editing,and Modificat1n: Methods andProtocols(Methods in Molecular B1logy), Human Press, Totowaj NJj 2004 ；Sohail, GeneSilencing by RNA Interference:Technology and Applicat1n，CRC，2004。
實(shí)施例
[0072]參考下述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行描述，所述實(shí)施例用于說明而非以任何方式限制本發(fā)明。使用了本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或下文具體描述的技術(shù)。
[0073]實(shí)施例1:材料和方法
[0074]病毒和細(xì)胞:本研究所用的H5N1病毒來自下文表1所示的不同進(jìn)化枝。除了印度尼西亞毒株外，其余的H5流感病毒感染按之前所描述的(Ho et al.，2009)，在本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)以反向遺傳學(xué)產(chǎn)生。將病毒接種到11日齡含胚雞蛋的尿囊腔中，并在37°C溫育48h后進(jìn)行收獲。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Abdel-Ghafar et al.，2008),使用血細(xì)胞凝集試驗(yàn)測定病毒效價(jià)。按之前所描述的(He et al.，2007)，用甲醛滅活H5N1亞型病毒。所有用活H5N1亞型病毒的實(shí)驗(yàn)按照⑶C/NIH和 WHO建議在生物安全3級防護(hù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，并且還獲得了新加坡農(nóng)糧獸醫(yī)局和衛(wèi)生部(Agr1-Food and Veterinary Authority and the Ministry of Healthof Singapore)的許可。
[0075]MDCK細(xì)胞從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得。將所有細(xì)胞在補(bǔ)充了 10%胎牛血清的達(dá)爾伯克氏基本成分培養(yǎng)基(DMEM)中繁殖。使病毒原種(virus stock)在補(bǔ)充了 0.5%胎牛血清白蛋白(BSA)和200ng/ml胰蛋白酶的DMEM中的細(xì)胞內(nèi)生長。
[0076]MAb產(chǎn)生:用來自A/安徽/1/05的滅活的全病毒，以在0.1ml磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中28的HA效價(jià)，按2周的有規(guī)律間隔，皮下免疫BALB/c小鼠兩次，所述磷酸緩沖鹽溶液用等體積的Montanide ISA 563佐劑(SEPPIC，F(xiàn)rance)進(jìn)行了乳化。在脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合前3天，用相同的病毒抗原對小鼠加強(qiáng)接種。將融合細(xì)胞接種于96孔板，如下文所述通過免疫熒光測定篩選它們的上清液。通過至少三次限制性稀釋克隆產(chǎn)生Mab的雜交瘤。如下文所述，測試陽性Mab的血細(xì)胞凝集抑制活性。如制造商方案所述使用商業(yè)化的同種型分型試劑盒(Amersham B1science, England),對來自所選的陽性mAb的免疫球蛋白進(jìn)行同種型分型。
[0077]免疫熒光測定(IFA):用AIV H5N1毒株感染培養(yǎng)于96孔板中的MDC K細(xì)胞。感染后24-48h，在室溫將所述細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30min (分鐘)，并用pH 7.4的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)漂洗三次。將固定的細(xì)胞與雜交瘤培養(yǎng)物上清液在37°C溫育lh，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)漂洗，然后與1:400稀釋的與異硫氰酸熒光素(FITC)-綴合的兔抗小鼠免疫球蛋白(Dako，Denmark)溫育。再次用PBS漂洗細(xì)胞，并通過寬視野差向熒光顯微鏡(Olympus 1X71)評估抗體結(jié)合。
[0078]血細(xì)胞凝集抑制測定:如之前所描述的(Webster et al.，1991)，進(jìn)行血細(xì)胞凝集抑制(HI)測定。簡而言之，將Mab在V型底的96孔板中連續(xù)稀釋(2倍)并與4HA單位H5N1病毒進(jìn)行混合。將96孔板在室溫溫育30min，并向每個孔中加入I %雞RBC。血細(xì)胞凝集抑制終點(diǎn)是其中未觀察到凝集的最高的Mab稀釋度。
[0079]微中和測定:通過之前所描述的微中和測定(Prabakaran et al.，2008),分析單克隆抗體針對H5N1毒株的中和活性。簡而言之，將10倍稀釋的Mab進(jìn)一步連續(xù)稀釋(2倍)，并與10050%組織培養(yǎng)物感染劑量(TCID50)的不同進(jìn)化枝的H5N1毒株一起室溫溫育Ih,并一式兩份置于生長在96孔板中的MDCK細(xì)胞上。各H5N1毒株在MDCK細(xì)胞培養(yǎng)物中的TCID50,通過Reed和Muench方法測定(Reed and Muench method)。中和效價(jià)被按照其中通過光學(xué)顯微鏡沒有觀察到細(xì)胞病變效果的最高M(jìn)ab稀釋度進(jìn)行評估的。
[0080]逃逸突變體的分離和分析:按之前所描述的(Kaverin et al.，2007),通過表征逃逸突變體，對Mab識別的表位進(jìn)行作圖。簡而言之，將H5N1病毒與過量Mab溫育lh，然后接種到11日齡含胚雞蛋中。將所述蛋于37°C溫育24-48h。收獲病毒，用于在含胚雞蛋內(nèi)的限制性稀釋液中進(jìn)行克隆，并對逃逸突變體進(jìn)行斑塊純化。從尿囊液中提取RNA。對血凝素基因進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄酶(RT)-PCR擴(kuò)增，并將其克隆到TA克隆載體(Promega)中，對幾個克隆進(jìn)行測序。通過與親本病毒的序列進(jìn)行比較，分析單個克隆的序列。
[0081]實(shí)施例2:鼠單克隆抗體C、F和H的表征
[0082]由用A/Anhui/1/05H5N1病毒免疫的小鼠產(chǎn)生Mab C、F和H。Mab C和H經(jīng)鑒定屬于同種型IgG2a，而Mab F則屬于IgG3。除了在安徽感染的MDCK細(xì)胞的IFA中的陽性活性之外，所有這三種Mab還都表現(xiàn)出針對H5N1毒株A/Anhui/1/05 H5N1 (安徽)的中和活性(圖1)，這表明它們都識別H5的中和表位。
[0083]實(shí)施例3:Mab C、F或H與Mab 2D9進(jìn)行互補(bǔ)性中和
[0084]用Mab C、F和H針對一系列來自不同主要進(jìn)化枝的H5N1病毒進(jìn)行HI和微中和測試。如表1和表2所示，Mab C、F以及H能有效中和進(jìn)化枝2.3的H5N1病毒。此外，這三種Mab能與進(jìn)化枝2.2的一些H5N1病毒反應(yīng)。Mab C能中和比Mab F和H更多的本研究所用的來自進(jìn)化枝2.2的病毒。它們當(dāng)中沒有一個能與進(jìn)化枝O和1.0的病毒反應(yīng)。如之前所示，Mab 2D9能中和不同進(jìn)化枝的不同H5N1病毒，但是不能有效抑制進(jìn)化枝2.3的病毒。據(jù)證明，Mab 2D9與Mab C的Mab混合物能中和本研究所用的所有主要進(jìn)化枝的病毒。發(fā)現(xiàn)2D9+C的中和效價(jià)比Mab 2D9與Mab 4C2的更好。
[0085]表1:Maba’b的血細(xì)胞凝集抑制效價(jià)
[0086]

【權(quán)利要求】
1.單克隆抗體或抗體片段，其與H5血凝素構(gòu)象表位特異性結(jié)合，其中所述構(gòu)象表位選自: (a)包含成熟HA蛋白的氨基酸152Lys、184Ala和190Pro的構(gòu)象表位； (b)包含成熟HA蛋白的氨基酸152Lys和221Gly的構(gòu)象表位；以及 (c)包含成熟HA蛋白的氨基酸141Pro和152Lys的構(gòu)象表位。
2.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或抗體片段，其中所述H5血凝素的構(gòu)象表位選自: (i)鼠單克隆抗體C所特異性結(jié)合的(a)中所述的構(gòu)象表位； (?)鼠單克隆抗體F所特異性結(jié)合的(b)中所述的構(gòu)象表位；以及 (iii)鼠單克隆抗體H所特異性結(jié)合的(c)中所述的構(gòu)象表位。
3.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或抗體片段，其中所述單克隆抗體選自: (1)鼠單克隆抗體C; (2)鼠單克隆抗體F;以及 (3)鼠單克隆抗體H。
4.單克隆抗體，其選自: (a)雜交瘤C產(chǎn)生的單克隆抗體C,所述雜交瘤C保藏于CellBankAustralia,保藏號為 CBA20110011 ； (b)雜交瘤F產(chǎn)生的單克隆抗體F,所述雜交瘤F保藏于CellBankAustralia,保藏號為 CBA20110012 ； (c)雜交瘤H產(chǎn)生的單克隆抗體H,所述雜交瘤H保藏于CellBankAustralia,保藏號為 CBA20110013。
5.檢測生物學(xué)標(biāo)本中甲型流感病毒的方法，其包括使所述標(biāo)本與第一抗體接觸，其中所述第一抗體是權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的單克隆抗體或抗體片段。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其進(jìn)一步包括使所述標(biāo)本與第二抗體接觸，所述第二抗體與甲型流感病毒H5血凝素表位特異性結(jié)合，其中所述第二抗體含有可檢測元件或與其三雙口 ο
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述第一抗體固定化于固相表面。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述第二抗體含有放射性原子，與熒光分子綴合，或與酶綴合。
9.如權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述甲型流感病毒是H5N1流感病毒。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述H5N1流感病毒是進(jìn)化枝2家族的H5N1流感病毒。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述H5N1流感病毒是進(jìn)化枝2.3的H5N1流感病毒。
12.如權(quán)利要求5-11中任一項(xiàng)所述的方法，其中將互補(bǔ)性單克隆抗體與所述第一抗體組合使用。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述互補(bǔ)性單克隆抗體是單克隆抗體2D9。
14.檢測生物學(xué)標(biāo)本中甲型流感病毒的試劑盒，其包含第一抗體以及進(jìn)行檢測所述甲型流感病毒的測定的說明書，其中所述第一抗體是權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的單克隆抗體或抗體片段。
15.如權(quán)利要求14所述的試劑盒，其還包含與甲型流感病毒H5血凝素表位特異性結(jié)合的第二抗體，其中所述第二抗體含有可檢測元件或與之綴合。
16.如權(quán)利要求14或15所述的試劑盒，其中所述甲型流感病毒是H5N1流感病毒。
17.如權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中所述H5N1流感病毒是進(jìn)化枝2家族的H5N1流感病毒。
18.如權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中所述H5N1流感病毒是進(jìn)化枝2.3的H5N1流感病毒。
19.如權(quán)利要求14-18中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中將互補(bǔ)性單克隆抗體與所述第一抗體組合使用。
20.如權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中所述互補(bǔ)性單克隆抗體是單克隆抗體2D9。
21.包含藥劑和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或運(yùn)載體的組合物，其中所述藥劑是權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或抗體片段。
22.包含藥劑和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或運(yùn)載體的組合物，其中所述藥劑是權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或抗體片段與至少一種互補(bǔ)性單克隆抗體或其片段的組合。
23.如權(quán)利要求22所述的組合物，其中所述互補(bǔ)性單克隆抗體是鼠單克隆抗體2D9。
24.減少個體的H5N1流感病毒感染，或降低個體的H5N1流感病毒感染風(fēng)險(xiǎn)，或抑制個體被一種或多種H5N1流感病毒毒株或分離株感染，或預(yù)防一種或多種H5N1流感病毒毒株或分離株的流感感染或疾病的方法，其包括給有需要的個體施用治療有效量的藥劑，其中所述藥劑是權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或抗體片段。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述個體是免疫功能不全的，是嬰兒，是幼兒或是老年人。
26.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述施用提供治療效果。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述治療效果包括(a)抑制流感病毒效價(jià)的增加，(b)降低流感病毒效價(jià)，(C)抑制流感病毒復(fù)制的增加，(d)降低流感病毒復(fù)制，(e)抑制流感病毒增殖的增加或降低流感病毒增殖，(f)降低個體中與流感病毒感染相關(guān)的一種或多種癥狀或并發(fā)癥的進(jìn)展、嚴(yán)重性、頻率、持續(xù)時(shí)間或概率，或(g)加速個體由流感病毒感染康復(fù)。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中癥狀或并發(fā)癥選自發(fā)冷、發(fā)燒、咳嗽、咽喉痛、鼻塞、鼻竇阻塞、鼻感染、鼻竇感染、身體疼痛、頭疼、疲勞、肺炎、支氣管炎、耳部感染、耳疼和死亡。
29.如權(quán)利要求24-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述甲型流感病毒是進(jìn)化枝2.3的H5N1亞型。
30.減少個體的H5N1流感病毒感染，或降低個體的H5N1流感病毒感染風(fēng)險(xiǎn)，或抑制個體被一種或多種H5N1流感病毒毒株或分離株感染，或預(yù)防一種或多種H5N1流感病毒毒株或分離株的流感感染或疾病的方法，其包括給有需要的個體施用治療有效量的藥劑，其中所述藥劑是權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或抗體片段與至少一種互補(bǔ)性單克隆抗體或抗體片段的組合。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述互補(bǔ)性單克隆抗體是鼠單克隆抗體2D9。
32.如權(quán)利要求30或31所述的方法，其中所述個體是免疫功能不全的，是嬰兒，是幼兒或是老年人。
33.如權(quán)利要求30或31所述的方法，其中所述施用提供治療效果。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述治療效果包括(a)抑制流感病毒效價(jià)的增加，(b)降低流感病毒效價(jià)，(c)抑制流感病毒復(fù)制的增加，(d)降低流感病毒復(fù)制，(e)抑制流感病毒增殖的增加或降低流感病毒增殖，(f)降低個體中與流感病毒感染相關(guān)的一種或多種癥狀或并發(fā)癥的進(jìn)展、嚴(yán)重性、頻率、持續(xù)時(shí)間或概率，或(g)加速個體由流感病毒感染康復(fù)。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中癥狀或并發(fā)癥選自發(fā)冷、發(fā)燒、咳嗽、咽喉痛、鼻塞、鼻竇阻塞、鼻感染、鼻竇感染、身體疼痛、頭疼、疲勞、肺炎、支氣管炎、耳部感染、耳疼和死亡。
36.表征和/或定量樣品中H5表達(dá)的方法,所述方法包括使所述樣品與第一抗體接觸，所述第一抗體是權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或抗體片段。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其 進(jìn)一步包括使所述樣品與第二抗體接觸，所述第二抗體與甲型流感病毒H5血凝素表位特異性結(jié)合，其中所述第二抗體含有可檢測元件或與其綴合。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述第一抗體固定化于固相表面。
39.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述第二抗體含有放射性原子，與熒光分子綴合，或與酶綴合。
40.表征和/或定量樣品中H5表達(dá)的試劑盒，其包含第一抗體以及進(jìn)行表征和/或定量所述樣品中H5表達(dá)的測定的說明書，其中所述第一抗體是權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或抗體片段。
41.如權(quán)利要求40所述的試劑盒，其進(jìn)一步包含與甲型流感病毒H5血凝素表位特異性結(jié)合的第二抗體，其中所述第二抗體含有可檢測標(biāo)記或與之綴合。
【文檔編號】G01N33/577GK104169297SQ201280071324
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2012年1月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月12日
【發(fā)明者】F·和, H-S·J·光 申請人:淡馬錫生命科學(xué)研究院有限公司