一種檢測多巴胺的電極的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測多巴胺（DA）的電極的制備方法。該制備電極的方法包括如下步驟：將還原氧化石墨烯（rGO）懸浮液滴涂到絲網(wǎng)印刷電極（SPE）表面得到SPE/rGO，再通過循環(huán)伏安法將β-環(huán)糊精（β-CD）和葡萄糖氧化酶（GOx）混合液電沉積到SPE/rGO電極上，得到修飾電極SPE/rGO/β-CD/GOx。本發(fā)明提供的電極制備方法具有成本低廉，步驟簡便的優(yōu)點，且制備出的電極響應(yīng)速度快，靈敏度高，選擇性好。
【專利說明】—種檢測多巴胺的電極的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生化分析領(lǐng)域，涉及一種檢測多巴胺的快速電極的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多巴胺(DA)是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一類重要的神經(jīng)傳遞素，它能調(diào)節(jié)腦內(nèi)相關(guān)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種功能及精神活動，如感知、情感、行為和運(yùn)動等。體內(nèi)DA失調(diào)將會導(dǎo)致精神分裂癥以及帕金森氏綜合癥等疾病。因此，對其含量測定在生理功能研究和臨床應(yīng)用方面都具有重要的意義。
[0003]近年來，不同類型檢測DA的方法和應(yīng)用成為研究熱點。國內(nèi)外常采用的檢測DA的方法包括高效液相色譜法，紫外-可見分光光度法，熒光分光光度法，毛細(xì)管電泳法，電化學(xué)方法等。但現(xiàn)有的這些檢測方法不同程度的存在分析速度慢，檢測結(jié)果不穩(wěn)定，操作工藝復(fù)雜，成本較高等問題。
[0004]事實上，由于抗壞血酸(AA)、多巴胺前軀體及代謝產(chǎn)物的存在，使得DA的檢測成為一大難題。傳統(tǒng)的檢測方法無法排除這些物質(zhì)的干擾，電化學(xué)方法作為一種新興的檢測手段，能夠有效的排除AA、尿酸(U A )等物質(zhì)的干擾，在一定的濃度范圍內(nèi)選擇性的檢測出DA。目前，科研工作者已經(jīng)研究出一系列選擇性檢測DA的電化學(xué)方法。如石墨烯修飾玻碳電極，在保持AA濃度始終為ImM的情況下，能夠檢測出DA濃度的線性范圍是 4 μ M-100 μ M,檢測限是 2.64 μ M (Kim, Y.-R., S.Bong, et al.Electrochemicaldetection of dopamine in the presence of ascorbic acid using graphene modifiedelectrodes.Biosensors and Bioelectronics.2010.25 (10): 2366-2369.);漆酶/多壁碳納米管修飾玻碳電極，在生理水平的AA和3，4-二羥基苯乙酸(DOPAC)干擾下，該電極檢測DA的線性范圍是1-30μΜ，檢測限是0.4uM(Xiang，L.，Y.Lin, etal.Laccase-catalyzed oxidation and intramolecular cyclization of dopamine:A new method for selective determination of dopamine with laccase/carbonnanotube-based electrochemical biosensors.Electrochimica Acta.2007.52(12):4144-4152) ;二茂鐵/多壁碳納米管修飾玻碳電極，在AA濃度高達(dá)IOmM情況下，檢測DA的線性范圍是 0.5 μ M-20 μ M，檢測限是 0.3 μ M(Cheng，H.，H.Qiuj et al.1nvestigationof the electrochemical behavior of dopamine at electrodes modified withferrocene-filled double-walled carbon nanotubes.Electrochimica Acta.2012.63: 83-88.)。這些電極均能在特定濃度的干擾物存在下，較靈敏的選擇性檢測出DA。但這些電化學(xué)檢測DA方法使用的電極多為玻碳電極，玻碳電極價格相對昂貴且需要經(jīng)過復(fù)雜的預(yù)處理活化步驟，使得電極的制備非常復(fù)雜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種檢測DA的電極的制備方法。本發(fā)明用成本低廉的絲網(wǎng)印刷電極(SPE)為載體，修飾上還原氧化石墨烯(rGO)、β-環(huán)糊精(β-⑶)和葡萄糖氧化酶(GOx)，得到修飾電極SPE/rGO/ β -⑶/GOx，實現(xiàn)了快速有效的檢測DA的目的。該電極具有成本低、操作簡便、快速、靈敏、選擇性好等優(yōu)點。
[0006]本發(fā)明提供一種檢測多巴胺的電極的制備方法，該方法包括如下步驟:
(1)將rGO加入無水乙醇中,超聲分散0.5?8h得到rGO懸浮液,所述rGO懸浮液濃度為 100 ?2000mg /L ；
(2)移取rGO懸浮液并滴涂至活化處理后的SPE上，滴涂量為10?30μ L，制得SPE/
rGO ；
(3)將β-⑶和GOx溶解于pH值為6.2?8.0的PBS緩沖液中，每ImL的PBS緩沖液中溶有0.005?0.025g的β -⑶和活力為500?5000U的GOx ;再使用SPE/rGO掃描該混合溶液，掃描的電位范圍為-0.2?0.8V，得到SPE/rGO/β -⑶/GOx電極。
[0007]步驟(I)所述rGO懸浮液濃度為1000mg/L。
[0008]步驟(2)所述rGO懸浮液的滴涂量為15 μ L。
[0009]步驟(3)將β -⑶和GOx溶解于PBS緩沖液中，每ImL的PBS緩沖液中溶有0.0113g的β -CD和活力為2000U的GOx。
[0010]所述PBS緩沖液pH值為7.4。
[0011]步驟(3)所述SPE/rGO掃描混合溶液的過程中，SPE/rGO的工作電極作工作電極，SPE/rGO的參比電極作參比電極，SPE/rGO的對電極作對電極，掃描速率10?100mV/s，掃描圈數(shù)為5?20圈。
[0012]所述掃描速率為50mV/s，掃描圈數(shù)為10圈。
[0013]所述rGO是由氫碘酸還原法制得，其還原法步驟如下:
將100?400mgG0加入50?200ml無水乙醇中超聲分散，直至GO在無水乙醇中徹底分散；然后加入50ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%?58%的氫碘酸，在水浴鍋恒溫85°C加熱0.5?3h后，溶液離心分離并烘干。
[0014]所述rGO是由氫碘酸還原法制得，其還原法步驟如下:將260mgG0加入130ml無水乙醇中超聲分散，直至GO在無水乙醇中徹底分散；然后加入50ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%?58%的氫碘酸，在水浴鍋恒溫85°C加熱Ih后，溶液離心分離并烘干。
[0015]活化處理后的SPE是由如下方法制得:在電化學(xué)工作站中，SPE的參比電極作參比電極，SPE的工作電極作工作電極，SPE的對電極作對電極，采用循環(huán)伏安法掃描酸溶液，循環(huán)伏安掃描酸液的電位范圍為-1.5?1.5V，掃描速率為10?100mV/S，掃描圈數(shù)為I?20圈；所述酸溶液為硫酸、硝酸或鹽酸，其濃度為0.1?1M。
[0016]所述酸溶液為硫酸,濃度為0.5M。
[0017]所述掃描速率為50mV/s，掃描圈數(shù)為10圈。
[0018]本發(fā)明中所使用的絲網(wǎng)印刷電極(SPE):蘇州長三角系統(tǒng)生物交叉科學(xué)研究院有限公司
氧化石墨烯(GO):南京先鋒納米科技公司 β-環(huán)糊精(β_⑶):上海三浦化工有限公司 葡萄糖氧化酶(GOx):sigma公司。
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點在于:⑴制備成本低廉；(2)制備方法簡單；(3)制備的電極響應(yīng)速度快，靈敏度高，選擇性好?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0020]圖1為滴涂法制備SPE/rGO示意圖。
[0021 ] 圖2為SPE/rGO/ β -CD/GOx檢測DA反應(yīng)原理圖。
[0022]圖3為實施例1中SPE的10000倍SEM圖。
[0023]圖4為實施例1中SPE/rGO的10000倍SEM圖。
[0024]圖5 為實施例1 中 SPE/rGO/ β -CD/GOx 的 10000 倍 SEM 圖。
[0025]圖6為實施例2中SPE/rGO/ β -CD/G0x檢測不同濃度DA的DPV圖(插圖為DPV峰流值與DA濃度的擬合曲線)。
[0026]圖7為實施例3中SPE/rGO/ β -CD/G0x在UA干擾下選擇性檢測不同濃度DA的DPV峰流值與DA濃度的擬合曲線。[0027]圖8為實施例4中SPE/rGO/ β -⑶/GOx在AA干擾下選擇性檢測不同濃度DA的DPV峰流值與DA濃度的擬合曲線。
[0028]圖9為實施例6中SPE/rGO/ β -CD/G0x檢測不同濃度DA的DPV峰流值與DA濃度的擬合曲線。
[0029]圖10為實施例8中SPE/rGO/ β -CD/G0x檢測不同濃度DA的DPV峰流值與DA濃度的擬合曲線。
【具體實施方式】
[0030]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明并不限于以下實施例。所述方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所述原材料如無特別說明均能從公開商業(yè)途徑而得。[0031 ]實施例1、SPE/rGO/ β -CD/GOx 的制備
SPE的活化處理:在電化學(xué)工作站中，以SPE的參比電極作參比電極，SPE的對電極作對電極，SPE的工作電極作工作電極，在-1.5~1.5V電位下以50mV/s的掃速掃描0.5M硫酸溶液，掃描10圈?；罨蟮碾姌O室溫下放置干燥。
[0032]將260mgG0加入130ml無水乙醇中超聲分散，直至GO在無水乙醇中徹底分散為止，得到黃褐色均質(zhì)液體。在分散后的GO中，加入50ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%~58%的氫碘酸，在水浴鍋恒溫85°C加熱lh。反應(yīng)結(jié)束后，溶液離心分離并烘干得到rGO。
[0033]取IOOmg rGO在100mL無水乙醇中超聲處理3h,直至rGO完全分散得到均勻的懸浮液。用移液槍取15 μ L rGO懸浮液滴涂SPE，電極室溫下放置干燥。
[0034]稱取0.0113g β -CD和活力為2000U的GOx溶于ImL PBS緩沖液(pH 7.4)中，并充分混合。得到的β_⑶和GOx混合液作電解液，SPE/rGO的參比電極作參比電極，SPE/rGO的對電極作對電極，SPE/rGO的工作電極作工作電極，采用循環(huán)伏安法掃描10圈，掃描電位-0.2 ~0.8V,掃速 50mV/so
[0035]所得SPE、SPE/rGO與SPE/rGO/ β -CD/G0x的掃描電鏡圖分別如圖3、4和5所示。由圖5可知，用以上方法，成功的將rGO, β -⑶-GOx修飾到SPE電極表面。SPE/rGO/ β -⑶/GOx電極表面為多孔的球形態(tài)。
[0036]實施例2、SPE/rGO/ β -CD/G0x電極DA檢測的靈敏度，檢測限和檢測范圍
分別配制5、10、15、20、30、40、50、60、65、70、80、100μΜ的DA溶液，并用實施例1制備所得的SPE/rGO/β -CD/GOx的參比電極作參比電極，SPE/rGO/β -CD/GOx的對電極作對電極，SPE/rGO/ β -⑶/GOx的工作電極作工作電極，采用差分脈沖伏安法(DPV)掃描這12個不同濃度的DA溶液，掃描電位范圍為-0.2~0.6V。取各濃度下DA的峰流值與DA濃度作擬
合曲線。
[0037]圖6為SPE/rGO/ β -CD/GOx電極用DPV法掃描不同濃度DA的峰電流值與DA濃度的擬合曲線(/(DA) =-0.0788C(DA) -7.8173)。由圖分析得到，SPE/rGO/ β -CD/GOx 對檢測 DA的線性范圍為5-100 μ Μ，靈敏度為0.0788 μ A μ M 檢測限為1.56 μ M0這些結(jié)果說明SPE/rGO/ β -CD/GOx電極能夠在較寬的線性范圍內(nèi)檢測出DA，且對DA檢測有較高的靈敏度，和較低的檢出限。
[0038]實施例3、UA干擾下，SPE/rGO/ β -CD/GOx對DA的選擇性檢測
分別配制DA濃度為5、10、20、30、40、50、55 μ M的DA和UA的混合液，其中UA濃度始終為DA濃度的10倍。按實施例2采用的DPV法，求出在UA干擾的情況下，SPE/rGO/ β -⑶/GOx電極對DA的檢測限，靈敏度和線性范圍。
[0039]圖7為UA干擾濃度為DA濃度的10倍時，SPE/rGO/ β -CD/GOx電極掃描不同濃度DA的DPV峰電流值與DA濃度的擬合曲線(J(DA) =-0.0596^(DA) -2.6134)。由圖分析得到，UA干擾下，SPE/rGO/ β -CD/G0x電極對DA的線性范圍為5-55 μ Μ，靈敏度為0.0596 μ A μ M
檢測限為2.06 μ M0說明該電極對DA有較高的選擇性，能在高濃度的UA干擾下，選擇性的檢測出DA。
[0040]實施例4、AA干擾下，SPE/rGO/ β -CD/G0x對DA選擇性檢測
分別配制DA濃度為5、IO、15、20、30、40、50 μ M的DA和AA的混合液，其中AA濃度始終為DA濃度的10倍。按實施例2采用的DPV法，求出在AA干擾的情況下，SPE/rGO/ β -⑶/GOx電極對DA的檢測限，靈敏度和線性范圍。
[0041]圖8為AA干擾濃度為DA濃度的10倍時，SPE/rGO/ β -CD/GOx電極掃描不同濃度DA的DPV峰電流值與DA濃度的擬合曲線(J(DA) =-0.1764^(DA) -5.8026)。由圖分析得到，AA干擾下，SPE/rGO/ β -CD/G0x電極對DA的線性范圍為5-50 μ Μ，靈敏度為0.1764 μ A μ M―1，檢測限為1.67μΜ。說明該電極能在AA干擾下，靈敏的選擇性檢測出DA。
[0042]實施例5、SPE/rGO/ β -CD/GOx 的制備
在電化學(xué)工作站中，以SPE的參比電極作參比電極，SPE的對電極作對電極，SPE的工作電極作工作電極，在-1.5~1.5V電位下以10mV/S的掃速掃描0.1M硝酸溶液，掃描I圈。活化后的電極室溫下放置干燥。
[0043]將IOOmgGO加入200ml無水乙醇中超聲分散，直至GO在無水乙醇中徹底分散為止，得到黃褐色均質(zhì)液體。在分散后的GO中，加入50ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%~58%的氫碘酸，在水浴鍋恒溫85°C加熱0.5h。反應(yīng)結(jié)束后，溶液離心分離并烘干得到rGO。
[0044]取IOmg rGO在100mL無水乙醇中超聲處理0.5h,直至rGO完全分散得到均勻的懸浮液。用移液槍取10 μ L rGO懸浮液滴涂SPE，電極室溫下放置干燥。
[0045] 稱取0.005g β -CD和活力為500U的GOx溶于ImL PBS緩沖液(pH 6.2)中，并充分混合。得到的β_⑶和GOx混合液作電解液，SPE/rGO的參比電極作參比電極，SPE/rGO的對電極作對電極，SPE/rGO的工作電極作工作電極，采用循環(huán)伏安法掃描5圈，掃描電位-0.2 ~0.8V,掃速 10mV/so[0046]實施例6、SPE/rGO/ β -CD/GOx電極DA檢測的靈敏度，檢測限和檢測范圍
分別配制 5、10、15、20、30、40、50、55、60、65、70、75、80、100μΜ 的 DA 溶液，并用實施例5制備所得的SPE/rGO/ β -CD/GOx的參比電極作參比電極，SPE/rGO/ β -CD/GOx的對電極作對電極，SPE/rGO/ β -CD/GOx的工作電極作工作電極，采用DPV法掃描這14個不同濃度的DA溶液，電位范圍為-0.2~0.6V。取各濃度下DA的峰流值與DA濃度作擬合曲線。
[0047]圖9為SPE/rGO/ β -⑶/GOx電極用DPV法掃描不同濃度DA的峰電流值與DA濃度的擬合曲線(/(DA) =-0.0737C(DA) -1.835)。由圖分析得到，SPE/rGO/ β -CD/G0x 對檢測 DA的線性范圍為5-100 μ M，靈敏度為0.(^?μΑμΜ—1，檢測限為1.67 μ Μ。
[0048]實施例7、SPE/rGO/ β -CD/GOx 的制備
在電化學(xué)工作站中，以SPE的參比電極作參比電極，SPE的對電極作對電極，SPE的工作電極作工作電極，在-1.5~1.5V電位下以100mV/s的掃速掃描IM鹽酸溶液，掃描20圈。活化后的電極室溫下放置干燥。
[0049]將400mgG0加入50ml無水乙醇中超聲分散,直至GO在無水乙醇中徹底分散為止，得到黃褐色均質(zhì)液體。在分散后的GO中，加入50ml純度為55%~58%的氫碘酸，在水浴鍋恒溫85°C加熱3h。反應(yīng)結(jié)束后，溶液離心分離并烘干得到rGO。
[0050]取200mg rGO在100mL無水乙醇中超聲處理8h,直至rGO完全分散得到均勻的懸浮液。用移液槍取30 μ L rGO懸浮液滴涂SPE，電極室溫下放置干燥。
[0051]稱取0.025g β-CD和活力為5000U的GOx溶于ImL PBS緩沖液(pH 8.0)中，并充分混合。得到的β_⑶和GOx混合液作電解液，SPE/rGO的參比電極作參比電極，SPE/rGO的對電極作對電極，SPE/rGO的工作電極作工作電極，采用循環(huán)伏安法掃描20圈，掃描電位-0.2 ~0.8V,掃速 100mV/s。
[0052]實施例8、SPE/rGO/ β -CD/G0x電極DA檢測的靈敏度，檢測限和檢測范圍
分別配制 5、10、15、20、30、40、50、55、60、65、70、75、80、100μΜ 的 DA 溶液，并用實施例7制備所得的SPE/rGO/ β -CD/G0x的參比電極作參比電極，SPE/rGO/ β -CD/G0x的對電極作對電極，SPE/rGO/β -⑶/GOx的工作電極作工作電極，采用DPV掃描這14個不同濃度的DA溶液，電位范圍為-0.2~0.6V。取各濃度下DA的峰流值與DA濃度作擬合曲線。
[0053]圖10為SPE/rGO/ β -CD/G0x電極用DPV法掃描不同濃度DA的峰電流值與DA濃度的擬合曲線(/(DA) =-0.0753^(DA) -1.7006)。由圖分析得到，SPE/rGO/ β -CD/G0x對檢測DA的線性范圍為5-100 μ Μ，靈敏度為0.0753 μ A μ M '檢測限為1.63 μ Μ。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測多巴胺的電極的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟: (1)將rGO加入無水乙醇中,超聲分散0.5?8h得到rGO懸浮液,所述rGO懸浮液濃度為 100 ?2000mg /L ； (2)移取rGO懸浮液并滴涂至活化處理后的SPE上，滴涂量為10?30μ L，制得SPE/rGO ； (3)將β-⑶和GOx溶解于pH值為6.2?8.0的PBS緩沖液中，每ImL的PBS緩沖液中溶有0.005?0.025g的β -⑶和活力為500?5000U的GOx ;再使用SPE/rGO掃描該混合溶液，掃描的電位范圍為-0.2?0.8V，得到SPE/rGO/β -⑶/GOx電極。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種檢測多巴胺的電極的制備方法，其特征在于:步驟(I)所述rGO懸浮液濃度為IOOOmg /L0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種檢測多巴胺的電極的制備方法，其特征在于:步驟(3)將β -⑶和GOx溶解于PBS緩沖液中，每ImL的PBS緩沖液中溶有0.0113g的β -⑶和活力為2000U 的 GOx。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種檢測多巴胺的電極的制備方法，其特征在于:步驟(3)所述SPE/rGO掃描混合溶液的過程中，SPE/rGO的工作電極作工作電極，SPE/rGO的參比電極作參比電極，SPE/rGO的對電極作對電極，掃描速率10?100mV/s，掃描圈數(shù)為5?20圈。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種檢測多巴胺的電極的制備方法，其特征在于:所述掃描速率為50mV/s，掃描圈數(shù)為10圈。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種檢測多巴胺的電極的制備方法，其特征在于:所述rGO是由氫碘酸還原法制得，其還原法步驟如下:將100?400mgG0加入50?200ml無水乙醇中超聲分散，直至GO在無水乙醇中徹底分散；然后加入50ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%?58%的氫碘酸，在水浴鍋恒溫85°C加熱0.5?3h后，溶液離心分離并烘干。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述一種檢測多巴胺的電極的制備方法，其特征在于:所述rGO是由氫碘酸還原法制得，其還原法步驟如下:將260mgG0加入130ml無水乙醇中超聲分散，直至GO在無水乙醇中徹底分散；然后加入50ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%?58%的氫碘酸，在水浴鍋恒溫85°C加熱Ih后，溶液離心分離并烘干。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種檢測多巴胺的電極的制備方法，其特征在于:SPE活化處理步驟如下:在電化學(xué)工作站中，SPE的參比電極作參比電極，SPE的工作電極作工作電極，SPE的對電極作對電極,米用循環(huán)伏安法掃描酸溶液,循環(huán)伏安掃描酸液的電位范圍為-1.5?1.5V，掃描速率為10?100mV/S，掃描圈數(shù)為I?20圈；所述酸溶液為硫酸、硝酸或鹽酸，其濃度為0.1?1M。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述一種檢測多巴胺的電極的制備方法，其特征在于:所述酸溶液為硫酸，濃度為0.5M。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述一種檢測多巴胺的電極的制備方法，其特征在于:所述掃描速率為50mV/s，掃描圈數(shù)為10圈。
【文檔編號】G01N27/327GK103913495SQ201310007432
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2013年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月9日
【發(fā)明者】華祖林, 白雪, 秦琴, 徐露竹, 顧莉, 褚克堅, 程浩淼 申請人:河海大學(xué)