一種人體自身抗體聯(lián)檢試紙條及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人體自身抗體聯(lián)檢試紙條及其制備方法，所述試劑條包括順次搭接的樣品墊、含有膠體金顆粒標(biāo)記物的玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜、吸水紙。所述硝酸纖維素膜包括包被有系統(tǒng)性紅斑狼瘡sm重組抗原和系統(tǒng)性硬化癥Scl-70重組抗原的檢測區(qū)，以及包被有羊抗鼠抗體的控制區(qū)；所述膠體金顆粒標(biāo)記物包括微信號放大系統(tǒng)和膠體金標(biāo)記鼠IgG，所述微信號放大系統(tǒng)為膠體金顆粒-親和素-生物素-sm/Scl-70重組抗原。本發(fā)明在雙抗原夾心檢測體系中，添加了生物素-親和素微信號放大系統(tǒng)，擴(kuò)大了目標(biāo)抗體的信號，增加檢測靈敏度，避免因信號太弱而出現(xiàn)假陰或者漏檢，同時(shí)還可同時(shí)對系統(tǒng)性紅斑狼瘡和系統(tǒng)性硬化癥進(jìn)行同步聯(lián)檢，節(jié)省檢測時(shí)間、檢測樣本和成本。
【專利說明】一種人體自身抗體聯(lián)檢試紙條及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，尤其涉及一種人體自身抗體聯(lián)檢試紙條及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自身抗體指針對自身組織、器官、細(xì)胞及細(xì)胞成分的抗體。人體的生長、發(fā)育和生存有完整的自身免疫耐受機(jī)制的維持，正常的免疫反應(yīng)有保護(hù)性防御作用，即對自身組織、成分不發(fā)生反應(yīng)。一旦自身耐受的完整性遭到破壞，則機(jī)體視自身組織、成分為“異物”，而發(fā)生自身免疫反應(yīng)，產(chǎn)生自身抗體。這些自身抗體會攻擊機(jī)體自身細(xì)胞、組織、器官，引起炎癥反應(yīng)，對機(jī)體造成傷害。常見的自身免疫疾病包括有結(jié)締組織疾病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮肌炎、系統(tǒng)系硬化癥、神經(jīng)肌肉疾病、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、脫髓鞘疾病、內(nèi)分泌性疾病、原發(fā)性腎上腺皮質(zhì)萎縮、慢性甲狀炎、青少年型糖尿病、消化系統(tǒng)疾病慢性非特異性潰瘍性結(jié)腸炎、慢性活動性肝炎、惡習(xí)性貧血與萎縮性胃炎等。
[0003]其中系統(tǒng)性紅斑狼瘡和系統(tǒng)性硬化癥在結(jié)締組織病中分別位居第一位和第二位。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種彌漫性、全身性自身免疫病，主要累及皮膚粘膜、骨骼肌肉、腎臟及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，同時(shí)還會累及肺、心臟、血液等多個(gè)器官和系統(tǒng)，出現(xiàn)多種臨床表現(xiàn)；血清中可檢測到多種自身抗體和免疫學(xué)異常。SLE好發(fā)于青年女性，發(fā)病高峰為15?40歲，男女發(fā)病比例為1: 9左右。幼年和老年性SLE的男女之比約為1: 2。全球的患病率約為30?50/10萬人，我國的患病率約為70/10萬人。盡管SLE的發(fā)病受遺傳因素的影響，但大多數(shù)為散發(fā)病例。系統(tǒng)性硬化癥(硬皮病)是一種以皮膚各系統(tǒng)膠原纖維硬化為特征的結(jié)締組織疾病。累及內(nèi)臟器官的系統(tǒng)性硬皮病又稱系統(tǒng)性硬化癥。本病在結(jié)締組織病中僅次于紅斑狼瘡而居第二位。患者以女性較多，女性與男性之比約為3: I。發(fā)病年齡以20?50歲多見。
[0004]Sm抗體正常參考值為陰性，在臨床上是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的血清標(biāo)記抗體。Scl-70抗體正常參考值為陰性，在臨床上是全身性硬皮病(PSS)的血清標(biāo)記性抗體。
[0005]作為自身免疫病的重要血清標(biāo)志物，人體自身抗體的快速檢測對于自身免疫性疾病的診斷、預(yù)后和轉(zhuǎn)歸判斷及理解疾病的病理過程有重要的應(yīng)用價(jià)值和理論意義。
[0006]Sm抗體和Scl-70抗體均屬于抗核內(nèi)可溶性抗原抗體(ENA)范疇，常用的檢測方法有凝膠對流電泳、免疫雙擴(kuò)散和免疫印跡法。目前最常用的是免疫印跡法，即采用免疫印跡法技術(shù)，通過凝膠電泳對混合抗原進(jìn)行蛋白分子分離，再將分離出來的蛋白分子轉(zhuǎn)印到膜上，將膜晾干，切成條，制作成檢測膜條，再跟試劑盒的其他組成成分配合使用。該方法雖然具有可一次性同時(shí)檢測多種自身抗體疾病及價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，但制作工藝較為繁雜，耗時(shí)長，不利于普及，且背景色復(fù)雜，不利于結(jié)果的判讀。
[0007]如上所述，基于納米金檢測技術(shù)，再添加親和素-生物素信號擴(kuò)大系統(tǒng)，結(jié)合重組抗原制備技術(shù)，同時(shí)通過調(diào)整不同的制備工藝參數(shù)，在克服納米金靈敏度不足的同時(shí)也可以實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡和系統(tǒng)性硬化癥的同步檢測。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的自身抗體檢測膜條制作工藝繁雜，耗時(shí)長，不利于普及，且背景色復(fù)雜，不利于結(jié)果的判讀等缺陷，提供了一種人體自身抗體聯(lián)檢試紙條及其制備方法。
[0009]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案:
[0010]1.一種人體自身抗體聯(lián)檢試紙條，包括樣品墊(I)、與所述樣品墊(I) 一端緊密相連的含有膠體金顆粒標(biāo)記物的玻璃纖維膜(2)、與所述玻璃纖維膜(2)另一端緊密相連的硝酸纖維素膜(3)、以及與所述硝酸纖維素膜(3)的另一端緊密相連的吸水紙(4)，所述樣品墊(I)、玻璃纖維膜(2)、硝酸纖維素膜(3)和吸水紙⑷均設(shè)置于底板(5)上，所述硝酸纖維素膜(3)包被有系統(tǒng)性紅斑狼瘡sm重組抗原的檢測區(qū)(6)和系統(tǒng)性硬化癥Scl-70重組抗原的檢測區(qū)(7)，以及包被有羊抗鼠抗體的控制區(qū)(8)，所述膠體金顆粒標(biāo)記物包括微信號放大系統(tǒng)和膠體金標(biāo)記的鼠IgG，所述微信號放大系統(tǒng)為膠體金顆粒-親和素-生物素-sm/Scl-70重組抗原。
[0011]優(yōu)選地，所述系統(tǒng)性紅斑狼瘡Sm重組抗原用量為0.13-0.27μ g/mm，所述系統(tǒng)性硬化癥Scl-70重組蛋白用量為0.13-0.27 μ g/mm,所述膠體金標(biāo)記有鼠IgG抗體，用量為15-50 μ g/cm2。所述膠體金顆粒-親和素-生物素-Sm/SCL-70重組抗原復(fù)合物的用量為12.5-68 μ g/cm2。所述羊抗鼠抗體為羊抗鼠IgG抗體，所述羊抗鼠抗體的用量為0.20-0.48 μ g/mm。
[0012]本發(fā)明還提供了一種上述試紙條的制備方法，包括以下步驟:
[0013](I)制備系統(tǒng)性紅斑狼瘡sm重組抗原、系統(tǒng)性硬化癥Scl-70重組抗原以及膠體金標(biāo)記鼠IgG抗體；
[0014](2)制備微信號放大系統(tǒng)
[0015]a、制備膠體金標(biāo)記親和素
[0016]將待標(biāo)記親和素預(yù)先在0.001?0.01mol/L的NaCl溶液中透析過夜，離心，調(diào)節(jié)膠體金液的pH值至9?10，標(biāo)記親和素以形成膠體金標(biāo)記親和素；
[0017]b、按常規(guī)方法制備生物素化sm重組抗原和生物素化Scl-70重組抗原；
[0018]C、完成微信號放大系統(tǒng)
[0019]將步驟a得到的膠體金標(biāo)記親和素和步驟b得到的生物素化sm/Scl-70重組抗原混合，連接得到膠體金-親和素-生物素-sm/Scl-70重組抗原復(fù)合物，洗滌，即得微信號放大系統(tǒng)；
[0020](3)按稀釋參數(shù)25?40cm2/ml，將步驟(2)的膠體金-親和素-生物素-sm重組抗原、以及膠體金-親和素-生物素-Scl-70重組抗原噴灑到玻璃纖維膜上，干燥12個(gè)小時(shí)以上，備用；
[0021](4)用包被緩沖液稀釋sm重組抗原，使其濃度為1.0?1.5mg/ml，按膜液量0.15?0.2 μ 1/mm,將其細(xì)致均勻的噴到硝酸纖維素膜上,干燥12個(gè)小時(shí)以上,備用；
[0022]用包被緩沖液稀釋Scl-70重組抗原，使其濃度為1.0?1.5mg/ml,按膜液量
0.15?0.20 μ 1/mm,將其細(xì)致均勻的噴到硝酸纖維素膜上,干燥12個(gè)小時(shí)以上,備用；
[0023]用包被緩沖液稀釋羊抗鼠抗體，使其濃度為1.0?2.0mg/ml，按膜液量0.16?0.20 μ 1/mm，將其細(xì)致均勻的噴到硝酸纖維素膜上，干燥12個(gè)小時(shí)以上,備用；
[0024](5)將樣品墊、步驟(3)的玻璃纖維膜、步驟(4)的硝酸纖維素膜、吸水紙按序粘貼于底板上，即得。
[0025]為了解決信號擴(kuò)大不足和不能用免疫層析法同步檢測人體自身抗體疾病的問題，本發(fā)明基于固相免疫層析原理，采用功能性彩色微球技術(shù)(膠體金顆粒標(biāo)記技術(shù))、微信號放大技術(shù)(親和素-生物素體系和雙抗原夾心反應(yīng)體系)及聯(lián)檢技術(shù)檢測人體血液中的系統(tǒng)性紅斑狼瘡sm抗體和系統(tǒng)性硬化癥Scl-70抗體。若樣品中含有系統(tǒng)性紅斑狼瘡sm抗體或系統(tǒng)性硬化癥Scl-70抗體，經(jīng)玻璃纖維膜上的微信號級聯(lián)系統(tǒng)將信號放大，使sm/Scl-70抗體與膠體金顆粒標(biāo)記物結(jié)合，形成復(fù)合物，并擴(kuò)散到硝酸纖維素膜上進(jìn)一步層析，當(dāng)遇到包被在硝酸纖維素膜上檢測區(qū)的檢測線6或者檢測線7 (分別為系統(tǒng)性紅斑狼瘡sm重組抗原或系統(tǒng)性硬化癥Scl-70重組抗原包被線)處的配對抗原時(shí)，復(fù)合物則又和包被抗原結(jié)合，被捕獲在包被處，當(dāng)被捕獲的復(fù)合物達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，則形成肉眼可見的檢測線條，說明樣品中含有sm抗體或者Scl-70抗體，若不出現(xiàn)，說明樣品為陰性或含量低于試紙條的最低檢測限?？刂茀^(qū)(C線)作為試紙條的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，陽性和陰性樣品檢測時(shí)均會出現(xiàn)。
[0026]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
[0027](I)本發(fā)明在現(xiàn)有檢測試紙條的基礎(chǔ)上，添加了生物素-親和素微信號級聯(lián)放大系統(tǒng)，因而，在檢測自身抗體的過程中，擴(kuò)大了目標(biāo)抗體的信號，增加檢測靈敏度，避免因信號太弱而出現(xiàn)假陰或者漏檢；
[0028](2)本發(fā)明的試紙條具有操作安全(無放射物污染)、簡便(簡單操作一步完成)、適合單人/份檢測(酶免不適合單人/份或少量樣品檢測)和快速(3-5分鐘左右即可有結(jié)果)等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)對系統(tǒng)性紅斑狼瘡和系統(tǒng)系硬化癥的POCT檢測；
[0029](3)本發(fā)明的試紙條可以實(shí)現(xiàn)在一條紙條上同時(shí)檢測系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥，相對于免疫印跡方法縮短了檢測時(shí)間；相對于市面現(xiàn)有的自身免疫性疾病免疫層析試紙條檢測產(chǎn)品，增加了檢測靈敏度，并實(shí)現(xiàn)了 2種自身免疫性疾病的同步檢測,節(jié)約了一次性耗材。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為本發(fā)明的一種人體自身抗體聯(lián)檢試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0031]圖2為利用本發(fā)明一種人體自身抗體聯(lián)檢試紙條檢測系統(tǒng)性紅斑狼瘡和系統(tǒng)性硬化癥的有效檢驗(yàn)結(jié)果示意圖
[0032]圖3為利用本發(fā)明一種人體自身抗體聯(lián)檢試紙條檢測系統(tǒng)性紅斑狼瘡和系統(tǒng)性硬化癥的無效結(jié)果檢驗(yàn)結(jié)果示意圖
[0033]附圖標(biāo)記:1.樣品墊；2.玻璃纖維膜；3.硝酸纖維素膜；4.吸水紙；5.底板；6.系統(tǒng)性紅斑狼瘡檢測區(qū)；7.系統(tǒng)性硬化癥檢測區(qū)；8.質(zhì)控區(qū)。
【具體實(shí)施方式】
[0034]以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0035]實(shí)施例1本發(fā)明系統(tǒng)性紅斑狼瘡和系統(tǒng)性硬化癥的聯(lián)檢試紙
[0036]如圖1所示，為本發(fā)明所述的一系統(tǒng)性紅斑狼瘡和系統(tǒng)性硬化癥的聯(lián)檢試紙。包括樣品墊1、與所述樣品墊I 一端緊密相連的含有膠體金顆粒標(biāo)記物的玻璃纖維膜2、與所述玻璃纖維膜2另一端緊密相連的硝酸纖維素膜3、以及與所述纖維素膜3的另一端緊密相連的吸水紙4，所述樣品墊1、玻璃纖維膜2、硝酸纖維素膜3和吸水紙4均設(shè)置于底板5上，所述硝酸纖維素膜3包括包被有系統(tǒng)性紅斑狼瘡sm重組抗原的檢測區(qū)6、包被有系統(tǒng)性硬化癥Scl-70重組抗原的檢測區(qū)7和包被有羊抗鼠抗體的控制區(qū)8，所述膠體金顆粒標(biāo)記物包括微信號放大系統(tǒng)和膠體金標(biāo)記鼠IgG抗體，所述微信號放大系統(tǒng)為膠體金顆粒-親和素-生物素-sm/Scl-70重組抗原，其中sm/Scl-70重組抗原為系統(tǒng)性紅斑狼瘡sm重組抗原或系統(tǒng)性硬化癥Scl-70重組抗原。
[0037]本發(fā)明所述的一種人體自身抗體聯(lián)檢試紙條，所述膠體金顆粒-親和素-生物素-系統(tǒng)性紅斑狼瘡sm重組抗原復(fù)合物在玻璃纖維膜2上的用量為50 μ g/cm2 ;膠體金顆粒-親和素-生物素-系統(tǒng)性硬化癥Scl-70重組抗原復(fù)合物在玻璃纖維膜2上的用量為55 μ g/cm2 ;膠體金標(biāo)記鼠IgG抗體在玻璃纖維膜2上的用量為30 μ g/cm2 ;系統(tǒng)性紅斑狼瘡sm重組抗原的原始濃度為3.5mg/ml和系統(tǒng)性硬化癥Scl-70重組抗原的原始濃度為
2.5mg/ml,包被到硝酸纖維膜3的檢測區(qū)6和檢測區(qū)7時(shí)的濃度分別為1.0mg/ml和1.2mg/ml，包被用量分別為0.18 μ g/mm和0.21 μ g/mm ;羊抗鼠IgG抗體包被在控制區(qū)時(shí)的用量為0.30 μ g/mm。
[0038]實(shí)施例2本發(fā)明試紙條的制備方法
[0039]在本發(fā)明中采用膠體金顆粒標(biāo)記。其中膠體金顆粒的顆粒直徑大小為納米級(30?50nm),膠體金顆粒的吸附機(jī)理是利用它在堿性條件下帶負(fù)電荷的性質(zhì),與蛋白質(zhì)分子的正電荷集團(tuán)，靠靜電吸引而結(jié)合形成免疫診斷試劑。
[0040]下面對本發(fā)明試紙條的制備方法介紹如下:
[0041]一種人體自身抗體聯(lián)檢試紙條，其制備步驟如下:
[0042]1.制備系統(tǒng)性紅斑狼瘡sm重組抗原和系統(tǒng)性硬化癥Scl-70重組抗原。
[0043]參閱文獻(xiàn)及用生物專用軟件分析系統(tǒng)性紅斑狼瘡sm蛋白和系統(tǒng)性硬化癥Scl-70蛋白，明確功能性片段及其氨基酸序列，用PCR擴(kuò)增方法或者基因合成方法獲取功能性蛋白片段，采用的原核表達(dá)體系或者真核表達(dá)體系表達(dá)目標(biāo)蛋白并根據(jù)蛋白特性進(jìn)行重組蛋白純化和功能性鑒定。
[0044]2、制備微信號放大系統(tǒng)
[0045]a、制備膠體金標(biāo)記親和素:將待標(biāo)記親和素預(yù)先在0.005mol/L pH7.0的NaCl溶液中4°C透析過夜，以除去多余的鹽離子，然后4°C IOOOOOg離心lh，去除聚合物；以
0.lmol/L K2CO3或0.lmol/L HCl調(diào)節(jié)膠體金液的pH值至9?10，標(biāo)記親和素以形成膠體金標(biāo)記親和素；
[0046]b、制備生物素化sm/Scl-70重組抗原:先用6_氨基己糖與生物素連接制得長臂生物素，再使其與sm/Scl-70重組抗原結(jié)合，然后在碳二亞胺的作用下將其與N-羥基丁二酰胺進(jìn)行縮和，生成長臂生物素N-輕基丁二酰亞胺酯(N-hydroxy-succinimido-6-biotinylami do hexanoate, BCNHS),即為生物素化sm/Scl-70重組抗原。通過透析除去游離生物素。
[0047]C、完成微信號放大系統(tǒng):將步驟a得到的膠體金標(biāo)記親和素和步驟b得到的生物素化sm/Scl-70重組抗原直接混合，連接得到膠體金-親和素-生物素-sm/Scl-70重組抗原復(fù)合物，經(jīng)過洗滌、離心處理后，即得微信號放大系統(tǒng)。[0048]3、膠體金標(biāo)記鼠I gG抗體
[0049]在pH6.5?7.0范圍內(nèi)，鼠IgG與膠體金顆粒蛋白標(biāo)記形成膠體金標(biāo)記鼠IgG抗體(蛋白探針)。
[0050]4、將膠體金-親和素-生物素-sm/Scl-70重組抗原、以及膠體金標(biāo)記鼠IgG抗體噴灑到玻璃纖維膜2上，稀釋參數(shù)(稀釋參數(shù)是每ml溶液噴灑多少面積的工藝參數(shù))為25?35cm2/ml，并在溫度20?40°C，濕度10% -30%，將玻璃纖維膜2干燥12個(gè)小時(shí)以上，備用。
[0051]5、用包被緩沖液(主要成分是磷酸緩沖液、蔗糖)稀釋sm/Scl-70重組抗原，使其濃度為1.0mg/ml，按膜液量0.18 μ 1/mm,將其分別細(xì)致均勻的噴到硝酸纖維素膜3上，其中硝酸纖維素膜3孔徑為5.0?12.0 μ m，置于20?40°C，濕度10%?30%條件下烘干處理12個(gè)小時(shí)以上，備用；用包被緩沖液稀釋羊抗鼠IgG抗體，使其濃度為1.5mg/ml，按膜液量
0.20 μ 1/mm，將其細(xì)致均勻的噴到硝酸纖維素膜3上，置于20?40°C，濕度10%?30%條件下烘干處理12個(gè)小時(shí)以上，封袋，備用；
[0052]6、將樣品墊1、玻璃纖維膜2、硝酸纖維素膜3和吸水紙4依序粘貼于底板7上，即得本發(fā)明所述的試紙條。
[0053]本發(fā)明所述的系統(tǒng)性紅斑狼瘡和系統(tǒng)性硬化癥的聯(lián)檢試紙經(jīng)過包裝可以直接使用，或者安裝到試劑盒里，配合小滴管，充當(dāng)試劑卡使用。
[0054]實(shí)施例3利用實(shí)施例1中的試紙條檢測樣本中的系統(tǒng)性紅斑狼瘡sm抗體和系統(tǒng)性硬化癥Scl-70抗體的方法
[0055]本實(shí)施例利用實(shí)施例1的試紙條對人血液樣本中的sm/Scl-70抗體進(jìn)行檢測。
[0056]包括以下步驟:
[0057](I)采集血液樣本，離心收取血清。
[0058](2)沿鋁箔袋切口部位撕開，取出試條平放，吸取5μ I樣本垂直滴加于試條箭頭膠所示的加樣區(qū)(圖1);由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著試紙條經(jīng)過玻璃纖維素膜2和硝酸纖維素膜3。
[0059](3)5分鐘后觀察顯示結(jié)果(30分鐘后顯示的結(jié)果無效)，判讀并記錄檢測結(jié)果(圖2和圖3)，若硝酸纖維素膜3的檢測區(qū)6出現(xiàn)一條肉眼可見的深色線，即表明樣品中含有大量系統(tǒng)性紅斑狼瘡sm抗體，即說明受檢驗(yàn)者患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡(系統(tǒng)性紅斑狼瘡sm抗體陽性，請同時(shí)參考圖2);若檢測區(qū)7出現(xiàn)一條肉眼可見的深色線，即表明樣品中含有系統(tǒng)性硬化癥Scl-70抗體，說明受檢驗(yàn)者患有系統(tǒng)性硬化癥(系統(tǒng)性硬化癥Scl-70抗體陽性，請同時(shí)參考圖2);若檢測區(qū)6和檢測區(qū)7同時(shí)顯色，即說明受檢驗(yàn)者同時(shí)患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡和系統(tǒng)性硬化癥；若硝酸纖維素膜3的檢測區(qū)6和檢測區(qū)7均未出現(xiàn)肉眼可見的顯色線條，即表明樣品中未含有可檢出的sm抗體或Scl-70抗體，說明受檢驗(yàn)者未患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡和系統(tǒng)性硬化癥(陰性，請同時(shí)參考圖2);當(dāng)樣品通過硝酸纖維素膜3的檢測區(qū)6和檢測區(qū)7移動至控制區(qū)8時(shí)，無論樣品中是否含有sm抗體或者Scl-70抗體，控制區(qū)8都會出現(xiàn)有一條深色線(C線)；若控制區(qū)8無顯色線出現(xiàn)，說明試紙條已經(jīng)過期或操作有誤，檢測結(jié)果無效(請參考圖3)；
[0060](4)測試結(jié)束后，將使用后的試紙條、加樣管按生物醫(yī)療廢棄物進(jìn)行處理。
【權(quán)利要求】
1.一種人體自身抗體聯(lián)檢試紙條，其特征在于，包括樣品墊(1)、與所述樣品墊(1) 一端緊密相連的含有膠體金顆粒標(biāo)記物的玻璃纖維膜(2)、與所述玻璃纖維膜(2)另一端緊密相連的硝酸纖維素膜(3)、以及與所述硝酸纖維素膜(3)的另一端緊密相連的吸水紙(4)，所述樣品墊(1)、玻璃纖維膜(2)、硝酸纖維素膜(3)和吸水紙(4)均設(shè)置于底板(5)上，所述硝酸纖維素膜(3)包括包被有系統(tǒng)性紅斑狼瘡sm重組抗原的檢測區(qū)(6)、包被有系統(tǒng)性硬化癥Scl-70重組抗原的檢測區(qū)(7)，以及包被有羊抗鼠抗體的控制區(qū)(8)，所述膠體金顆粒標(biāo)記物包括微信號放大系統(tǒng)和膠體金標(biāo)記的鼠IgG抗體，所述微信號放大系統(tǒng)為膠體金顆粒-親和素-生物素-sm/SCL-70重組抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人體自身抗體聯(lián)檢試紙條，其特征在于平行包被了系統(tǒng)性紅斑狼瘡sm重組抗原和系統(tǒng)性硬化癥SCL-70重組抗原，可以同時(shí)檢測系統(tǒng)性紅斑狼瘡和系統(tǒng)性硬化癥。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人體自身抗體聯(lián)檢試紙條，其特征在于，所述系統(tǒng)性紅斑狼瘡sm重組抗原用量為0.13-0.27μ g/mm，所述系統(tǒng)性硬化癥SCL-70重組蛋白用量為0.13-0.27 μ g/mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的人體自身抗體聯(lián)檢試紙條，其特征在于，所述膠體金顆粒-親和素-生物素-sm/Scl-70重組抗原復(fù)合物的用量為12.5-68 μ g/cm2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人體自身抗體聯(lián)檢試紙條，其特征在于，所述膠體金標(biāo)記有鼠IgG抗體，用量為15-50 μ g/cm2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人體自身抗體聯(lián)檢試紙條，其特征在于，所述羊抗鼠抗體為羊抗鼠IgG抗體，所述羊抗鼠抗體的用量為0.20-0.48 μ g/mm。
7.一種制備權(quán)利要求1所述的人體自身抗體聯(lián)檢試紙條的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)制備系統(tǒng)性紅斑狼瘡sm重組抗原、系統(tǒng)性硬化癥Scl-70重組抗原以及膠體金標(biāo)記鼠IgG抗體； (2)制備微信號放大系統(tǒng) a、制備膠體金標(biāo)記親和素 將待標(biāo)記親和素預(yù)先在0.001~0.01mol/L的NaCl溶液中透析過夜，離心，調(diào)節(jié)膠體金液的PH值至9~10，標(biāo)記親和素以形成膠體金標(biāo)記親和素； b、按常規(guī)方法制備生物素化sm重組抗原和生物素化Scl-70重組抗原； C、完成微信號放大系統(tǒng) 將步驟a得到的膠體金標(biāo)記親和素和步驟b得到的生物素化sm/Scl-70重組抗原混合，連接得到膠體金-親和素-生物素-sm/Scl-70重組抗原復(fù)合物，洗滌，即得微信號放大系統(tǒng)； (3)按稀釋參數(shù)25~40cm2/ml，將步驟(2)的膠體金-親和素-生物素_sm重組蛋白、以及膠體金-親和素-生物素-Scl-70重組蛋白噴灑到玻璃纖維膜上，干燥12個(gè)小時(shí)以上，備用; (4)用包被緩沖液稀釋sm重組抗原，使其濃度為1.0~1.5mg/ml，按膜液量0.15~.0.2 μ 1/mm，將其細(xì)致均勻的噴到硝酸纖維素膜上，干燥12個(gè)小時(shí)以上,備用； 用包被緩沖液稀釋Scl-70重組抗原，使其濃度為1.0~1.5mg/ml，按膜液量0.15~`0.20 μ 1/mm，將其細(xì)致均勻的噴到硝酸纖維素膜上，干燥12個(gè)小時(shí)以上,備用； 用包被緩沖液稀釋羊抗鼠抗體，使其濃度為1.0~2.0mg/ml,按膜液量0.16~`0.20 μ 1/mm，將其細(xì)致均勻的噴到硝酸纖維素膜上，干燥12個(gè)小時(shí)以上,備用； (5)將樣品墊、步驟(3)的玻璃纖維膜、步驟(4)的硝酸纖維素膜、吸水紙按序粘貼于底板上，即得。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的人體自身抗體聯(lián)檢試紙條的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中膠體金-親和素-生物素-sm重組抗原復(fù)合物的用量為12.5-68 μ g/cm2，膠體金-親和素-生物素-Scl-70重組抗原復(fù)合物的用量為12.5-68 μ g/cm2。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的人體自身抗體聯(lián)檢試紙條的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中sm重組抗原用量為0.13-0.27 μ g/mm ;Scl_70重組抗原的用量為0.13-0.27 μ g/mm ;所述羊抗鼠抗體的用量為0.20-0.48 μ g/mm。
【文檔編號】G01N33/558GK103913568SQ201310007578
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2013年1月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月4日
【發(fā)明者】王繼華, 王雪霞, 唐時(shí)幸 申請人:廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司