專利名稱：血紅蛋白電泳液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于臨床實(shí)驗(yàn)方法，具體是涉及一種血紅蛋白電泳液的制備方法。
背景技術(shù)：
血液的主要蛋白成分是血紅蛋白，是血紅細(xì)胞中的最主要蛋白成分，而在紅細(xì)胞中液中含有微量的超氧化物歧化酶(SOD)，碳酸酐酶、糖酵解酶系等。在血液部分則含有200多種功能不同的蛋白組分，因此，血紅蛋白制備的第一步即是要將紅細(xì)胞與其它組分進(jìn)行分離(即分漿處理)，最后通過(guò)溶解洗滌紅細(xì)胞以獲得所需的血紅蛋白液。目前，常用的血紅蛋白電泳液的制備方法主要有:四氯化碳溶血法、氯仿溶血法、皂素氰化鉀溶血法。1、四氯化碳溶血法:將EDTA抗凝全血除去血漿，用生理鹽水洗去細(xì)胞外的雜質(zhì)，加入蒸餾水溶血，用四氯化碳(AR)溶解，提取脂溶性物質(zhì)，沉淀細(xì)胞膜及基質(zhì)蛋白，經(jīng)離心后，上層為澄清透明的血紅蛋白液，其具體操作步驟是:新鮮抗凝靜脈血離心除去血漿。用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞3 4次，每次鹽水與紅細(xì)胞之比少于8: I。最后一次以3000 4000r/min,快速離心20min,盡量吸去生理鹽水,按壓積紅細(xì)胞之體積加入等體積的蒸懼水和0.5體積的四氯化碳,劇烈震蕩3min,使徹底溶血,用4000r/min離心20min,吸出上層血紅蛋白溶液，待用。該方法法制成的Hb液清晰、穩(wěn)定，膜蛋白及四氯化碳在試管底部，容易分離，但毒性較大，花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)。2、氯仿溶血法:該方法操作同四氯化碳溶血法，只是在萃取血紅蛋白液時(shí)加入兩種不同的有機(jī)溶劑，即:加四氯化碳和氯仿。該方法制成的HB液與四氯化碳法的基本一致，且毒性較小，但能沉淀UHb，故不適于UHb檢查。3、皂素氰化鉀溶血法:對(duì)全血標(biāo)本做洗滌壓縮細(xì)胞和溶血的準(zhǔn)備，離心10分鐘，從血漿中分離出細(xì)胞，去除血漿，重新懸浮在5 10倍體積的生理鹽水溶液(0.85% NaCl)中離心去除懸浮液洗滌壓縮細(xì)胞3次，洗滌標(biāo)本后，準(zhǔn)備樣本混合，10 μ I標(biāo)本和100μ I溶血液，用力振動(dòng)15秒。該方法由于含有氰化物，會(huì)對(duì)環(huán)境有污染。還有，中國(guó)衛(wèi)生部制定的《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第3版)提到的方法:血紅蛋白溶液的制備，取新鮮抗凝血液，離心后去血漿，用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞3 4次，最后一次應(yīng)盡量移去鹽水部分，再加相當(dāng)于紅細(xì)胞壓積2 3倍的蒸餾水，加I體積四氯化碳或氯仿，猛烈振搖5 6min，靜置片刻，高速離心，將上層Hb溶液分離出來(lái)備用。3000r/min離心5min,吸出上層清亮的血紅蛋白液。綜上，現(xiàn)有技術(shù)在制備過(guò)程中，漩渦器每次混勻只能一只手拿I 2支，每次雙手最多能處理4支樣本，且用力充分混勻，標(biāo)本量大時(shí)，耗時(shí)太多，混勻時(shí)間要求每支溶液保證在15秒以上較佳，在此過(guò)程中試管底部與設(shè)備表面接觸所散出的熱量相對(duì)較高，促使四氯化碳?xì)怏w揮發(fā)更快，操作人員吸入也就相應(yīng)增加。樣本離心10分鐘的時(shí)間，每個(gè)標(biāo)本要洗三次，按我中心現(xiàn)在的標(biāo)本量及設(shè)備，一臺(tái)離心機(jī)最多64孔，平均每天約500個(gè)左右的樣本，需離心約8次，每次10分鐘，那這一步驟都需要1.5小時(shí)(在離心過(guò)程中還需要將樣本放進(jìn)與取出樣本，需離心的次數(shù)越多，耗時(shí)也就越多)，再加上洗三次的時(shí)間，共需時(shí)間 250min才能將樣本洗完，耗時(shí)非常長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服上述技術(shù)上的障礙，提供一種毒性小且能快速制備血紅蛋白電泳液的方法。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種血紅蛋白電泳液的制備方法，由以下步驟組成:(I)取紅細(xì)胞，滴入到濃度為0.7 1.0% NaCl的生理鹽水中洗滌I次；(2)上機(jī)離心3 5min,棄上清液，留余量的紅細(xì)胞；(3)加300 350 μ I蒸餾水溶解紅細(xì)胞；(4)再次上機(jī)離心3 5min。所述紅細(xì)胞與生理鹽水的容積比可以為1: 4 5。所述紅細(xì)胞容積為130 150 μ 1，生理鹽水容積為5 7ml。步驟(I)所述的洗滌過(guò)程中，供助吸嘴從液面自上至下反復(fù)沖打3 5次，洗去雜質(zhì)，使清潔的紅細(xì)胞均勻地懸浮在液體當(dāng)中。所述步驟(3)所述溶解過(guò)程中，搖動(dòng)試管數(shù)次至溶血液澄清透明。所述兩次離心的轉(zhuǎn)速均為3000 4000r/min。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:1、本發(fā)明方法省掉了溶血素和四氯化碳兩種有毒化學(xué)試劑接觸，減少了加溶血素后等待紅細(xì)胞溶解緩慢的時(shí)間，省掉了前后兩次漩渦充分混勻時(shí)間，整個(gè)制備血紅蛋白液的過(guò)程中不需接觸任何化學(xué)試劑，不會(huì)對(duì)環(huán)境有污染。2、離心過(guò)程最多只需5分鐘，檢測(cè)臨床標(biāo)本效率高。3、制備過(guò)程中，一只手一次性可以握4 6支管，替代了傳統(tǒng)方法用真空泵一支支吸走上清液，節(jié)省人力，節(jié)省時(shí)間，為病人提前發(fā)報(bào)告，節(jié)省試劑成本，減小人體傷害。


圖1為血紅蛋白電泳液的電泳圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明制備血紅蛋白的較佳方法是:1、用吸管吸取血液中沉降的紅細(xì)胞135 μ 1，滴入到7ml濃度為0.9% NaCl的生理鹽水中，借助吸嘴從液面自上至下反復(fù)沖打3 5次，洗去雜質(zhì)，使清潔的紅細(xì)胞均勻地懸浮在液體當(dāng)中。2、上機(jī)3500r/min轉(zhuǎn)速下離心5min,使紅細(xì)胞充分沉淀在底部,傾倒出離心后的上清液，以去除血漿及雜質(zhì)，留余量的紅細(xì)胞。3、加蒸餾水320 μ 1，溶解紅細(xì)胞，雙手端起試管架利用手腕輕輕前后搖動(dòng)數(shù)次至溶血液澄清透明即可。4、為了獲得更好效果，可以再次上機(jī)3500r/min轉(zhuǎn)速下離心5min。制備好的血紅蛋白電泳液，根據(jù)帶電粒子在電場(chǎng)中作定向運(yùn)動(dòng)，可將可溶性被測(cè)物的各個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，然后對(duì)分離后的凝膠進(jìn)行染色掃描分析，采用瓊脂糖凝膠電泳法，用于篩查地中海貧血和血紅蛋白病。根據(jù)電泳結(jié)果作出判斷，如果顯示四條血紅蛋白區(qū)帶，從陽(yáng)極端依次為HBA，HBF，HBA2，CE，則屬于正常，除上述出現(xiàn)的區(qū)帶外，其他區(qū)帶均屬異常區(qū)帶，目前國(guó)內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的最常見(jiàn)和重要的異常Hb以HbA為標(biāo)志，在PH8.5TEB不連續(xù)電泳中大致分為六組，包括快速異常血紅蛋白H組和J組、慢速異常血紅蛋白G組、D組、E組。且此改良方法均可檢出且效果較其他方法清晰。需要說(shuō)明:無(wú)論哪種方法對(duì)于陳舊血紅蛋白區(qū)帶分散，效果差，不穩(wěn)定血紅蛋白易發(fā)生沉淀，所以，制作血紅蛋白液采用新鮮血液是最理想的。將傳統(tǒng)方法與本專利方法作比較，將二者結(jié)果再與國(guó)際地貧協(xié)會(huì)推薦的方法HPLC測(cè)得的結(jié)果比較，三種初篩方法再與地貧基因確認(rèn)方法比較結(jié)果符合性，從而可以客觀地評(píng)價(jià)試驗(yàn)的可靠性。表I為所取樣本的輔助診斷檢測(cè)，表2為電泳所測(cè)數(shù)據(jù)。表I部分樣本紅細(xì)胞參數(shù)及紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種血紅蛋白電泳液的制備方法，其特征在于由以下步驟組成: (1)取紅細(xì)胞，滴入到濃度為0.7 1.0% NaCl的生理鹽水中洗滌I次； (2)上機(jī)離心3 5min,棄上清液，留余量的紅細(xì)胞； (3)加300 350μ I蒸餾水溶解紅細(xì)胞； (4)再次上機(jī)離心3 5min。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血紅蛋白電泳液的制備方法，其特征在于，所述紅細(xì)胞與生理鹽水的容積比為1:40 50。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血紅蛋白電泳液的制備方法，其特征在于，所述紅細(xì)胞容積為130 150 μ 1，生理鹽水容積為5 7ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血紅蛋白電泳液的制備方法，其特征在于，步驟(I)所述的洗滌過(guò)程中，供助吸嘴從液面自上至下反復(fù)沖打3 5次，洗去雜質(zhì)，使清潔的紅細(xì)胞均勻地懸浮在液體當(dāng)中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血紅蛋白電泳液的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)所述溶解過(guò)程中，搖動(dòng)試管數(shù)次至溶血液澄清透明。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血紅蛋白電泳液的制備方法，其特征在于，所述兩次離心的轉(zhuǎn)速均為3000 4000r/min。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種血紅蛋白電泳液的制備方法，先用吸管吸取血液中沉降的紅細(xì)胞，滴入到生理鹽水中，借助吸嘴從液面自上至下反復(fù)沖打，洗去雜質(zhì)，使清潔的紅細(xì)胞均勻地懸浮在液體當(dāng)中，接著，上機(jī)離心，使紅細(xì)胞充分沉淀在底部，傾倒出離心后的上清液，以去除血漿及雜質(zhì)，留余量的紅細(xì)胞，最后，加蒸餾水，溶解紅細(xì)胞，雙手端起試管架利用手腕輕輕前后搖動(dòng)數(shù)次至溶血液澄清透明。整個(gè)制備過(guò)程中不需接觸任何化學(xué)試劑，不會(huì)對(duì)環(huán)境有污染，離心過(guò)程最多只需5分鐘，檢測(cè)臨床標(biāo)本效率高，節(jié)省人力。
文檔編號(hào)G01N1/34GK103091149SQ20131000967
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月10日
發(fā)明者張玲 申請(qǐng)人:廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司