大腸直腸癌相關(guān)基因K-ras基因突變檢測方法和相關(guān)檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種大腸直腸癌相關(guān)基因K-ras基因突變檢測方法，包括步驟：a.提取腫瘤組織的基因組DNA；b.根據(jù)K-ras基因的包含第13號密碼子的核苷酸序列設(shè)計一對PCR引物對，并設(shè)計一條與第13號密碼子的突變核苷酸序列匹配的TaqMan?MGB熒光探針，對基因組DNA進行熒光定量PCR；c.根據(jù)熒光定量PCR中收集的熒光信號而形成的實時擴增曲線，與陰性對照和陽性對照的結(jié)果進行比較和分析，從而鑒定基因組DNA中是否發(fā)生突變。還提供了相關(guān)檢測試劑盒。本發(fā)明的大腸直腸癌相關(guān)基因K-ras基因突變檢測方法設(shè)計巧妙，操作簡單，可以篩檢出可能對標靶藥物有效的病人族群，檢測結(jié)果準確可靠，從而可作為醫(yī)師用藥的參考依據(jù)，可指引醫(yī)師與病人是否適合使用標靶治療，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
【專利說明】大腸直腸癌相關(guān)基因K-ras基因突變檢測方法和相關(guān)檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及疾病相關(guān)基因突變檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地，涉及大腸直腸癌相關(guān)基因突變檢測方法【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是指一種大腸直腸癌相關(guān)基因K-ras基因突變檢測方法和相關(guān)檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]目前癌癥治療除了化學治療、手術(shù)切除、放射療法等方式外，還有針對癌細胞進行攻擊的標祀治療(Target therapy)。標祀治療是利用癌細胞中獨特的結(jié)構(gòu)或分子，以專一性的藥物攻擊這些特殊結(jié)構(gòu)進而殺死癌細胞。最重要的是，標靶藥物較不會攻擊正常細胞，對正常細胞傷害較小，可減少許多副作用(如白血球、血小板降低、貧血、嘔吐、掉頭發(fā)等現(xiàn)象)，也可抑制癌細胞增長、轉(zhuǎn)移與抗藥性的惡性轉(zhuǎn)化能力。標靶治療也是近年來癌癥治療的新趨勢，也是醫(yī)學界最熱門的研究重點，許多以此為目標的臨床試驗研究正持續(xù)進行中。[0003]根據(jù)研究顯示大腸直腸癌的發(fā)生與其中癌細胞表皮生長因子受體表現(xiàn)有關(guān)，目前使用在大腸直腸癌的標靶藥物有可與腫瘤細胞表皮生長因子受體(EGFR)結(jié)合，進而抑制EGFR作用的IgGl單株抗體的Cetuximab ( Erbitux? )及IgG2kappa單株抗體的Panitumumab ( Vectibix? ).其原理是它可以專一性地與EGFR結(jié)合，競爭性的抑制表皮生長因子的功能，使得癌細胞無法進行復制、繁殖與血管再生，誘發(fā)癌細胞走向死亡。EGFR，全名為Epidermal Growth Factor Receptor,中文名稱為表皮細胞生長因子受體,是存在癌細胞和正常細胞膜表面的蛋白質(zhì)，可傳遞細胞外生長、增殖以及抗亡的致癌訊號至細胞內(nèi)，有可能會促成癌癥的快速生長、轉(zhuǎn)移與抗藥性，患者的病況因而惡化。K-ras是EGFR下游的調(diào)控因子，為ras致癌基因家族成員之一，當K-ras基因發(fā)生突變時，會引起一系列的蛋白質(zhì)磷酸化，造成更多細胞核轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，促使癌細胞過量的成長分裂。大部份的K-Ras基因的突變發(fā)生在第13號密碼子。
[0004]由于每個病患間基因型態(tài)的差異對同樣的標靶藥物會產(chǎn)生不同的反應(yīng)，而影響治療效果。用藥前的基因檢測，可幫助醫(yī)師與病患了解是否適合使用標靶治療，量身訂作個人化治療，挑選適當藥物，更有助于增加標靶治療的專一療效而達到更佳的治療效果。大腸癌的標祀藥物Cetuximab/Panitumumab是針對EGFR進行抑制,將其阻斷,停止后續(xù)一連串的癌細胞進展，個人基因型態(tài)的差異會影響標靶藥物抑制EGFR機制的作用結(jié)果。
[0005]大腸直腸癌與標靶藥物之臨床研究已有許多期刊報告可尋，相關(guān)新聞亦可利用搜尋網(wǎng)站鍵入“大腸癌標靶治療”關(guān)鍵詞搜尋。Lievre等人于2008年在J Clin Oncol期刊發(fā)表有關(guān)大腸直腸癌第一線化療失敗后，投與Cetuximab的研究指出:K_ras突變型對Cetuximab具有抗藥性,而且療效反應(yīng)較差。再一次確認了 Cetuximab在K_ras野生型才具
有療效。結(jié)論簡報于下表:
[0006]
【權(quán)利要求】
1.一種大腸直腸癌相關(guān)基因κ-ras基因突變檢測方法，其特征在于，包括步驟: a.提取腫瘤組織的基因組DNA; b.根據(jù)K-ras基因的包含第13號密碼子的核苷酸序列設(shè)計一對PCR引物對，并設(shè)計一條與所述第13號密碼子的突變核苷酸序列匹配的TaqMan MGB熒光探針，對所述基因組DNA進行熒光定量PCR ； c.同時以含有所述的K-ras基因的包含第13號密碼子的核苷酸序列的陰性對照以及含有所述的K-ras基因的包含第13號密碼子的核苷酸序列且所述第13號密碼子為所述突變核苷酸序列的陽性對照為模板，采用所述PCR引物對和所述TaqMan MGB熒光探針進行熒光定量PCR ； d.將對所述基因組DNA進行的所述熒光定量PCR中收集的熒光信號而形成的實時擴增曲線與對所述陰性對照和所述陽性對照進行的所述熒光定量PCR中收集的熒光信號而形成的實時擴增曲線分別進行比較分析，從而鑒定所述基因組DNA中是否發(fā)生突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸直腸癌相關(guān)基因K-ras基因突變檢測方法，其特征在于，所述PCR引物對是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列，所述TaqMan MGB熒光探針具有的核苷酸序列是SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列或SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸直腸癌相關(guān)基因K-ras基因突變檢測方法，其特征在于，所述陰性對照為陰性對照質(zhì)粒 ，所述陰性對照質(zhì)粒的插入片段為SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列，所述陽性對照為陽性對照質(zhì)粒，所述陽性對照質(zhì)粒的插入片段為SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸直腸癌相關(guān)基因K-ras基因突變檢測方法，其特征在于，如果對所述基因組DNA進行的所述熒光定量PCR中收集的熒光信號而形成的實時擴增曲線與對所述陰性對照進行的所述熒光定量PCR中收集的熒光信號而形成的實時擴增曲線一致，則所述基因組DNA中未發(fā)生突變；如果對所述基因組DNA進行的所述熒光定量PCR中收集的熒光信號而形成的實時擴增曲線與對所述陽性對照進行的所述熒光定量PCR中收集的熒光信號而形成的實時擴增曲線一致，則所述基因組DNA中發(fā)生突變。
5.一種大腸直腸癌相關(guān)基因K-ras基因突變檢測試劑盒，其特征在于，包括引物容器、熒光探針容器、陰性對照容器和陽性對照容器，所述引物容器內(nèi)具有根據(jù)K-ras基因的包含第13號密碼子的核苷酸序列設(shè)計的PCR引物對干燥粉末或溶液，所述熒光探針容器內(nèi)具有與所述第13號密碼子的突變核苷酸序列匹配的TaqMan MGB熒光探針干燥粉末或溶液，所述陰性對照容器包括含有所述的K-ras基因的包含第13號密碼子的核苷酸序列的陰性對照干燥粉末或溶液，所述陽性對照容器包括含有所述的K-ras基因的包含第13號密碼子的核苷酸序列且所述第13號密碼子為所述突變核苷酸序列的陽性對照干燥粉末或溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的大腸直腸癌相關(guān)基因K-ras基因突變檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR引物對是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列，所述TaqMan MGB突光探針具有的核苷酸序列是SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列或SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的大腸直腸癌相關(guān)基因K-ras基因突變檢測試劑盒，其特征在于，所述陰性對照為陰性對照質(zhì)粒，所述陰性對照質(zhì)粒的插入片段為SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列， 所述陽性對照為陽性對照質(zhì)粒，所述陽性對照質(zhì)粒的插入片段為SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。
【文檔編號】G01N21/64GK103923971SQ201310011985
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2013年1月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月11日
【發(fā)明者】趙翊均, 白小萍, 陸群 申請人:上海基康生物技術(shù)有限公司, 上?？灯谏锟萍加邢薰?br>