專利名稱：一種快速檢測瘦肉精無標(biāo)記免疫傳感器的制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速檢測瘦肉精的無標(biāo)記免疫傳感器的制備方法和應(yīng)用。具體是基于金一硫化銀(Au-Ag2S)核殼納米復(fù)合材料構(gòu)建的快速檢測瘦肉精的無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器，屬于新型納米功能材料與生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
電化學(xué)免疫傳感器由于其靈敏度高、特異性好、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、環(huán)境分析、藥物分析、食品安全檢測等領(lǐng)域。制備性能優(yōu)越的電化學(xué)免疫傳感器，其最關(guān)鍵技術(shù)就是免疫分子的有效固定和靈敏度、重現(xiàn)性及持久性等性能的提高。
金(Au)納米粒子由于具有比表面積大、易于多種生物分子(核酸、蛋白質(zhì)和生物分子等)結(jié)合、對人體無害等特點(diǎn)，已被大量應(yīng)用于免疫傳感器的研究。硫化銀(Ag2S)納米粒子是一種半導(dǎo)體納米材料，由于其表面富含巰基，而易于與生物分子相結(jié)合，但Ag2S納米粒子單獨(dú)制備成核不均勻。本發(fā)明利用層層自組裝技術(shù)，制備的金一硫化銀(Au-Ag2S)核殼納米粒子分布均勻，比表面積顯著增加，而且更易于與生物分子相結(jié)合，因此非常有利于制備電化學(xué)生物傳感器。
瘦肉精是一類叫做β —興奮劑(β-agonist)的藥物,而不是某一種特定的藥物。 這類藥物具有實(shí)現(xiàn)促進(jìn)瘦肉生長、抑制肥肉生長的功能，所以統(tǒng)稱為“瘦肉精”。在我國， 通常所說的瘦肉精是指克倫特羅(Clenbuterol)，而普通消費(fèi)者則把此類藥物統(tǒng)稱為瘦肉精。當(dāng)它們以超過治療劑量5 — 10倍的用量用于畜禽飼養(yǎng)時(shí)，即有顯著的營養(yǎng)“再分配效應(yīng)”——促進(jìn)動物體蛋白質(zhì)沉積和脂肪分解，抑制脂肪沉積，能顯著提高胴體的瘦肉率、增重和提高飼料轉(zhuǎn)化率，因此曾被用作牛、羊、豬等畜禽的促生長劑、飼料添加劑。
根據(jù)國務(wù)院食品安全委員會辦公室《“瘦肉精”專項(xiàng)整治方案》(食安辦〔2011〕 14號)規(guī)定的“瘦肉精”品種目錄為16種，包括萊克多巴胺(Ractopamine);克倫特羅 (Clenbuterol);沙丁胺醇(Salbutamol);硫酸沙丁胺醇(Salbutamol Sulfate);鹽酸多巴胺(Dopamine Hydrochloride);西馬特羅(Cimaterol);硫酸特布他林(Terbutaline Sulfate);苯乙醇胺 A (Phenylethanolamine A);班布特羅(Bambuterol);鹽酸齊帕特羅(Zilpaterol Hydrochloride);鹽酸氯丙那林(Clorprenaline Hydrochloride);馬布特羅(Mabuterol);西布特羅(Cimbuterol);溴布特羅(Brombuterol);酒石酸阿福特羅 (Arformoterol Tartrate);富馬酸福莫特羅(Formoterol Fumatrate)。
瘦肉精可以提高豬的瘦肉率，帶來更多經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但它有很危險(xiǎn)的副作用，當(dāng)攝入量較大時(shí)，會造成心血管系統(tǒng)的損壞，并可能出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀。針對瘦肉精中毒事件頻發(fā)這一嚴(yán)重現(xiàn)象，2001年12月27日、2002年2月9日、4月9日，農(nóng)業(yè)部分別下發(fā)文件禁止食品動物禁止使用β —興奮劑類藥物作為飼料添加劑(農(nóng)業(yè)部176號、193號公告、1519號條例)。
檢測瘦肉精的方法有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜一質(zhì)譜法(GC-MS)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)。這些方法，雖具有一定的靈敏度，但存 在如下問題，限制了這些方法在實(shí)際應(yīng)用中的推廣1.高效液相色譜法(HPLC):優(yōu)點(diǎn)是適合檢測熱不穩(wěn)定和強(qiáng)極性的β —興奮劑及其代謝產(chǎn)物，專屬性好、選擇性強(qiáng)、檢測精確度較高，可與質(zhì)譜(MS)等系統(tǒng)聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)分析過程的自動化，我國已將HPLC法作為檢測克倫特羅殘留的半確證性方法，最低檢測限范圍為I 15 ng · g-1 ;缺點(diǎn)是樣品處理時(shí)間長，檢測過程煩瑣、難于操作，而且儀器貴重，在實(shí)際應(yīng)用中受到一定的限制。
2.氣相色譜一質(zhì)譜法(GC-MS):優(yōu)點(diǎn)是通過把色譜高效快速的分離效果和質(zhì)譜高靈敏度的定性分析有機(jī)合起來，能在多種殘留物同時(shí)存在的情況下對某種特定的殘留物進(jìn)行定性、定量分析，與HPLC法相比，該法檢測靈敏度更高，假陽性率更低，我國將GC-MS法定為檢測克倫特羅的確證性方法；缺點(diǎn)是儀器設(shè)備復(fù)雜、操作過程繁瑣，對檢驗(yàn)人員的操作技能要求很高，且不適于現(xiàn)場和快速檢測。
3.酶聯(lián)免疫法(ELISA):優(yōu)點(diǎn)是通過利用免疫學(xué)抗原抗體特異性結(jié)合和酶的高效催化作用，用目測法或比色法檢測樣品中的瘦肉精含量，因此該法選擇性強(qiáng)、特異性好；缺點(diǎn)是步驟繁多，檢測誤差較大。
為了解決上述問題，本發(fā)明采用以納米復(fù)合材料構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器檢測瘦肉精。電化學(xué)免疫傳感器的制備過程中，關(guān)鍵因素就是電極修飾材料，貴金屬納米材料和貴金屬半導(dǎo)體納米材料由于其具有大的比表面積、性能穩(wěn)定及優(yōu)良的生物相容性、導(dǎo)電性等特點(diǎn)，成為組裝電化學(xué)免疫傳感器的優(yōu)選材料。本發(fā)明通過在納米Au核上生成納米八&5半導(dǎo)體殼層，制備了兼具二者特性、體現(xiàn)出優(yōu)異的協(xié)同增敏效果的核殼結(jié)構(gòu)的Au-Ag2S納米復(fù)合材料，將其用于制備電化學(xué)免疫傳感器，進(jìn)一步提高了其電極表面的電子傳遞效率和抗體的吸附量，顯著提高了檢測的靈敏度。本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種簡單、快速、特異性好和靈敏度高的電化學(xué)免疫傳感器和相應(yīng)的電化學(xué)免疫分析方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目之一在于避免現(xiàn)有檢測方法中存在的儀器設(shè)備復(fù)雜、操作過程繁瑣及對檢驗(yàn)人員的技能要求高等缺點(diǎn)，提供了一種快速檢測瘦肉精無標(biāo)記免疫傳感器的制備方法，所制備的傳感器具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，且制備簡單、操作方便，可用于瘦肉精的快速靈敏檢測；本發(fā)明的目的之二在于提供一種簡單、特異、靈敏、快速、高效地檢測豬肉、牛肉和羊肉中瘦肉精的檢測方法。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下1.本發(fā)明所述的一種快速檢測瘦肉精無標(biāo)記免疫傳感器的制備方法，其制備步驟為 以玻碳電極為工作電極，在電極表面修飾Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料一殼聚糖溶液，再以瘦肉精抗體溶液進(jìn)行修飾，最后滴涂牛血清白蛋白溶液，封閉電極表面非特異性活性位點(diǎn)； 所述Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料一殼聚糖溶液，Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料與殼聚糖的質(zhì)量比為1: 4 9 ;所述Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料， Au和Ag2S的質(zhì)量比為3. 4 8. O :1,其制備步驟為將Au-Ag納米粒子離心后，重新分散在O.1 mo I · Γ1的CTAB中，加入100 mL硫前驅(qū)體溶液，震蕩I 3 min后，靜置I 2 h，離心分離后，去除上清液，在50 °C下真空干燥，制得Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料。
所述的一種快速檢測瘦肉精無標(biāo)記免疫傳感器的制備方法，更具體和優(yōu)選的制備方法為(I) Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料的制備1)在250mL I mmol · L-1氯金酸溶液中加入60 mL 10 mmol ·廠1冰點(diǎn)一硼氫酸鈉溶液，攪拌Ih后，稀釋10倍，制得納米Au種子；2)在150mL I mmol *L_1氯金酸溶液中滴加O.1 mo I *L_1抗壞血酸至無色,再加入步驟I)中的Au種子5滴，靜置2 h，制得Au納米粒子；3)將步驟2)中制得的Au納米粒子離心后，重新分散在300mL O.1 mo I · Γ1的CTAB 中，依次加入 30 mL 0.1 mo I · L 1 抗壞血酸，3 7 mL 0. 01 mo I · L 1 AgNO3, 30 mL 0.1 mo I · L-1 NaOH水溶液，振蕩I min，靜置I h，制得核殼結(jié)構(gòu)的Au-Ag納米粒子；4)將步驟3)中制得的Au-Ag納米粒子離心后，重新分散在300mL 0.1 mo I · Γ1的 CTAB中，加入100 mL硫前驅(qū)體溶液，震蕩I 3 min后，靜置I 2 h，離心分離后，去除上清液，50 °C下真空干燥，制得Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料，Au和Ag2S的質(zhì)量比為3. 4 8. O I ;所述氯金酸、硼氫酸鈉、抗壞血酸、AgNO3和NaOH的水溶液，均使用超純水配制；所述冰點(diǎn)一硼氫酸鈉溶液，制備方法是將預(yù)裝硼氫酸鈉溶液的試管置于冰塊中冷卻3-4 min，取出試管制備硼氫酸鈉溶液后，再將試管放入冰塊中冷卻一段時(shí)間；所述硫前驅(qū)體溶液，制備方法是將硫化鈉溶液中加入硫粉，置于反應(yīng)釜中80°C加熱2h 至硫粉全部溶解。
(2)Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料一殼聚糖溶液的制備將殼聚糖加入到體積分?jǐn)?shù)為 I %的醋酸中攪拌6 h，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 3 0. 7 %的殼聚糖溶液；取3 mg Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料，重新分散在4 mL殼聚糖溶液中，Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料與殼聚糖的質(zhì)量比為1: 4 9。
(3)玻碳電極的處理將直徑4 mm的玻碳電極依次用1. 0、0. 3和0. 05 Mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，使玻碳電極表面呈鏡面。
(4)電極表面修飾在玻碳電極表面滴涂6 UL Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料一殼聚糖溶液，放于4 V冰箱中，晾干成膜；超純水清洗，再滴涂6 yL瘦肉精抗體溶液，放于4 V冰箱中，晾干成膜；超純水清洗后，放于4 V冰箱中保存使用；所述瘦肉精抗體溶液，制備方法為將瘦肉精抗體原液加入pH為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液定容，放于4 V冰箱中保存使用。
(5)封閉電極表面非特 異性活性位點(diǎn)取6 μ L牛血清白蛋白溶液滴涂在(4)所制備電極表面，4 V冰箱中，晾干成膜，超純水清洗，制得所述的快速檢測瘦肉精無標(biāo)記免疫傳感器，放于4 V冰箱中保存使用；所述牛血清白蛋白溶液，制備方法為將牛血清白蛋白原液加入PH為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液定容，放于4 V冰箱中保存使用。
2.本發(fā)明所述的一種快速檢測瘦肉精無標(biāo)記免疫傳感器的制備方法，所述的免疫傳感器應(yīng)用于瘦肉精檢測，其檢測步驟為(I)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制配制一組包括空白標(biāo)樣在內(nèi)的不同濃度的瘦肉精標(biāo)準(zhǔn)溶液，底液為PH 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液。
(2)工作電極修飾將本發(fā)明所述的快速檢測瘦肉精無標(biāo)記免疫傳感器作為工作電極，將步驟(I)中配制的不同濃度的瘦肉精標(biāo)準(zhǔn)溶液分別滴涂到工作電極表面，放于4 V冰箱中保存使用。
(3)工作曲線繪制將飽和甘汞電極作為參比電極，鉬絲電極作為輔助電極，與步驟(2)所修飾好的工作電極組成三電極系統(tǒng)，連接電化學(xué)工作站，在K3 [Fe (CN) 6]溶液中，用方波伏安法(SWV)在-O. 6 O. 2 V電壓范圍內(nèi)進(jìn)行檢測，空白標(biāo)樣的響應(yīng)電流記為Jtl, 含有不同濃度的瘦肉精標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)電流記作Λ，響應(yīng)電流降低的差值為Λ J = I0-1i, ΔJ與瘦肉精標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度C之間成線性關(guān)系，繪制Λ/ - C工作曲線。
(4)瘦肉精的檢測用待測樣品代替步驟(I)中的瘦肉精標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照步驟(2) 和(3)中的方法進(jìn)行檢測，根據(jù)響應(yīng)電流降低的差值△ J和工作曲線，得到待測樣品中瘦肉精的含量。
所述K3 [Fe (CN) 6]溶液的濃度為 5 mmol · L—1。
所述pH 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液的濃度為67 mmol · L'
所述瘦肉精選自下列之一萊克多巴胺、克倫特羅、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、鹽酸多巴胺、西馬特羅、硫酸特布他林、苯乙醇胺A、班布特羅、鹽酸齊帕特羅、鹽酸氯丙那林、馬布特羅、西布特羅、溴布特羅、酒石酸阿福特羅、富馬酸福莫特羅。
本發(fā)明的有益成果(I)本發(fā)明所述免疫傳感器制備簡單，操作方便，并通過納米材料的增效和增敏作用， 可實(shí)現(xiàn)對實(shí)際樣品的快速、靈敏、高選擇性檢測，具有市場發(fā)展前景。
(2)本發(fā)明首次將Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料應(yīng)用于電化學(xué)免疫傳感器的制備，所述的Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料導(dǎo)電性強(qiáng)于納米Au或納米Ag，電信號得到更強(qiáng)發(fā)大；外層 Ag2S增強(qiáng)了對生物分子的吸附和固載，顯著提高了電化學(xué)免疫傳感器的靈敏度、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性；并且該材料帶有明顯藍(lán)色，可進(jìn)一步應(yīng)用到檢測試紙中，具有更大的發(fā)展?jié)摿Α?br>

圖1為一種快速檢測瘦肉精無標(biāo)記免疫傳感器的制備方法示意圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 一種快速檢測瘦肉精無標(biāo)記免疫傳感器的制備方法(I)玻碳電極的處理將直徑4 mm的玻碳電極依次用1. 0、0. 3和O. 05 Mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，使玻碳電極表面呈鏡 面。
(2) Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料的制備1)在250mL I mmol · L-1氯金酸溶液中加入60 mL 10 mmol ·廠1冰點(diǎn)一硼氫酸鈉溶液，攪拌Ih后，稀釋10倍，制得納米Au種子；2)在150mL I mmol *L_1氯金酸溶液中滴加0.1 mo I *L_1抗壞血酸至無色,再加入步驟I)中的Au種子5滴，靜置2 h，制得Au納米粒子；3)將步驟2)中制得的Au納米粒子離心后，重新分散在300mL 0.1 mo I · Γ1的CTAB 中，依次加入 30 mL 0.1 mol *L 1 抗壞血酸，3 mL 0. 01 mol *L 1 AgNO3, 30 mL 0.1 mo I *L 1NaOH水溶液，振蕩I min，靜置I h，制得核殼結(jié)構(gòu)的Au-Ag納米粒子；4)將步驟3)中制得的Au-Ag納米粒子離心后，重新分散在300 mL O.1 mol · Γ1的 CTAB中，加入100 mL硫前驅(qū)體溶液，震蕩I 3 min后，靜置I 2 h，離心分離后，去除上清液，50 °C下真空干燥，制得Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料，Au和Ag2S的質(zhì)量比為3. 4 :1 ； 所述氯金酸、硼氫酸鈉、抗壞血酸、AgNO3和NaOH的水溶液，均使用超純水配制；所述冰點(diǎn)一硼氫酸鈉溶液，制備方法是將預(yù)裝硼氫酸鈉溶液的試管置于冰塊中冷卻3-4 min，取出試管制備硼氫酸鈉溶液后，再將試管放入冰塊中冷卻一段時(shí)間；所述硫前驅(qū)體溶液，制備方法是將硫化鈉溶液中加入硫粉，置于反應(yīng)釜中80°C加熱2h 至硫粉全部溶解。
(3)Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料一殼聚糖溶液的制備將殼聚糖加入到體積分?jǐn)?shù)為 I %的醋酸中攪拌6 h，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)O. 3 %的殼聚糖溶液；取3 mg Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料，重新分散在4 mL殼聚糖溶液中，Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料與殼聚糖的質(zhì)量比為1:4。
(4)瘦肉精抗體溶液的制備將瘦肉精抗體原液加入pH為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液定容，放于4 V冰箱中保存使用。
(5)牛血清白蛋白溶液的制備將牛血清白蛋白原液加入pH為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液定容，放于4 V冰箱中保存使用。
(6)電極表面修飾按照圖1所示步驟，在玻碳電極表面滴涂6 μ L Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料一殼聚糖溶液，放于4 V冰箱中，晾干成膜；超純水清洗，再滴涂6 yL瘦肉精抗體溶液，放于4 V冰箱中，晾干成膜；超純水清洗后，放于4 V冰箱中保存使用。
(7)封閉電極表面非特異性活性位點(diǎn)按照圖1所示步驟，取6 μ L牛血清白蛋白溶液滴涂在(6)所制備電極表面，4 V冰箱中，晾干成膜，超純水清洗，制得所述的快速檢測瘦肉精無標(biāo)記免疫傳感器，放于4 V冰箱中保存使用。
實(shí)施例2 —種快速檢測瘦肉精無標(biāo)記免疫傳感器的制備方法(I)玻碳電極的處理同實(shí)施例1。
(2) Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料的制備1)在250mL I mmol · L-1氯金酸溶液中加入60 mL 10 mmol ·廠1冰點(diǎn)一硼氫酸鈉溶液，攪拌Ih后，稀釋10倍，制得納米Au種子；2)在150mL I mmol *L _1氯金酸溶液中滴加O.1 mol *L_1抗壞血酸至無色,再加入步驟I)中的Au種子5滴，靜置2 h，制得Au納米粒子；3)將步驟2)中制得的Au納米粒子離心后，重新分散在300mL 0.1 mol · Γ1的CTAB 中，依次加入 30 mL 0.1 mol *L 1 抗壞血酸，5 mL 0. 01 mol *L 1 AgNO3, 30 mL 0.1 mol *L 1 NaOH水溶液，振蕩I min，靜置I h，制得核殼結(jié)構(gòu)的Au-Ag納米粒子；4)將步驟3)中制得的Au-Ag納米粒子離心后，重新分散在300mL 0.1 mol · Γ1的 CTAB中，加入100 mL硫前驅(qū)體溶液，震蕩I 3 min后，靜置I 2 h，離心分離后，去除上清液，50 °C下真空干燥，制得Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料，Au和Ag2S的質(zhì)量比為4. 8 :1 ;(3)Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料一殼聚糖溶液的制備將殼聚糖加入到體積分?jǐn)?shù)為I % 的醋酸中攪拌6 h，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5 %的殼聚糖溶液；取3 mg Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料， 重新分散在4 mL殼聚糖溶液中，Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料與殼聚糖的質(zhì)量比為1: 6。
(4)瘦肉精抗體溶液的制備同實(shí)施例1。
(5)牛血清白蛋白溶液的制備同實(shí)施例1。
(6)電極表面修飾同實(shí)施例1。
(7)封閉電極表面非特異性活性位點(diǎn)同實(shí)施例1。
實(shí)施例3 —種快速檢測瘦肉精無標(biāo)記免疫傳感器的制備方法，如圖1所示 (I)玻碳電極的處理同實(shí)施例1。
(2) Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料的制備1)在250mL I mmol · L-1氯金酸溶液中加入60 mL 10 mmol ·廠1冰點(diǎn)一硼氫酸鈉溶液，攪拌Ih后，稀釋10倍，制得納米Au種子；2)在150mL I mmol *L_1氯金酸溶液中滴加O.1 mol *L_1抗壞血酸至無色,再加入步驟I)中的Au種子5滴，靜置2 h，制得Au納米粒子；3)將步驟2)中制得的Au納米粒子離心后，重新分散在300mL O.1 mol · Γ1的CTAB 中，依次加入 30 mL 0.1 mol *L 1 抗壞血酸，7 mL 0. 01 mol *L 1 AgNO3, 30 mL 0.1 mol *L 1 NaOH水溶液，振蕩I min，靜置I h，制得核殼結(jié)構(gòu)的Au-Ag納米粒子；4)將步驟3)中制得的Au-Ag納米粒子離心后，重新分散在300mL 0.1 mol · Γ1的 CTAB中，加入100 mL硫前驅(qū)體溶液，震蕩I 3 min后，靜置I 2 h，離心分離后，去除上清液，50 °C下真空干燥，制得Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料，Au和Ag2S的質(zhì)量比為8. O :1 ;(3)Au-Ag2S核殼納米復(fù)合 材料一殼聚糖溶液的制備將殼聚糖加入到體積分?jǐn)?shù)為I % 的醋酸中攪拌6 h，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.7 %的殼聚糖溶液；取3 mg Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料， 重新分散在4 mL殼聚糖溶液中，Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料與殼聚糖的質(zhì)量比為1: 9。
(4)瘦肉精抗體溶液的制備同實(shí)施例1。
(5)牛血清白蛋白溶液的制備同實(shí)施例1。
( 6 )電極表面修飾同實(shí)施例1。
(7)封閉電極表面非特異性活性位點(diǎn)同實(shí)施例1。
實(shí)施例4 上述實(shí)施例1 一 3所制備的免疫傳感器，用于瘦肉精的檢測，步驟如下(I)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制配制一組包括空白標(biāo)樣在內(nèi)的不同濃度的瘦肉精標(biāo)準(zhǔn)溶液，底液為 PH 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液。
(2)工作電極修飾將本發(fā)明所述的快速檢測瘦肉精無標(biāo)記免疫傳感器作為工作電極，將步驟(I)中配制的不同濃度的瘦肉精標(biāo)準(zhǔn)溶液分別滴涂到工作電極表面，放于4 V冰箱中保存使用。
(3)工作曲線繪制將飽和甘汞電極作為參比電極，鉬絲電極作為輔助電極，與步驟(2)所修飾好的工作電極組成三電極系統(tǒng)，連接電化學(xué)工作站，在K3 [Fe (CN) 6]溶液中，用方波伏安法(SWV)在-0.6 0.2 V電壓范圍內(nèi)進(jìn)行檢測，空白標(biāo)樣的響應(yīng)電流記為Jtl, 含有不同濃度的瘦肉精標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)電流記作Λ，響應(yīng)電流降低的差值為Λ J = I0-1i, ΔJ與瘦肉精標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度C之間成線性關(guān)系，繪制Λ/ - C工作曲線。
(4)瘦肉精的檢測用待測樣品代替步驟(I)中的瘦肉精標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照步驟(2) 和(3)中的方法進(jìn)行檢測，根據(jù)響應(yīng)電流降低的差值△ J和工作曲線，得到待測樣品中瘦肉精的含量。
所述 K3 [Fe (CN) 6]溶液的濃度為 5 mmol · L—1。所述pH 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液的濃度為67 mmol · L'所述瘦肉精選自下列之一萊克多巴胺、克倫特羅、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、鹽酸多巴胺、西馬特羅、硫酸特布他林、苯乙醇胺A、班布特羅、鹽酸齊帕特羅、鹽酸氯丙那林、馬布特羅、西布特羅、溴布特羅、酒石酸阿福特羅、富馬酸福莫特羅。本發(fā)明所制備的免疫傳感器檢測16種瘦肉精的技術(shù)指標(biāo)見表I。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測瘦肉精無標(biāo)記免疫傳感器的制備方法，其特征在于，制備步驟為以玻碳電極為工作電極，在電極表面修飾Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料一殼聚糖溶液，再以瘦肉精抗體溶液進(jìn)行修飾，最后滴涂牛血清白蛋白溶液，封閉電極表面非特異性活性位點(diǎn)。
2.如權(quán)利要求1所述的一種快速檢測瘦肉精無標(biāo)記免疫傳感器的制備方法，其特征在于，所述Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料一殼聚糖溶液，Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料與殼聚糖的質(zhì)量比為1: 4 9。
3.如權(quán)利要求1所述的一種快速檢測瘦肉精無標(biāo)記免疫傳感器的制備方法，其特征在于所述Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料，Au和Ag2S的質(zhì)量比為3. 4 8. O :1,其制備步驟為 將Au-Ag納米粒子離心后，重新分散在O.1 mo l · Γ1的CTAB中，加入100 mL硫前驅(qū)體溶液，震蕩I 3 min后，靜置I 2 h，離心分離后，去除上清液，在50 °C下真空干燥，制得 Au-Ag2S核殼納米復(fù)合材料。
4.如權(quán)利要求1所述的一種快速檢測瘦肉精無標(biāo)記免疫傳感器的制備方法，其特征在于，所述的免疫傳感器應(yīng)用于瘦肉精的檢測，其檢測步驟為(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制配制一組包括空白標(biāo)樣在內(nèi)的不同濃度的瘦肉精標(biāo)準(zhǔn)溶液，底液為 PH 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液；(2)工作電極修飾將本發(fā)明所述的快速檢測瘦肉精的無標(biāo)記免疫傳感器作為工作電極，將步驟(I)中配制的不同濃度的瘦肉精標(biāo)準(zhǔn)溶液分別滴涂到工作電極表面，4 V冰箱中保存；(3)工作曲線繪制將飽和甘汞電極作為參比電極，鉬絲電極作為輔助電極，與步驟(2)所修飾好的工作電極組成三電極系統(tǒng)，連接電化學(xué)工作站，在K3 [Fe (CN) 6]溶液中，用方波伏安法(SWV)在-0.6 0.2 V電壓范圍內(nèi)進(jìn)行檢測，空白標(biāo)樣的響應(yīng)電流記為Jtl，含有不同濃度的瘦肉精標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)電流記作Λ，響應(yīng)電流降低的差值為Λ J = I0-11, Λ J與瘦肉精標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度C之間成線性關(guān)系，繪制△/一C工作曲線；(4)瘦肉精的檢測用待測樣品代替步驟(I)中的瘦肉精標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照步驟(2)和(3) 中的方法進(jìn)行檢測，根據(jù)響應(yīng)電流降低的差值△/和工作曲線，得到待測樣品中瘦肉精的含量。
5.如權(quán)利要求1所述的一種快速檢測瘦肉精無標(biāo)記免疫傳感器的制備方法，其特征在于所述瘦肉精選自下列之一萊克多巴胺、克倫特羅、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、鹽酸多巴胺、西馬特羅、硫酸特布他林、苯乙醇胺Α、班布特羅、鹽酸齊帕特羅、鹽酸氯丙那林、馬布特羅、西布特羅、溴布特羅、酒石酸阿福特羅、富馬酸福莫特羅。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速檢測瘦肉精無標(biāo)記免疫傳感器的制備方法和應(yīng)用。瘦肉精是一類β－興奮劑的藥物，而不是某一種特定的藥物，此類藥物具有實(shí)現(xiàn)促進(jìn)瘦肉生長、抑制肥肉生長的功能，但副作用極大，當(dāng)攝入量較大時(shí)，會造成心血管系統(tǒng)的損壞，并可能出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀。本發(fā)明使用綜合了納米金和納米硫化銀優(yōu)良特性的金-硫化銀核殼結(jié)構(gòu)納米復(fù)合材料修飾電極，很好的固載了瘦肉精抗體，從而制備了一種成本低、靈敏度高、特異性好、檢測快速、制備簡單的檢測肉類樣品中瘦肉精的無標(biāo)記免疫傳感器。
文檔編號G01N27/327GK103063833SQ20131002615
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月21日
發(fā)明者張勇, 魏琴, 吳丹, 李賀, 杜斌, 王志玲, 馬洪敏, 龐雪輝, 李慧芝, 羅川南, 范大偉, 其他發(fā)明人請求不公開姓名 申請人:濟(jì)南大學(xué)