專利名稱：一種質(zhì)譜法檢測(cè)非小細(xì)胞型肺癌放療毒副作用相關(guān)多態(tài)性位點(diǎn)基因型的引物組及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明設(shè)計(jì)一種基因多態(tài)性的質(zhì)譜檢測(cè)的多核苷酸及方法，特別是涉及質(zhì)譜法檢測(cè)非小細(xì)胞型肺癌放療毒副作用相關(guān)基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型的引物組及方法。
背景技術(shù)：
單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP),主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500 1000個(gè)堿基對(duì)中就有I個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬(wàn)個(gè)甚至更多。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個(gè)堿基的變異，這種變異可由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換(transition)或顛換(transversion)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。一般而言，SNP是指變異頻率大于1%的單核苷酸變異。SNP成為第三代遺傳標(biāo)志，人體許多表型差異、對(duì)疾病、毒物的易感性與耐受性，疾病臨床表現(xiàn)的多樣性(clinical phenotype diversity),以及對(duì)藥物治療的反應(yīng)性上都起著重要的作用。放射療法是用X線，Y高能電子束等放射線照射在癌組織，由于放射線的生物學(xué)作用，能最大量的殺傷癌組織，破壞癌組織，使其縮小。其原理是依據(jù)大量的放射線所帶的能量可破壞細(xì)胞的染色體，使細(xì)胞生長(zhǎng)停止。所以可用于對(duì)抗快速生長(zhǎng)分裂的癌細(xì)胞。放射線治療最常作為直接或輔助治療癌癥的方式。它作為治療惡性腫瘤的一個(gè)重要手段，對(duì)于許多癌癥可以產(chǎn)生較好效果，但是放療會(huì)產(chǎn)生放射性肺炎、放射性食管炎，以及食欲下降、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉或便秘等諸多毒副反應(yīng)。針對(duì)非小細(xì) 胞型肺癌，通常與化療合并治療腫瘤。在肺部腫瘤的放射治療中，肺組織往往會(huì)受到一定劑量的照射，造成不同程度的放射損傷。肺放射損傷所產(chǎn)生的并發(fā)癥一急性放射性肺炎和放射性肺纖維化，是胸部腫瘤放射治療劑量的限制因素。動(dòng)物試驗(yàn)顯示，給予全肺根治劑量照射后，在數(shù)周至數(shù)月內(nèi)將產(chǎn)生明顯的肺內(nèi)充血、肺泡間質(zhì)水腫、肺泡內(nèi)充滿滲出液。隨后是炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡上皮細(xì)胞脫落。數(shù)周后，間質(zhì)肺水腫轉(zhuǎn)變?yōu)槟z原纖維，肺泡間隔增厚，結(jié)果造成氣體交換障礙。在淋巴瘤、縱隔腫瘤肺癌和乳腺癌的放射治療中，約5 15%的患者出現(xiàn)放射性肺炎的臨床癥狀，常表現(xiàn)為低熱、咳嗽、胸悶，重者可出現(xiàn)呼吸困難、胸痛、持續(xù)性干咳、痰中帶血、X光胸片可顯示與放射野一致的彌漫性片狀密度增高影，CT可顯示肺間質(zhì)密度增高的改變，當(dāng)超過耐受劑量時(shí)，可以產(chǎn)生嚴(yán)重的放射性肺炎，臨床癥狀嚴(yán)重，出現(xiàn)急性呼吸窘迫、高熱，?？蓪?dǎo)致患者死亡。患者度過急性期，肺炎癥狀會(huì)持續(xù)數(shù)月，但組織學(xué)改變將繼續(xù)發(fā)展，逐漸進(jìn)入肺纖維化期，在此階段仍易產(chǎn)生合并癥危及生命。食管受到照射后可引起放射性食道炎、粘膜潰瘍，患者出現(xiàn)胸骨后燒灼感、吞咽疼痛、食道狹窄、纖維化，導(dǎo)致吞咽困難，甚至食道穿孔而危及生命。Phillips等報(bào)告單次大劑量照射后，第3天食管的基底層就有空泡形成并缺乏有絲分裂，同時(shí)角化的鱗狀細(xì)胞層變薄。7 14天增生的基底細(xì)胞和再生上皮區(qū)域與完全剝脫的區(qū)域同時(shí)出現(xiàn)，21天后出現(xiàn)基底細(xì)胞層增生加速和鱗狀細(xì)胞層增厚，使管壁僵硬，失去彈性，管腔進(jìn)一步狹窄。文獻(xiàn)表明，人體相關(guān)基因的多態(tài)性位點(diǎn)的共有20個(gè)，相關(guān)基因及對(duì)應(yīng)的位置點(diǎn)為:IL6的多態(tài)性位置點(diǎn)為rsl80079、:rsll556218, PGTS的多態(tài)性位置點(diǎn)為rs5275、rs20417、rs689470, IL4R的多態(tài)性位置點(diǎn)為:rsl801275，ILlO的多態(tài)性位置點(diǎn)為:rsl800872，ILlORA的多態(tài)性位置點(diǎn)為rs3135932，ILlA的多態(tài)性位置點(diǎn)為rsl800587、rsl7561, IL8的多態(tài)性位置點(diǎn)為rs4073, TNFRSF1B的多態(tài)性位置點(diǎn)為rsl061622, MIF的多態(tài)性位置點(diǎn)為rs755622，N0S3的多態(tài)性位置點(diǎn)為rsl799983，IL4的多態(tài)性位置點(diǎn)為rs2070874, NFKBlA的多態(tài)性位置點(diǎn)為rs8904，IL13的多態(tài)性位置點(diǎn)為rs20541、rsl80925及其他基因?qū)?yīng)的多態(tài)位點(diǎn)等。相關(guān)基因的基因型可能是T/C型、G/T等類型，如果能確定多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，就可以實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療，從而實(shí)現(xiàn)治療效果的最優(yōu)化。文獻(xiàn)表明，炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子，其基因的單核苷酸多態(tài)性的個(gè)體差異，與放療導(dǎo)致的肺炎、食管炎敏感性相關(guān)。這些單核苷酸多態(tài)性的基因分型和個(gè)體對(duì)放射性療法引發(fā)的炎癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)幾率存在劑量效應(yīng)。綜上所訴，綜合治療時(shí)應(yīng)盡量選擇對(duì)所放療臟器毒性小的化療藥物，并針對(duì)病人使用合理個(gè)體化的放療劑量。目前人體多態(tài)性位點(diǎn)的基因型的檢測(cè)方法通常有直接測(cè)序法，液態(tài)芯片法等。其中，直接測(cè)序法的檢測(cè)成本較高，通量小；液態(tài)芯片法的特異性和準(zhǔn)確率高，但是需要針對(duì)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)探針和相應(yīng)的微球，成本高。因此，我們需要找到一種通量高，操作簡(jiǎn)便，成本低的方法，以求可以實(shí)現(xiàn)對(duì)非小細(xì)胞型肺癌放療毒副作用相關(guān)基因多態(tài)性的檢測(cè)
發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了非小細(xì)胞型肺癌放療毒副作用相關(guān)基因多態(tài)性的質(zhì)譜檢測(cè)的多核苷酸及方法。旨在解決現(xiàn)有技術(shù)通量低、成本高的問題。一種用于非小細(xì)胞型肺癌放療毒副作用相關(guān)基因多態(tài)性的質(zhì)譜檢測(cè)的多核苷酸引物組，包括擴(kuò)增引物對(duì)及其對(duì)應(yīng)的延伸引物，其特征在于，所述引物組選自下表組號(hào)對(duì)應(yīng)的引物組，可以是下表一組或兩組以上的引物組，擴(kuò)增引物對(duì)和延伸引物分別對(duì)應(yīng)為選取組號(hào)所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增引物對(duì)和延伸引物:
組號(hào)擴(kuò)增引物對(duì)_延伸引物_
1SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2SEQ ID NO:37
2SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4SEQ ID NO:38
3SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6SEQ ID NO:39
4SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8SEQ ID NO:40
5SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10SEQ ID NO:41
6SEQ ID NO:11 和 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:42
7SEQ ID NO:13 和 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:43
8SEQ ID NO:15 和 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:44
9SEQ ID NO:17 和 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:45
ip |seq id no:i9 和 seq id no:20 |seq id no:46 —
權(quán)利要求
1.一種用于非小細(xì)胞型肺癌放療毒副作用相關(guān)基因多態(tài)性的質(zhì)譜檢測(cè)的多核苷酸引物組，包括擴(kuò)增引物對(duì)及其對(duì)應(yīng)的延伸引物，其特征在于，所述引物組選自下表組號(hào)對(duì)應(yīng)的引物組，可以是下表一組或兩組以上的引物組，擴(kuò)增引物對(duì)和延伸引物分別對(duì)應(yīng)為選取組號(hào)所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增弓1物對(duì)和延伸引物: _
2.一種非小細(xì)胞型肺癌放療毒副作用相關(guān)基因多態(tài)性的質(zhì)譜檢測(cè)的多核苷酸的方法，步驟如下: (1)采集待檢全血樣本，提取基因組DNA； (2)向獲取的DNA中加入擴(kuò)增引物對(duì)進(jìn)行的基因，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；(3)使用SAP酶(堿性磷酸酶)處理擴(kuò)增產(chǎn)物，去除殘留在反應(yīng)體系中多余的脫氧核苷酸； (4)向經(jīng)過處理后的擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物加入延伸引物，進(jìn)行延伸反應(yīng)； (6)使用樹脂純化延伸產(chǎn)物； (7)將延伸產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到特制的芯片上； (8)將芯片放置于質(zhì)譜儀中進(jìn)行檢測(cè)，讀取并分析檢測(cè)數(shù)據(jù)，確認(rèn)樣本放療毒副作用相關(guān)基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，其特征在于:所述擴(kuò)增引物對(duì)為權(quán)利要求1引物組中的擴(kuò)增引物對(duì)，所述延伸引物為權(quán)利要求1引物組中的延伸引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的非小細(xì)胞型肺癌放療毒副作用相關(guān)基因多態(tài)性的質(zhì)譜檢測(cè)的多核苷酸的方法，其特征在于:完成步驟(I)后，將提取物分成兩組完成(2)至(8)項(xiàng)步驟，第一組中用于擴(kuò)增反應(yīng)和延伸反應(yīng)的的引物組是權(quán)利要求1引物組選自上表中組號(hào)2和或組號(hào)8中的引物組；第二組用用于擴(kuò)增反應(yīng)和衍生反應(yīng)的引物組是權(quán)利要求1引物組選自上表中除組號(hào)2和組號(hào)8之外的一組或兩組以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的非小細(xì)胞型肺癌放療毒副作用相關(guān)基因多態(tài)性的質(zhì)譜檢測(cè)的多核苷酸的方法，其特征在于:所述延伸反應(yīng)步驟所使用的原料是經(jīng)過質(zhì)量修飾的雙脫氧核苷三磷酸(d dNTP)。
全文摘要
本發(fā)明涉及質(zhì)譜法檢測(cè)非小細(xì)胞型肺癌放療毒副作用相關(guān)基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型的引物組及方法,引物組包括擴(kuò)增引物對(duì)和對(duì)應(yīng)的延伸引物，分別在檢測(cè)方法中做擴(kuò)增反應(yīng)和延伸反應(yīng)使用。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明的引物可有效檢測(cè)非小細(xì)胞型肺癌放療毒副作用相關(guān)基因的基因型，且檢測(cè)成本低；通量高，使用384孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可一次性對(duì)190例樣本同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)(除去對(duì)照孔)；準(zhǔn)確率高，不出現(xiàn)假陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果。
文檔編號(hào)G01N27/62GK103224981SQ20131002762
公開日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2013年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月24日
發(fā)明者張聰, 郝瑋, 陳然, 葉貴, 李小青, 周蕊, 梁超, 韓韜, 黃士昂, 涂贊兵, 陳忠, 方國(guó)偉 申請(qǐng)人:武漢康圣達(dá)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司