專(zhuān)利名稱(chēng)：一種水體及水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于材料化學(xué)和食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種水體及水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測(cè)方法，更具體涉及一種在磁性材料表面制備孔雀石綠的分子印跡材料，并應(yīng)用于養(yǎng)殖水體及水產(chǎn)品中痕量孔雀石綠的分離富集，結(jié)合拉曼增強(qiáng)技術(shù)進(jìn)行快速檢測(cè)孔雀石綠。
背景技術(shù)：
孔雀石綠(Malachite green , MG),為金屬光澤的深綠色結(jié)晶狀固體,屬于三苯甲烷類(lèi)染料，它可用作殺菌劑、驅(qū)蟲(chóng)劑。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)用來(lái)預(yù)防魚(yú)的水霉病、鰓霉病、小瓜蟲(chóng)病等，而且為了使鱗受損的魚(yú)延長(zhǎng)生命，在運(yùn)輸過(guò)程中和存放池內(nèi)也常用。具有高毒素、高殘留和致癌、致畸、致突變等副作用，因此美國(guó)、日本、英國(guó)等國(guó)家早已禁止其用于水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)，我國(guó)農(nóng)業(yè)部也于2002年將其列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》。但由于孔雀石綠在控制真菌感染和寄生蟲(chóng)侵襲等方面的顯著效果，而且價(jià)格低廉，加之宣傳力度不夠等原因，使得不少業(yè)戶(hù)還在小范圍使用。2005年5月歐盟檢出我國(guó)出口水產(chǎn)品中三苯甲烷類(lèi)藥物殘留，給我國(guó)水產(chǎn)品出口帶來(lái)很大影響，因此，對(duì)于孔雀石綠的監(jiān)控格外重要，是近年來(lái)食用水產(chǎn)品衛(wèi)生安全中重點(diǎn)監(jiān)控的有機(jī)污染物。測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠等常用的方法有多種，如:分光光度法、薄層色譜法、液相色譜法(LC)、免疫分析法、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC -MS )、液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)等(Roybal JE等，Journal of AOAC International , 1995, 78 (2): 453-457 ;那廣水等，海洋環(huán)境科學(xué)，2008，27(2): 95-108 ;趙春城等，中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2009，21 (1): 23-27)。這些方法檢測(cè)靈敏度高，但存在需要復(fù)雜精密儀器，對(duì)樣品分離凈化步驟相對(duì)繁瑣，對(duì)操作技術(shù)要求聞等不足。分子印跡是制備對(duì)某一特定化合物具有選擇性識(shí)別能力的聚合物的過(guò)程，該化合物叫做模板分子(Template Molecular)或者印跡分子(Imprinted Molecular)。分子印跡技術(shù)則是指為了獲得在空間和結(jié)合位點(diǎn)(Biding Site)上與某一分子(模板分子、印跡分子)完全匹配的聚合物的制備技術(shù)。分子印跡聚合物作為新型的高效的分子識(shí)別材料，有優(yōu)越的特異識(shí)別性能和高效的選擇性的優(yōu)點(diǎn)，又具有制備簡(jiǎn)單、成本低廉、功能預(yù)構(gòu)、堅(jiān)固耐用的特點(diǎn)，非常適用于復(fù)雜體系中目標(biāo)化合物的選擇性分離與分析。作為一種高選擇性和高親和性分離材料，分子印跡聚合可克服生物或環(huán)境樣品基體復(fù)雜、預(yù)處理手續(xù)繁雜等不利因素，為樣品的采集、富集和分析提供了極大的方便。表面分子印跡技術(shù)是在特定載體表面進(jìn)行修飾制備分子印跡聚合物的一種方法。使印跡位點(diǎn)處于分子印跡聚合物表面，它能克服空間位阻的影響，使模板分子容易接近分子印跡的識(shí)別位點(diǎn)，以解決由包埋法得到的分子印跡結(jié)合位點(diǎn)不均一、可接近性差、識(shí)別動(dòng)力學(xué)慢等問(wèn)題。磁性分離是依據(jù)物質(zhì)的磁性差異，在磁場(chǎng)作用力的驅(qū)動(dòng)下，把磁性組分從非磁性組分混合物中分離出來(lái)的一種分離技術(shù)。預(yù)先制備一種磁性載體顆粒作為運(yùn)載工具，借助于磁性分離裝置，對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行負(fù)載、運(yùn)載和卸載等分離操作，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子的磁性分離過(guò)程。將表面印跡技術(shù)與磁性納米材料結(jié)合，可以結(jié)合表面印跡技術(shù)的選擇性和特異識(shí)別性與磁性納米材料可磁分離的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)快速、特異分離富集食品中危害因子，有望實(shí)現(xiàn)待測(cè)物質(zhì)快速分離和現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。拉曼光譜技術(shù)具有無(wú)須樣品制備、不受水分子的干擾、可以進(jìn)行無(wú)創(chuàng)快速檢測(cè)，檢測(cè)設(shè)備輕便等特點(diǎn)。表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)使其檢測(cè)限提高了 4至10個(gè)數(shù)量級(jí)，甚至可達(dá)十萬(wàn)億分之一(10_12 g/g)，不僅在物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)分析方面，而且在痕量化學(xué)物質(zhì)快速檢測(cè)方面也越來(lái)越顯示出巨大的潛力。本發(fā)明將磁性分子印跡材料用于實(shí)際樣品中孔雀石綠的分離與富集，可以把孔雀石綠從水體和水產(chǎn)品提取液中將孔雀石綠分離，除去影響基質(zhì)；利用拉曼光譜增強(qiáng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)富集后的洗脫進(jìn)行快速檢測(cè)，可用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)養(yǎng)殖水體和水產(chǎn)品存儲(chǔ)水體，用于水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測(cè)。對(duì)于養(yǎng)殖水體檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.5 PPb0

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有磁響應(yīng)分子印跡聚合物的合成方法，及利用合成的磁性分子印跡聚合物分離富集實(shí)際樣品中孔雀石綠，并結(jié)合拉曼增強(qiáng)光譜技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)的方法。合成的磁性分子印跡聚合物具有快速吸附、特異性吸附、物理和化學(xué)穩(wěn)定、可磁性快速分離等特點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種孔雀石綠磁性分子印跡材料結(jié)合拉曼增強(qiáng)技術(shù)用于水體及水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測(cè)方法，包括如下步驟:
(一)磁性納米材料合成；
(二)磁性納米材料的硅烷化；
(三)二氧化硅包覆磁性納米材料的乙烯基修飾；
(四)磁性納米材料分子印跡層的制備；
(五)磁性印跡材料用于孔雀石綠的分離富集；
(六)拉曼增強(qiáng)試劑的合成；
(七)利用孔雀石綠分離富集及結(jié)合拉曼增強(qiáng)技術(shù)檢測(cè)；
步驟(一):磁性納米材料為超順磁磁材料，可采用水熱法合成納米尺寸磁性材料或化學(xué)共沉淀法合成納米尺寸超順磁磁材料:
(1)水熱法合成的具體步驟如下:
稱(chēng)取1.3g-2.0g的六水合氯化高鐵，加到40-60 mL的乙二醇中，攪拌溶解，后加入4.5g-5.4 g乙酸鈉和1.0-1.5 g聚乙二醇2000，攪拌混合I小時(shí)，將混合均勻的黃色溶液轉(zhuǎn)移至IOOmL帶有聚四氟乙烯的高壓反應(yīng)釜，至于200攝氏度烘箱加熱反應(yīng)10_15h ;冷卻至室溫，所得黑色溶液利用磁鐵分離，用高純水洗滌6遍，無(wú)水乙醇洗滌6遍，至于真空干燥箱60度干燥至恒重，得到磁性納米材料；
(2)化學(xué)共沉淀法合成的具體步驟如下:
稱(chēng)取四水合氯化亞鐵1.59g-l.98g和六水合氯化高鐵4.32g-5.4g，溶解于超聲和通氮除氧的超純水80-100 mL，機(jī)械攪拌溶解，其中Fe37Fe2+的摩爾比為2:1 ;升高溫度至80攝氏度，在快速攪拌條件下加入10-15 mL濃氨水,反應(yīng)1-1.5h ;冷卻至室溫,磁分離,用超純水和無(wú)水乙醇各洗滌7遍，真空60度干燥至恒重，得到磁性納米材料；步驟二:磁性納米材料硅烷化包覆的具體步驟如下::
稱(chēng)取300 mg-500 mg的磁性納米材料超聲分散于50-70 mL的異丙醇中，加入4_6 mL的超純水再超聲10-15min，隨后加入5_7mL氨水和2_3 mL的四乙氧基硅烷，室溫反應(yīng)12h ；所得顆粒產(chǎn)物磁性分離，水洗7遍，真空60度干燥至恒重；
步驟三:二氧化娃包被磁性納米材料的乙烯基化修飾的具體步驟如下:
稱(chēng)取200-300 mg的二氧化硅包被磁性材料分散于50-60 mL的無(wú)水甲醇或無(wú)水乙醇中超聲10-15min，在快速攪拌條件下慢慢滴加Y -甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPS)，室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)24h，產(chǎn)物磁性分離，無(wú)水甲醇或無(wú)水乙醇洗滌7遍，真空干燥至恒重；
步驟四:孔雀石綠磁性納米材料分子印跡層的制備:
以孔雀石綠為模板，甲基丙烯酸為單體，乙二醇二甲基雙丙烯酸酯為交聯(lián)體，乙腈為致孔劑，乙烯基修飾的磁性納米顆粒為載體，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑；稱(chēng)取100-200 mg乙烯基修飾的磁性納米顆粒超聲分散于30-40 mL的乙腈中，加入乙二醇二甲基雙丙烯酸酯0.5mL-Ι.0 mL超聲混勻；甲基丙烯酸66μ -132μ 與模板0.091 g-0.182 g在乙腈30-40 mL中預(yù)組裝l_2h ;把磁顆粒與預(yù)組裝溶液混合后,加入偶氮二異丁腈20-40 mg,超聲5min,通氮除氧IOmin ;密封后,移到搖床300轉(zhuǎn)每min, 5(TC預(yù)聚合反應(yīng)6h,6(TC聚合24h ;得到聚合物，磁分離后，水洗5遍，無(wú)水乙醇洗滌5遍，真空干燥后，再用甲醇乙酸(v/v，9/1)溶液索氏提取72h，甲醇提取8h后，60°C真空干燥至恒重；得到孔雀石綠磁性分子印跡聚合物；
步驟五:拉曼增強(qiáng)試劑的合成:所用拉曼增強(qiáng)試劑為銀納米溶膠或金納米溶膠，可以通過(guò)檸檬酸酸鈉還原硝酸銀溶液或者通過(guò)鹽酸羥胺還原硝酸銀溶液獲得。檸檬酸酸鈉還原:200 mL含有36 mg硝酸銀的水溶液加熱至沸騰,劇烈攪拌下,加入4 mL 1%朽1檬酸鈉的水溶液，反應(yīng)60-90min ;撤去熱源，攪拌下冷卻至室溫，放于冰箱4度避光保存；鹽酸羥胺還原法:室溫條件，90 mL 1.11 mM硝酸銀溶液在攪拌的條件下快速加入10 mL鹽酸羥胺/氫氧化鈉(15 mM/30 mM)混合液，反應(yīng)持續(xù)30min，所得溶液放于冰箱保存；或檸檬酸酸鈉還原氯金酸水溶液獲得:0.7 mLl%檸檬酸鈉快速加入至100 mL微沸的0.01% (wt%)氯金酸水溶液，攪拌下回流lh，所得溶液放于冰箱4度避光保存；
步驟六:利用孔雀石綠分離富集及結(jié)合拉曼增強(qiáng)技術(shù)檢測(cè):
1)水樣品中分離富集孔雀石綠的具體步驟如下:孔雀石綠磁性印跡材料經(jīng)2mL無(wú)水甲醇，2 mL超純水活化后，加入至待測(cè)水體5 mL,振蕩5min，磁分離，棄去清液，I mL的超純水淋洗，磁分離，棄去清液，用200μ 甲醇乙酸(ν/ν, 9/1)洗脫2min，收集洗脫液待測(cè)；
2)水產(chǎn)品中分離富集孔雀石綠的具體步驟如下::
a.提取:稱(chēng)取5g搗碎的勻漿的海鮮肉于50mL離心管，加入15mL乙腈，振蕩提取2min,超聲提取2min,振蕩提取2min,6000 rpm離心5min,收集清液；再加入10 mL的乙腈至離心管，玻璃棒搗碎離心管沉淀，振蕩2min,超聲2min,振蕩2min,5000 rpm離心5min,合并清液，即得提取液；
b.凈化:把約25mL的提取液分次加至活化后的3 g中性氧化鋁柱，收集濾液；再2 mL乙腈淋洗收集；把濾液再次過(guò)活化的3 g的中性氧化鋁柱，收集濾液，用2 mL乙腈淋洗。把濾液移至100 mL梨形瓶，45°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至0.9-1.1 mL后,殘液加入3 mL的超純水超聲振蕩提取，收集溶液；再加入2 mL超純水超聲振蕩提取， 收集溶液；溶液經(jīng)0.2 um的過(guò)濾后，收集溶液；C.分離富集:孔雀石綠磁性印跡材料經(jīng)2 mL甲醇，2 mL水活化后，加入至提取后溶液中，振蕩5min,磁分離,棄去清液，ImL的超純水淋洗,磁分離,棄去清液,用200 μ 甲醇乙酸(ν/ν, 9/1)洗脫2min，收集洗脫液待測(cè)；
步驟七:結(jié)合拉曼增強(qiáng)技術(shù)檢測(cè):取40-100μ 銀膠或金膠，加入0.1-1M，10-25 μ (NaCl或KCl或KBr或KI)溶液，再加入30-75 μ 的待測(cè)液，混勻，取30-50 μ 于承載凹槽，激光聚集，拉曼光譜檢測(cè)；
本發(fā)明點(diǎn)顯著優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明的方法合成的孔雀石綠磁性分子印跡聚合物材料，可以從養(yǎng)殖水體中快速分離和富集痕量的孔雀石綠，可以快速的從水產(chǎn)品提取液中分離富集孔雀石綠簡(jiǎn)化傳統(tǒng)操作步驟，結(jié)合拉曼光譜技術(shù)進(jìn)行拉曼增強(qiáng)檢測(cè)，可以快速得到檢測(cè)結(jié)果，可望用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)水體中和水產(chǎn)品中孔雀石綠。本發(fā)明的磁性分子印跡材料結(jié)合了分子印跡技術(shù)的專(zhuān)一識(shí)別性能和磁性材料在磁場(chǎng)下快速分離的優(yōu)點(diǎn)，減少了傳統(tǒng)樣品檢測(cè)前處理中操作過(guò)程復(fù)雜和耗時(shí)的弱點(diǎn)。


圖1為孔雀石綠磁性分子印跡聚合物制備示意 圖2為制備的磁性分子印跡聚合物透射電鏡 圖3為銀膠拉曼增強(qiáng)試劑透射電鏡 圖4為金納米顆粒拉曼增強(qiáng)試劑透射電鏡 圖5為不同孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液拉曼增強(qiáng)譜圖，濃度分別為:0，2 ng/mL，5 ng/mL, 10 ng/mL,20 ng/mL,50ng/mL,100 ng/mL,200ng/mL,500ng/mL ; 圖6為加標(biāo)0.5ppb孔雀石綠的養(yǎng)殖水經(jīng)分子印跡材料富集洗脫后拉曼檢測(cè)圖譜。
具體實(shí)施例方式應(yīng)用本發(fā)明的內(nèi)容，采用孔雀石綠為模板分子，在磁性顆粒合成磁性表面分子印跡聚合物，并應(yīng)用于養(yǎng)殖水體中的孔雀石綠的分離富集，結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼進(jìn)行快速檢測(cè)。下面通過(guò)具體實(shí)施示例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說(shuō)明，但是不能以此限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1
以孔雀石綠為模板，制備磁性表面分子印跡聚合物(其制備示意圖參見(jiàn)圖1)，包括如下步驟:
a.采用水熱法合成磁性納米材料:
稱(chēng)取1.35 g的六水合氯化高鐵，加到40 mL的乙二醇中，攪拌溶解，后加入3.6 g乙酸鈉和0.2 g聚乙二醇2000，攪拌混合lh，將混合均勻的黃色溶液轉(zhuǎn)移至50 mL帶有聚四氟乙烯的高壓反應(yīng)釜，至于200攝氏度烘箱加熱反應(yīng)IOh ;冷卻至室溫，所得黑色溶液利用磁鐵分離，用高純水洗滌6遍，無(wú)水乙醇洗滌6遍，至于真空干燥箱60度干燥至恒重，得到磁性納米材料；
b.磁性納米材料硅烷化包覆:
稱(chēng)取300 mg的磁性納米材料超聲分散于50 mL的異丙醇中，加入4 mL的超純水再超聲15分鐘，隨后加入5 mL氨水和2 mL的四乙氧基硅烷，室溫反應(yīng)12小時(shí)；所得顆粒產(chǎn)物磁性分離，水洗7遍，無(wú)水乙醇洗3遍，60度真空干燥至恒重；
c.二氧化硅包被磁性納米材料的乙烯基化修飾:
稱(chēng)取200 mg的二氧化娃包被磁性材料分散于50 mL的無(wú)水乙醇中超聲15分鐘,在快速攪拌條件下慢慢滴加3 mL Y-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPS)，室溫機(jī)械攪拌下反應(yīng)24小時(shí)，產(chǎn)物磁性分離，乙醇洗滌7遍，60度真空干燥至恒重；
d.孔雀石綠磁性納米材料分子印跡層的制備:
以孔雀石綠為模板，甲基丙烯酸為單體，乙二醇二甲基雙丙烯酸酯為交聯(lián)體，乙腈為致孔劑，乙烯基修飾的磁性納米顆粒為載體，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑；稱(chēng)取100 mg乙烯基修飾的磁性納米顆粒超聲分散于30 mL的乙腈中，加入乙二醇二甲基雙丙烯酸酯1.0mL超聲混勻；甲基丙烯酸132 uL與模板0.182 g在乙腈30mL中預(yù)組裝2小時(shí)；把磁顆粒與預(yù)組裝溶液混合后，加入偶氮二異丁腈40 mg，超聲5分鐘，通氮除氧10分鐘；密封后，移到搖床以300轉(zhuǎn)每分鐘震蕩，50°C預(yù)聚合反應(yīng)6小時(shí)，60°C聚合24小時(shí)；得到聚合物，磁分離后，水洗5遍，無(wú)水乙醇洗滌5遍，真空干燥后，再用200 mL甲醇/乙酸(9/1，ν/ν)溶液索氏提取72小時(shí)洗脫模板，用150 mL甲醇提取8小時(shí)后，60 1:真空干燥至恒重；得到孔雀石綠磁性分子印跡聚合物(其透射電鏡圖見(jiàn)圖2)；
實(shí)施例2:
應(yīng)用孔雀石綠磁性分子印跡材料分離富集養(yǎng)殖水體中孔雀石綠和分離富集水產(chǎn)品提取液中的孔雀石綠，具體步驟如下:
a.活化:稱(chēng)取10mg孔雀石綠磁性分子印跡材料于5 mL離心管中，經(jīng)2 mL無(wú)水甲醇，磁性分離后，倒去廢液；用2 mL水振蕩活化后，磁性分離倒去廢液，得到活化好的孔雀石綠磁性分子印跡材料；
b.養(yǎng)殖水體(為淡水魚(yú)存儲(chǔ)所用水體)中孔雀石綠的分離富集:將待測(cè)水體過(guò)0.22微米的水膜后，取待測(cè)濾液水體10 mL，加入活化好的孔雀石綠磁性分子印跡材料振蕩5分鐘，磁分離，棄去清液；2 mL的超純水淋洗，磁分離，棄去清液；用200 uL甲醇乙酸(v/V, 9/1)洗脫2分鐘，收集洗脫液待測(cè)；
c.水產(chǎn)品中孔雀石綠的分離富集:
提取:稱(chēng)取5 g搗碎的勻漿的蝦肉于50 mL離心管，加入15 mL乙腈，振蕩提取2分鐘，超聲提取2分鐘，振蕩提取2分鐘，6000 rpm離心5分鐘，收集清液；再加入10 mL的乙腈至離心管，玻璃棒搗碎離心管沉淀，振蕩2分鐘，超聲2分鐘，振蕩2分鐘，5000 rpm離心5分鐘，合并清液；
凈化:把約25 mL的提取液分次加至活化后的3g中性氧化鋁柱，收集濾液；再2 mL乙腈淋洗收集；把濾液再次過(guò)活化的3 g的中性氧化鋁柱，收集濾液，用2 mL乙腈淋洗。把濾液移至100 mL梨形瓶，45 °C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至I mL后，殘液加入3 mL的超純水超聲振蕩提取，收集溶液；再加入2 mL超純水超聲振蕩提取，收集溶液；溶液經(jīng)0.2 um的過(guò)濾后，收集溶液；
分離富集:活化后孔雀石綠磁性印跡材料，加入至提取后溶液中，振蕩5分鐘，磁分離，棄去清液，I mL的超純水淋洗,磁分離,棄去清液,用200 uL甲醇乙酸(ν/ν, 9/1)洗脫2分鐘，收集洗脫液待測(cè)；
實(shí)施例3: 結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)孔雀石綠，具體步驟如下:
a.表面拉曼增強(qiáng)粒子的合成
所用拉曼增強(qiáng)試劑為銀納米溶膠或金納米溶膠，可以通過(guò)檸檬酸酸鈉還原硝酸銀溶液或者通過(guò)鹽酸羥胺還原硝酸銀溶液或檸檬酸酸鈉還原氯金酸獲得。檸檬酸酸鈉還原:200mL含有36mg硝酸銀的水溶液加熱至沸騰，劇烈攪拌下，加入4 mL 1%檸檬酸鈉的水溶液，反應(yīng)60分鐘；撤去熱源，攪拌下冷卻至室溫，放于冰箱4度避光保存(其透射電鏡圖如圖3 );鹽酸羥胺還原法:室溫條件，90 mL 1.1lmM硝酸銀溶液在攪拌的條件下快速加入IOmL鹽酸羥胺/氫氧化鈉(15mM/30mM)混合液，反應(yīng)持續(xù)30分鐘，所得溶液放于冰箱保存；金納米顆粒合成，0.7毫升1%檸檬酸鈉快速加入至IOOmL微沸的0.01% (wt%)氯金酸水溶液，攪拌下回流I小時(shí)，所得溶液放于冰箱保存(其透射電鏡圖如圖4)；
b.表面增強(qiáng)拉曼檢測(cè)孔雀石綠:
取40uL銀膠，加入10 uL 0.2 M(NaCl或KCl或KBr或者KI)溶液，再加入30 uL的待測(cè)液，混勻，取30uL于承載凹槽，激光聚集，拉曼光譜檢測(cè)；激光功率為60mW，積分IOs ；(不同濃度孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液的拉曼檢測(cè)圖參見(jiàn)圖5，用于待測(cè)檢出信號(hào)的比對(duì)，當(dāng)待測(cè)物出現(xiàn)孔雀石綠的特征峰即認(rèn)為有孔雀石綠檢出。)
實(shí)施例4:
一種孔雀石綠磁性分子印跡材料結(jié)合拉曼增強(qiáng)技術(shù)用于水體及水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測(cè)方法，包括如下步驟:
步驟一:采用化學(xué)共沉淀法合成納米尺寸超順磁磁材料:
化學(xué)共沉淀法合成的具體步驟如下:稱(chēng)取四水合氯化亞鐵1.78g和六水合氯化高鐵4.32g，溶解于超聲和通氮除氧的超純水100 mL,機(jī)械攪拌溶解，其中Fe3+/Fe2+的摩爾比為2:1 ;升高溫度至80攝氏度，在快速攪拌條件下加入15 mL濃氨水，反應(yīng)Ih ;冷卻至室溫，磁分離，用超純水和乙醇各洗滌7遍，真空60度干燥至恒重，得到磁性納米材料；
步驟二:磁性納米材料娃燒化包覆的具體步驟如下:稱(chēng)取500 mg的磁性納米材料超聲分散于70 mL的異丙醇中,加入6 mL的超純水再超聲12min,隨后加入6mL氨水和3 mL的四乙氧基硅烷，室溫反應(yīng)12h ;所得顆粒產(chǎn)物磁性分離，水洗7遍，真空60度干燥至恒重；
步驟三:二氧化娃包被磁性納米材料的乙烯基化修飾的具體步驟如下:稱(chēng)取300 mg的二氧化娃包被磁性材料分散于60 mL的甲醇或乙醇中超聲15min,在快速攪拌條件下慢慢滴加Y -甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPS)，室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)24h，產(chǎn)物磁性分離，甲醇洗滌7遍，真空干燥至恒重；
步驟四:孔雀石綠磁性納米材料分子印跡層的制備:以孔雀石綠為模板，甲基丙烯酸為單體，乙二醇二甲基雙丙烯酸酯為交聯(lián)體，乙腈為致孔劑，乙烯基修飾的磁性納米顆粒為載體，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑；稱(chēng)取200 mg乙烯基修飾的磁性納米顆粒超聲分散于40mL的乙腈中，加入乙二醇二甲基雙丙烯酸酯1.0 mL超聲混勻；甲基丙烯酸132 PL與模板0.182 g在乙腈40 mL中預(yù)組裝Ih ;把磁顆粒與預(yù)組裝溶液混合后，加入偶氮二異丁腈40mg,超聲5min,通氮除氧IOmin ;密封后,移到搖床300rpm/min, 50°C預(yù)聚合反應(yīng)6h,60°C聚合24h;得到聚合物，磁分離后，水洗多遍，乙醇洗滌多遍，真空干燥后，再用甲醇乙酸溶液索氏提取72h，甲醇提取8h后，60°C真空干燥至恒重；得到孔雀石綠磁性分子印跡聚合物(其透射電鏡圖如圖2)；其中步驟二到步驟三如圖1所示；
步驟五:拉曼增強(qiáng)試劑的合成:所用拉曼增強(qiáng)試劑為銀納米溶膠，通過(guò)鹽酸羥胺還原硝酸銀溶液獲得。鹽酸羥胺還原法:室溫條件，90 mL 1.11 mM硝酸銀溶液在攪拌的條件下快速加入10 mL鹽酸輕胺/氫氧化鈉(15 mM/30 mM)混合液,反應(yīng)持續(xù)30min,所得溶液放于冰箱保存；或檸檬酸酸鈉還原氯金酸水溶液獲得:0.7 mLl%檸檬酸鈉快速加入至100 mL微沸的0.01% (wt%)氯金酸水溶液，攪拌下回流lh，所得溶液放于冰箱4度避光保存；
步驟六:利用孔雀石綠分離富集及結(jié)合拉曼增強(qiáng)技術(shù)檢測(cè):
1)水樣品(所用水體為海水)中分離富集孔雀石綠的具體步驟如下:孔雀石綠磁性印跡材料經(jīng)2 mL甲醇,2 mL水活化后,加入至待測(cè)水體5 mL,振蕩5min,磁分離,棄去清液,I mL的超純水淋洗,磁分離,棄去清液,用200 μ 甲醇乙酸(ν/ν, 9/1)洗脫2min，收集洗脫液待測(cè)(加標(biāo)至0.5ng/ml孔雀石綠的養(yǎng)殖水經(jīng)磁性分子印跡材料分離富集檢測(cè)的拉曼增強(qiáng)譜圖參見(jiàn)圖6)；
2)水產(chǎn)品中分離富集孔雀石綠的具體步驟如下::
a.提取:稱(chēng)取5g搗碎的勻漿的蝦肉于50mL離心管，加入15mL乙腈，振蕩提取2min，超聲提取2min,振蕩提取2min,6000 rpm離心5min,收集清液；再加入10 mL的乙腈至離心管，玻璃棒搗碎離心管沉淀，振蕩2min,超聲2min,振蕩2min,5000 rpm離心5min,合并清液，即得提取液；
b.凈化:把約25mL的提取液分次加至活化后的3 g中性氧化鋁柱，收集濾液；再2mL乙腈淋洗收集；把濾液再次過(guò)活化的3 g的中性氧化鋁柱，收集濾液，用2 mL乙腈淋洗。把濾液移至100 mL梨形瓶，45°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至I mL后，殘液加入3 mL的超純水超聲振蕩提取,收集溶液；再加入2 mL超純水超聲振蕩提取，收集溶液；溶液經(jīng)0.2 um的過(guò)濾后，收集溶液；
c.分離富集:孔雀石綠磁性印跡材料經(jīng)2mL甲醇，2 mL水活化后，加入至提取后溶液中，振蕩5min,磁分離,棄去清液，ImL的超純水淋洗,磁分離,棄去清液,用200 μ 甲醇乙酸(ν/ν, 9/1)洗脫2min，收集洗脫液待測(cè)；
步驟七:結(jié)合拉曼增強(qiáng)技術(shù)檢測(cè):取100 μ 銀膠或金膠，加入25 μ KCl溶液，再加入75 μ 的待測(cè)液，混勻，取5 0μ 于承載凹槽，激光聚集，拉曼光譜檢測(cè)；激光功率為60mW，積分IOs ；(將待測(cè)物檢出拉曼光譜與圖5進(jìn)行比對(duì)，出現(xiàn)孔雀石綠特征峰即為孔雀石綠檢出)。
權(quán)利要求
1.一種水體及水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法是結(jié)合分子印跡技術(shù)和磁性分離功能，在磁性納米材料表面制備孔雀石綠的分子印跡材料，用于痕量孔雀石綠分離富集，結(jié)合拉曼增強(qiáng)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，包括如下步驟: (一)磁性納米材料的合成； (二)磁性納米材料的硅烷化； (三)二氧化硅包覆磁性納米材料的乙烯基修飾； (四)磁性納米材料分子印跡層的制備； (五)拉曼增強(qiáng)試劑的合成； (六)磁性印跡材料用于孔雀石綠的分離富集； (七)利用孔雀石綠分離富集及結(jié)合拉曼增強(qiáng)技術(shù)檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水體及水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測(cè)方法，其特征在于，所述磁性納米材料為超順磁磁材料，可采用水熱法合成納米尺寸磁性材料或化學(xué)共沉淀法合成納米尺寸超順磁磁材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種水體及水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測(cè)方法，其特征在于:所述水熱法合成的步驟如下:稱(chēng)取1.3g-2.0g的六水合氯化高鐵，加到40-60mL的乙二醇中，攪拌溶解，后加入4.5g-5.4g乙酸鈉和1.0-1.5g聚乙二醇2000,攪拌混合Ih,將混合均勻的黃色溶液轉(zhuǎn)移至IOOmL帶有聚四氟乙烯的高壓反應(yīng)釜，置于200°C烘箱加熱反應(yīng)10-15h ；冷卻至室溫，所得黑色溶液利用磁鐵分離，用高純水洗滌6遍，無(wú)水乙醇洗滌6遍，置于真空干燥箱60°C干燥至恒重，得到磁性納米材料。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種水體及水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測(cè)方法，其特征在于:所述化學(xué)共沉淀法合成的步驟如下:稱(chēng)取四水合氯化亞鐵1.59g-l.98g和六水合氯化高鐵4.32g-5.4g，溶解于超聲和通氮除氧的超純水80-100mL，機(jī)械攪拌溶解，其中Fe3+/Fe2+的摩爾比為2:1 ;升高溫度至801:，在快速攪拌條件下加入10-151^濃氨水，反應(yīng)1-1.5 h;冷卻至室溫，磁分離，用超純水和無(wú)水乙醇各洗滌7遍，真空60°C干燥至恒重，得到磁性納米材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水體及水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測(cè)方法，其特征在于，所述磁性納米材料娃燒化的具體步驟如下:稱(chēng)取300mg-500mg的磁性納米材料超聲分散于50-70mL的異丙醇中，加入4-6mL的超純水再超聲10-15 min,隨后加入5_7mL氨水和2_3mL的四乙氧基硅烷，室溫反應(yīng)12 h ;所得顆粒產(chǎn)物磁性分離，水洗7遍，真空60°C干燥至恒重。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水體及水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測(cè)方法，其特征在于，所述二氧化硅包覆磁性納米材料的乙烯基修飾的具體步驟如下；稱(chēng)取200-300mg的二氧化硅包被磁性材料分散于50-60mL的無(wú)水甲醇或無(wú)水乙醇中超聲10-15min,在快速攪拌條件下慢慢滴加Y-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)24 h，產(chǎn)物磁性分離，甲醇或乙醇洗滌7遍， 真空干燥至恒重。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水體及水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測(cè)方法，其特征在于，所述磁性納米材料分子印跡層的制備步驟如下:以孔雀石綠為模板，甲基丙烯酸為單體，乙二醇二甲基雙丙烯酸酯為交聯(lián)體，乙腈為致孔劑，乙烯基修飾的磁性納米顆粒為載體，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑；稱(chēng)取100-200mg乙烯基修飾的磁性納米顆粒超聲分散于30-40mL的乙腈中，加入乙二醇二甲基雙丙烯酸酯0.5mL-l.0mL超聲混勻；甲基丙烯酸66ML-132ML與模板`0.091g-0.182g在乙腈30-40mL中預(yù)組裝1_2 h ;把磁顆粒與預(yù)組裝溶液混合后，加入偶氮二異丁腈20-40mg,超聲5min,通氮除氧IOmin ;密封后,移到搖床300rpm/min, 50°C預(yù)聚合反應(yīng)6h，60°C聚合24h ;得到聚合物，磁分離后，水洗5遍，無(wú)水乙醇洗滌5遍，真空干燥后，再用甲醇乙酸溶液索氏提取72h，甲醇提取8h后，60°C真空干燥至恒重；得到孔雀石綠磁性分子印跡聚合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水體及水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測(cè)方法，其特征在于，所述拉曼增強(qiáng)試劑的合成如下:所用拉曼增強(qiáng)試劑為銀納米溶膠或金納米溶膠，銀膠可以通過(guò)檸檬酸酸鈉還原硝酸銀溶液或者通過(guò)鹽酸羥胺還原硝酸銀溶液獲得，金納米顆?？赏ㄟ^(guò)檸檬酸鈉還原氯金酸溶液獲得；所述檸檬酸酸鈉還原的具體步驟如下:200mL含有36mg硝酸銀的水溶液加熱至沸騰，劇烈攪拌下，加入4 mL 1%檸檬酸鈉的水溶液，反應(yīng)60-90min ；撤去熱源，攪拌下冷卻至室溫，放于冰箱4°C避光保存；所述鹽酸羥胺還原法的具體步驟如下:室溫條件，90 mL 1.1lmM硝酸銀溶液在攪拌的條件下快速加入IOmL鹽酸羥胺/氫氧化鈉混合液，反應(yīng)持續(xù)30min,所得溶液放于冰箱保存；金納米顆粒合成:0.7 mL 1%朽1檬酸鈉快速加入至IOOmL微沸的0.01%氯金酸水溶液，攪拌下回流lh，所得溶液放于冰箱保存；所述鹽酸羥胺/氫氧化鈉混合液中，鹽酸羥胺濃度為15mM，氫氧化鈉的濃度為30mM。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 所述的一種水體及水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測(cè)方法，其特征在于，所述磁性印跡材料用于孔雀石綠的分離富集，是用于水體中或水產(chǎn)品中的孔雀石綠的分離富集; 所述水體中孔雀石綠 的分離富集方法如下:孔雀石綠磁性印跡材料經(jīng)2mL甲醇，2mL水活化后，加入至待測(cè)水體5mL,振蕩5min,磁分離,棄去清液,ImL的超純水淋洗,磁分離，棄去清液，用200uL甲醇乙酸洗脫2min，收集洗脫液待測(cè)；按體積比計(jì)，所述甲醇:乙酸=9:1 ; 所述水產(chǎn)品中孔雀石綠的分離富集方法如下: a.提取:稱(chēng)取5g搗碎的勻漿的海鮮肉于50mL離心管，加入15mL乙腈，振蕩提取2min,超聲提取2min,振蕩提取2min,6000rpm離心5min,收集清液；再加入IOmL的乙腈至離心管，玻璃棒搗碎離心管沉淀，振蕩2min,超聲2min,振蕩2min, 5000rpm離心5min,合并清液，即為提取液； b.凈化:把提取液分次加至活化后的3g中性氧化鋁柱，收集濾液；再2mL乙腈淋洗收集；把濾液再次過(guò)活化的3g的中性氧化鋁柱，收集濾液，用2mL乙腈淋洗，把濾液移至IOOmL梨形瓶，45°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至0.9-1.1mL后，殘液加入3mL的超純水超聲振蕩提取，收集溶液；再加入2mL超純水超聲振蕩提取，收集溶液；溶液經(jīng)0.2um的過(guò)濾后，收集溶液； c.分離富集:孔雀石綠磁性印跡材料經(jīng)2mL甲醇，2mL水活化后，加入至水產(chǎn)品提取溶液中，振蕩5min,磁分離,棄去清液,ImL的超純水淋洗,磁分離,棄去清液,用200μ 甲醇乙酸洗脫2分鐘，收集洗脫液待測(cè)；按體積比計(jì)，所述甲醇:乙酸=9:1。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水體及水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測(cè)方法，其特征在于，所述結(jié)合拉曼增強(qiáng)技術(shù)檢測(cè)的具體方法為:取40-100μ 銀膠或金膠，加入0.1-1M 10_25μ 鹽溶液再加入30-75PL的待測(cè)液，混勻，取30_50μ 于承載凹槽，激光聚集，拉曼光譜檢測(cè)；所述鹽溶液為NaCl、KCl、KBr、KI溶液中的任一種。
全文摘要
本發(fā)明提供一種水體及水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測(cè)方法，是一種在磁性材料表面制備孔雀石綠的分子印跡材料，并應(yīng)用于養(yǎng)殖水體及水產(chǎn)品中痕量孔雀石綠的分離富集，結(jié)合拉曼增強(qiáng)技術(shù)進(jìn)行快速檢測(cè)，屬于材料化學(xué)和食品安全檢測(cè)領(lǐng)域。本發(fā)明的磁性分子印跡材料結(jié)合了分子印跡技術(shù)的專(zhuān)一識(shí)別性能和磁性材料在磁場(chǎng)下快速分離的優(yōu)點(diǎn)，減少了傳統(tǒng)樣品檢測(cè)前處理中操作過(guò)程復(fù)雜和耗時(shí)的弱點(diǎn)；利用拉曼增強(qiáng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，有望用于養(yǎng)殖水體中孔雀石綠的現(xiàn)場(chǎng)快速樣品處理和檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N21/65GK103105386SQ20131003180
公開(kāi)日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月29日
發(fā)明者楊黃浩, 張曉龍, 林立森, 鄭琤, 田中群 申請(qǐng)人:福州大學(xué)