基于免疫印跡法的自身抗體檢測試劑盒及其測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公布了一種基于免疫印跡法的自身抗體檢測試劑盒及其使用該試劑盒進(jìn)行檢測的方法。該試劑盒包括檢測膜條、酶標(biāo)試劑、顯色劑A、顯色劑B、反應(yīng)終止液、濃縮洗滌液、自身抗體譜標(biāo)準(zhǔn)條帶。檢測膜條上包括檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，其中，質(zhì)控區(qū)包被有2條質(zhì)控線，用于指示操作中是否正常加入待檢樣本酶標(biāo)試劑是否有效，以及初步定性指示樣本液體中所含IgG抗體量的程度。
【專利說明】基于免疫印跡法的自身抗體檢測試劑盒及其測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于免疫印跡法的自身抗體檢測試劑及其測定方法，屬于醫(yī)療檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]作為自身免疫病的重要血清標(biāo)志物，人體自身抗體的快速檢測對于自身免疫性疾病的診斷、預(yù)后和轉(zhuǎn)歸判斷及理解疾病的病理過程有重要的應(yīng)用價值和理論意義。本發(fā)明適用于體外定性檢測人血清中可提取性核抗原(ENA)自身抗體，包括抗Sm(史密斯抗體)、抗U1RNP (Ul小分子細(xì)胞核核糖蛋白抗體)、抗SSA (干燥綜合征抗原A抗體)、抗SSB (干燥綜合征抗原B抗體)、抗rRNP (核糖體P蛋白抗體)、抗Scl-70 (DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I抗體)、抗Jo-1 (組氨酰-tRNA合成酶抗體)。
[0003]目前，市面上的自身抗體檢測膜條產(chǎn)品只有一條包被抗人IgG抗體的質(zhì)控線，這種方法只能判斷檢測時是否添加了檢測樣本，而不能判別檢測過程中加入的AP酶活性是否有效。
[0004]臨床上常用的自身抗體檢測方法主要有:免疫雙擴(kuò)散法、間接免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附法、免疫印跡法等。其中免疫雙擴(kuò)散法是經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)方法，其特異性高，價格低廉，但操作費(fèi)時，且肉眼觀察沉淀環(huán)，結(jié)果靈敏度低。對實(shí)驗(yàn)操作人員經(jīng)驗(yàn)和操作水平要求高，結(jié)果一致性較差。間接免疫熒光法是檢測自身抗體的常用技術(shù)，其特異性判斷需經(jīng)過ELISA、免疫印跡等技術(shù)的二級確認(rèn)，同樣對實(shí)驗(yàn)操作人員經(jīng)驗(yàn)和操作水平要求高，且結(jié)果一致性差。酶聯(lián)免疫吸附法具有較高的成熟度，靈敏度高、特異性較好，操作方法簡便快速、無放射性污染且檢測結(jié)果排除了人為的主觀判斷，然而，該方法一次實(shí)驗(yàn)僅能檢測單一指標(biāo)，通量低，成本較高，應(yīng)用推廣難度大。免疫印跡法是在凝膠電泳和固相免疫檢測技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種免疫生化檢測技術(shù)，具備SDS-PAGE的高分辨率和固相免疫測定的高特異性和高敏感性的特點(diǎn)，但目前市面上基于該方法的自身抗體檢測膜條產(chǎn)品只有一條包被抗人IgG抗體的質(zhì)控線，不能判別檢測過程中加入的AP酶活性是否有效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服上述方法檢測自身免疫性疾病過程存在的不足，節(jié)省時間、人力和資金，本發(fā)明提供了一種定位準(zhǔn)確、價格低廉，多種蛋白聯(lián)合檢測的免疫印跡法自身抗體檢測試劑。
[0006]本發(fā)明目的在于提供一種基于免疫印跡法的自身抗體檢測試劑，能同時檢測包括抗Sm、抗U1RNP'抗SSA、抗SSB、抗rRNP、抗Scl_70、抗Jo-1等7種抗體，并且該檢測試劑經(jīng)過噴印包被設(shè)置了兩條質(zhì)控線，分別包被有人IgG蛋白和抗人IgG抗體，用于指示檢測過程是否正常進(jìn)行和酶免試劑是否有效，為進(jìn)一步的明確判斷提供有價值的參考依據(jù)。
[0007]本發(fā)明的主要技術(shù)方案是:采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法，將ENA按照分子量大小依次分開，通過轉(zhuǎn)印技術(shù)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，對該硝酸纖維素膜條進(jìn)行噴印包被設(shè)置兩條質(zhì)控線，然后將含有質(zhì)控線和ENA抗原的硝酸纖維素膜放入反應(yīng)槽中，與待測血清進(jìn)行反應(yīng)，如待測樣本中含有自身抗體，則膜條上原本按照分子量依次分開的各種ENA相關(guān)抗原，將會與待測血清中含有的抗體發(fā)生特異性結(jié)合，再加入酶標(biāo)試劑和顯色齊U，進(jìn)行顯色反應(yīng)，將顯色區(qū)帶與標(biāo)準(zhǔn)對照區(qū)帶對比即可判斷待測樣本中所含有的ENA抗體類別；其抗體的有無和抗體種類和數(shù)量，對診斷和鑒別風(fēng)濕病等自身抗體疾病具有重要的臨床意義。同時，本發(fā)明涉及的硝酸纖維素膜上噴印有人IgG的質(zhì)控線1，用于檢測加入酶結(jié)合物中酶的活性是否失效，無論ENA抗體陰性或陽性血清，只要試劑有效，在膜條的質(zhì)控線區(qū)域，均能顯示出棕色區(qū)帶；陽性血清在ENA抗原轉(zhuǎn)印區(qū)還能顯示對應(yīng)陽性區(qū)帶。質(zhì)控線2包被有抗人IgG抗體，用于初步定性指示樣本液體中所含IgG抗體量的程度。若試劑失效(主要指酶標(biāo)抗體、顯色液1、顯色液2)，則膜條質(zhì)控線區(qū)域不會有任何區(qū)帶。本發(fā)明不但可以判斷待測樣本中含有何種ENA抗體，還可以斷定檢測結(jié)果是血清ENA抗體陰性還是試劑失效，有效解決了用戶在遇到不顯色的膜條時，難以斷定是血清ENA抗體陰性還是試劑失效的問題，同時可初步知識樣本液體中所含IgG抗體量。
[0008]經(jīng)噴印機(jī)噴印包被，在固相膜上附著兩條質(zhì)控線。
[0009]所述質(zhì)控線I包被有人IgG蛋白。
[0010]所述質(zhì)控線2包被抗人IgG抗體。
[0011]所述質(zhì)控線I用于檢測加入的抗體中所標(biāo)酶的活性是否失效，如酶的活性失效，則此條帶不顯色。
[0012]所述質(zhì)控線2的抗人IgG抗體質(zhì)控線顯色顏色的深淺用于初步定性指示樣本液體中所含IgG抗體的情況。
[0013]同時，本發(fā)明還提供了上述試劑的測定方法，包括以下步驟:
[0014](I)按所需量將濃縮洗滌液用蒸餾水作1: 10稀釋，將稀釋好的洗滌液置于37°C水浴中預(yù)熱。
[0015](2)取出反應(yīng)槽，每槽加入0.5ml洗滌液，然后加入待檢血清IOul，充分混勻，緩慢搖動于37°C孵育30min。
[0016](3)棄去槽內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，用洗滌液洗滌4次，每次每槽1ml，洗滌lmin。
[0017](4)每槽加入洗滌液0.5ml，酶結(jié)合物20ul，混勻，緩慢搖動于37°C孵育30min。
[0018](5)洗滌方法與⑶相同。
[0019](6)加入顯色液A0.5ml,顯色液B0.5ml,室溫反應(yīng)lOmin。
[0020](7)每槽加入0.5ml終止液，終止反應(yīng)，Imin后棄去液體，用自來水洗滌數(shù)次，取出硝酸纖維素膜條，用吸水紙吸干后進(jìn)行結(jié)果判斷。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
[0022]本發(fā)明涉及的經(jīng)噴印包被增加的自身抗體檢測試劑中質(zhì)控線I上的人IgG，用于指示AP酶的活性，其顯色強(qiáng)度與待測樣本無關(guān)，僅指示AP酶的活性。這條質(zhì)控線為試劑貨架期的穩(wěn)定性和有效性提供了參考依據(jù)。質(zhì)控線2包被的是抗人IgG抗體，利用雙抗體夾心法，通過與血清樣本中的人免疫球蛋白IgG結(jié)合后再與試劑中的堿性磷酸酶(AP酶)標(biāo)記的抗人IgG進(jìn)行特異反應(yīng)而顯色的，可初步定性指示樣本中IgG含量。這種質(zhì)控方式，可以指示實(shí)際操作中因漏加樣本或誤加其他樣本而導(dǎo)致的檢測結(jié)果無效?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0023]圖1是本發(fā)明實(shí)施例一的檢測膜條結(jié)構(gòu)示意圖；
[0024]圖2是本發(fā)明的檢測原理圖；
[0025]圖3是本發(fā)明實(shí)施例1的自身抗體譜標(biāo)準(zhǔn)條帶；
[0026]附圖標(biāo)記:1、檢測膜條；2、自身抗原線；3、質(zhì)控線。
【具體實(shí)施方式】
[0027]本發(fā)明的實(shí)施例和制劑實(shí)施例可更詳細(xì)的說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
[0028]實(shí)施例1
[0029]本發(fā)明試劑組成成分包括:膜條(8條X 5板)、濃縮洗滌液(25ml/瓶X 2瓶)、酶標(biāo)抗體(0.6ml/瓶X2瓶)、顯色液A(25ml/瓶)、顯色液B(25ml/瓶)、終止液(25ml/瓶)、海綿和標(biāo)準(zhǔn)對照圖譜組成。樣本要求，取血后應(yīng)盡快分離血清，以免溶血。分離后的標(biāo)本應(yīng)盡快進(jìn)行測試，如不能及時測試可將標(biāo)本置4°C冰箱貯存，超過3天應(yīng)加入0.1 %硫柳汞防腐，置-20°C冷凍保存，測試前注意恢復(fù)至室溫。
[0030]測定步驟:
[0031](I)將所有試劑恢復(fù)至室溫。在室溫下進(jìn)行測試。
[0032](2)按所需量將濃縮洗滌液用蒸餾水作1: 10稀釋，即I份濃縮洗滌液加9份蒸餾水稀釋。
[0033](3)取出反應(yīng)槽，每槽加入0.5ml洗滌液，然后加入待檢血清IOul，充分混勻，緩慢搖動于37°C孵育30min。
[0034](4)棄去槽內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，用洗滌液洗滌4次，每次每槽1ml，洗滌lmin。
[0035](5)每槽加入洗滌液0.5ml，酶結(jié)合物20ul，混勻，緩慢搖動于37°C孵育30min。
[0036](6)洗滌方法與⑷相同。
[0037](7)加入顯色液A0.5ml，顯色液B0.5ml，室溫反應(yīng)IOmin。
[0038](8)每槽加入0.5ml終止液，終止反應(yīng)，Imin后棄去液體，用自來水洗滌數(shù)次，取出膜條，用吸水紙吸干后即可進(jìn)行結(jié)果判斷。
[0039]結(jié)果判定:將印跡膜上起始線與標(biāo)準(zhǔn)對照圖譜的起始線對齊，觀察膜條上的陽性顯色區(qū)帶與標(biāo)準(zhǔn)對照區(qū)帶對應(yīng)的位置，即可判斷顯色區(qū)帶含有的是何種自身抗體。
[0040](I)結(jié)果判斷請參看說明書附圖3自身抗體的譜標(biāo)準(zhǔn)條帶圖，零位線(藍(lán)線)下約2_處的第一、二條顯色帶為試劑質(zhì)控線1、質(zhì)控線2，若第一條質(zhì)控線I不出現(xiàn)，說明試劑失效。
[0041](2)判斷結(jié)果時，需將譜帶定位與帶型結(jié)合起來。帶型指一種抗體有多條區(qū)帶時，區(qū)帶間相對不變的位置關(guān)系構(gòu)成的圖型。如抗Scl-70常出現(xiàn)4條；抗SSB常出現(xiàn)2條，且總是與抗SSA同時出現(xiàn)；抗Sm常出現(xiàn)2-3條；抗DE (抗Liu)常出現(xiàn)5_6條等等。譜帶定位時與標(biāo)準(zhǔn)帶相差I(lǐng)mm內(nèi)屬允許范圍。
[0042](3)本試劑盒也可作抗DM-53、抗RA-54檢測，類風(fēng)關(guān)病人除有54KD抗體外，也可出現(xiàn)36KD抗體。
[0043]如下表所示:[0044]ENA相關(guān)抗體對應(yīng)的疾病及陽性率
[0045]
【權(quán)利要求】
1.基于免疫印跡法的自身抗體檢測試劑盒，其特征在于，該試劑包括檢測膜條、酶標(biāo)試齊?、顯色劑Α、顯色劑B、反應(yīng)終止液、濃縮洗滌液、自身抗體譜標(biāo)準(zhǔn)條帶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于免疫印跡法的自身抗體檢測試劑盒，其特征在于，檢測膜條包括2條或2條以上自身抗原檢測線、質(zhì)控線1、質(zhì)控線2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于免疫印跡法的自身抗體檢測試劑盒，其特征在于:質(zhì)控線I包被有人IgG抗體，質(zhì)控線2包被有抗人IgG抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于免疫印跡法的自身抗體檢測試劑盒，其特征在于，硝酸纖維素膜條上的質(zhì)控線蛋白通過噴印包被。
5.一種使用權(quán)利要求1中所述的基于免疫印跡法的自身抗體檢測試劑盒的測定方法，其特征在于，所述試劑盒的測定方法包括以下步驟: (1)按所需量將濃縮洗滌液用蒸餾水作1: 10稀釋，將稀釋好的洗滌液置于37°C水浴中預(yù)熱。 (2)取出反應(yīng)槽，每槽加入0.5ml洗滌液，然后加入待檢血清IOul，充分混勻，緩慢搖動于 37°C 孵育 30min。 (3)棄去槽內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，用洗滌液洗滌4次，每次每槽1ml，洗滌lmin。 (4)每槽加入洗滌液0.5ml，酶結(jié)合物20ul，混勻，緩慢搖動于37°C孵育30min。 (5)洗漆方法與(3)相同。 (6)加入顯色液A0.5ml,顯色液B0.5ml,室溫反應(yīng)lOmin。 (7)每槽加入0.5ml終止液，終止反應(yīng)，Imin后棄去液體，用自來水洗滌數(shù)次，取出檢測膜條，用吸水紙吸干后進(jìn)行結(jié)果判斷。
【文檔編號】G01N33/68GK103969441SQ201310032228
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月28日
【發(fā)明者】王繼華, 陳飛, 唐時幸 申請人:廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司