專利名稱：一種利用競爭法檢測(cè)牛布魯氏菌抗體的檢測(cè)試紙卡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用競爭法檢測(cè)牛布魯氏菌抗體的檢測(cè)試紙卡。
背景技術(shù)：
布魯氏菌為革蘭氏陰性短小桿菌，初次分離時(shí)多呈球狀，球桿狀和卵圓形，該菌傳代培養(yǎng)后漸呈短小桿狀，菌體無鞭毛，不形成芽胞。1985年WHO布魯氏菌病專家委員會(huì)把布魯氏菌屬分為6個(gè)種19個(gè)生物型，即羊種(生物型I 3)，牛種(生物型I 7.9)，豬種(生物型I 5)及綿羊型副睪種，沙林鼠種，犬種(各I個(gè)生物型)。臨床上以羊、牛、豬三種意義最大，羊種致病力最強(qiáng)。布魯氏菌引起的人類疾病還有以下幾種名稱:馬爾他熱、地中海弛張熱、波浪熱或波狀熱。牛布魯氏菌病在我國廣泛存在，致病力也很強(qiáng)，尤其以畜牧生產(chǎn)為主的東北、華北、西北一帶，經(jīng)常有疫情爆發(fā)的報(bào)道，直接危害人類的健康，嚴(yán)重困擾畜牧業(yè)的發(fā)展和動(dòng)物及其產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易。目前牛布魯氏菌病的診斷手段主要包括病原分離鑒定、虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)、試管凝集試驗(yàn)(SAT)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、PCR等。病原分離鑒定耗時(shí)長，操作步驟繁瑣，只適合于實(shí)驗(yàn)室的研究需要，不具有實(shí)用價(jià)值；補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)容易引起溶血反應(yīng)，應(yīng)用的局限性很大，試管凝集試驗(yàn)為半定量試驗(yàn)方法，容易出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，且不易檢測(cè)出樣品中所含抗體的含量；虎紅平板凝集試驗(yàn)也存在較高的假陽性反應(yīng)，需要改進(jìn)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)靈敏度高，定量效果好，為一種廣泛應(yīng)用的免疫學(xué)檢測(cè)方法，但是，該方法操作比較麻煩，定性和定量需要專業(yè)人士的分析才能確定，不適合在基層、農(nóng)村等單位大規(guī)模檢測(cè)使用。免疫膠體金技術(shù)自問世以來，得到了迅速發(fā)展。廣泛應(yīng)用于化學(xué)檢測(cè)和免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是膠體金免疫層析技術(shù)具有操作簡單、快速靈敏、結(jié)果清楚、易于判斷和保存，且無需任何儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。更適合于臨床快速診斷和基層、農(nóng)村等流行病學(xué)調(diào)查大規(guī)模應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種敏感度高、特異性好、操作簡單、低成本的利用競爭法檢測(cè)牛布魯氏菌抗體現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試紙卡及其檢測(cè)方法。一種利用競爭法檢測(cè)牛布魯氏菌抗體的檢測(cè)試紙卡，所述檢測(cè)試紙卡由外殼I和其內(nèi)部的試紙條2構(gòu)成，外殼I由上板3和下板4構(gòu)成，上板3有檢測(cè)窗5和加樣孔6，試紙條2由底板7和在底板7上依次粘貼的樣品吸收墊8、膠體金標(biāo)記墊9、檢測(cè)反應(yīng)區(qū)10構(gòu)成，樣品吸收墊8正對(duì)加樣孔6，檢測(cè)反應(yīng)區(qū)10正對(duì)檢測(cè)窗5。所述底板7的材質(zhì)為硝酸纖維膜。所述膠體金標(biāo)記墊9包被有牛布魯氏菌抗原-膠體金標(biāo)記物。所述牛布魯氏菌抗原-膠體金標(biāo)記物的制備方法為:
(I)將牛布魯氏菌抗原在0.005M/L ρΗ7.0的NaCl溶液中4°C透析過夜，4°C，10000-12000rpm 條件下離心 Ih ；(2)將0D526的膠體金溶液的pH調(diào)節(jié)至4.0-9.0 ；(3)將步驟(I)離心得到的牛布魯氏菌抗原用0.005M/L pH9.0的硼酸鹽緩沖溶液稀釋至5 μ g/ml 50 μ g/ml,取Iml稀釋后的牛布魯氏菌抗原加入到Iml膠體金溶液中,振蕩混勻，靜置5min，加入0.1mll0%的NaCl溶液，混勻后靜置2h，離心純化制得膠體金標(biāo)記的牛布魯氏菌抗原。所述檢測(cè)反應(yīng)區(qū)10由包被牛布魯氏菌抗體的測(cè)試區(qū)T和包被牛布魯氏菌二抗的質(zhì)控區(qū)C組成。所述樣品吸收墊含有植物凝集素或抗紅細(xì)胞抗體。所述抗紅細(xì)胞抗體為使用人紅細(xì)胞免疫小鼠、羊或兔，常規(guī)制備的抗紅細(xì)胞單克隆抗體。上述檢測(cè)牛布魯氏菌抗體的檢測(cè)試紙卡的檢測(cè)方法，其特征在于，按照如下步驟進(jìn)行:(I)血液樣品處理:血液標(biāo)本收集在潔凈、干燥的容器內(nèi)，將采集的新鮮血液加入濃度為2.5%抗凝劑；(2)取經(jīng)過處理的血液樣品100 μ L,滴入加樣孔；(3)待血液樣品流過測(cè)試區(qū)和質(zhì)控區(qū)，判定樣品中是否含有牛布魯氏菌抗體，判定規(guī)則如下:陽性(-):僅質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紫紅色條帶，在測(cè)試區(qū)內(nèi)無紫紅色條帶出現(xiàn)；陰性(+):兩條紫紅色條帶出現(xiàn)，一條位于測(cè)試區(qū)內(nèi)，另一條位于質(zhì)控區(qū)內(nèi)；無效:當(dāng)質(zhì)控區(qū)不顯示出紫紅色條帶，則無論測(cè)試區(qū)顯示出紫紅色條帶與否，該試紙卡判為無效。本發(fā)明的檢測(cè)原理:布氏桿菌抗體快速檢測(cè)試紙條表面有字母“Τ”和“C”作為檢測(cè)線和質(zhì)控線。用布氏桿菌抗原與膠體金顆粒的偶聯(lián)物，包被在醋酸纖維素膜上；在硝酸纖維素膜上將布氏桿菌抗體和二抗分別包被在測(cè)試區(qū)T和質(zhì)控區(qū)C。在提供任何樣品前，檢測(cè)線和質(zhì)控線在結(jié)果窗中都不顯示。當(dāng)血清樣本加到加樣孔后，樣本中的布氏桿菌抗體與抗原-膠體金偶聯(lián)物一起層析泳動(dòng)到檢測(cè)區(qū)競爭與布氏桿菌抗體結(jié)合。當(dāng)樣本中的布氏桿菌抗體濃度超過一定量時(shí)，布氏桿菌抗原-膠體金偶聯(lián)物就不能與檢測(cè)線上的布氏桿菌抗體結(jié)合，此時(shí)檢測(cè)區(qū)不出現(xiàn)紫紅色線條；當(dāng)樣本中沒有布氏桿菌抗體或者樣本中布氏桿菌抗體濃度低于一定值時(shí)，膠體金偶聯(lián)物就與檢測(cè)線上的布氏桿菌抗體結(jié)合，從而在檢測(cè)區(qū)顯示出一條紫紅色線條；而無論樣本中是否含有布氏桿菌抗體，質(zhì)控區(qū)都會(huì)出現(xiàn)紫紅色線條，以示檢測(cè)有效。本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明的牛布魯氏菌抗體現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試紙卡靈敏度和重復(fù)率高，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性能好，假陽率和假陰率控制在I %以下，吸收墊含有的植物凝集素或抗紅細(xì)胞抗體能有效的凝集攔截紅細(xì)胞，避免紅細(xì)胞透過吸收墊，干擾后續(xù)的檢測(cè)，該試紙卡檢測(cè)反應(yīng)容易觀察區(qū)別，使用方便，容易觀察區(qū)別，適合于臨床快速診斷和基層、農(nóng)村等流行病學(xué)調(diào)查大規(guī)模應(yīng)用。


圖1為本發(fā)明試紙卡結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明試紙條結(jié)構(gòu)示意圖；圖中，1-外殼、2_試紙條、3_上板、4_下板、5_檢測(cè)窗、6_加樣孔、7_底板8_樣品吸收墊、9-膠體金標(biāo)記墊、10-檢測(cè)反應(yīng)區(qū)、T-測(cè)試區(qū)、C-質(zhì)控區(qū)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例1利用夾心法檢測(cè)牛布魯氏菌抗體的檢測(cè)試紙卡結(jié)構(gòu)利用夾心法檢測(cè)牛布魯氏菌抗體的檢測(cè)試紙卡，如圖1和圖2所示，所述檢測(cè)試紙卡由外殼I和其內(nèi)部的試紙條2構(gòu)成，外殼I由上板3和下板4構(gòu)成，上板3有檢測(cè)窗5和加樣孔6，試紙條2由底板7和在底板7上依次粘貼的樣品吸收墊8、膠體金標(biāo)記墊9、檢測(cè)反應(yīng)區(qū)10構(gòu)成，樣品吸收墊8正對(duì)加樣孔6，檢測(cè)反應(yīng)區(qū)10正對(duì)檢測(cè)窗5。膠體金標(biāo)記墊9包被有布魯氏菌抗原和膠體金標(biāo)記物。檢測(cè)反應(yīng)區(qū)10由包被布魯氏菌抗體的測(cè)試區(qū)T和包被布魯氏菌二抗的質(zhì)控區(qū)C組成。 樣品吸收墊含有植物凝集素或抗紅細(xì)胞抗體?？辜t細(xì)胞抗體為使用人紅細(xì)胞免疫小鼠、羊或兔，常規(guī)制備的抗紅細(xì)胞單克隆抗體。實(shí)施例2檢測(cè)牛布魯氏菌抗體的方法1、牛布魯氏菌抗原-膠體金標(biāo)記物的制備(I)將牛布魯氏菌抗原在0.005M/L ρΗ7.0的NaCl溶液中4°C透析過夜，4°C，10000-12000rpm 條件下離心 Ih ；(2)將0D526的膠體金溶液的pH調(diào)節(jié)至4.0-9.0 ；(3)將步驟⑴離心得到的牛布魯氏菌抗原用0.005M/L pH9.0的硼酸鹽緩沖溶液稀釋至5 μ g/ml 50 μ g/ml,取Iml稀釋后的牛布魯氏菌抗原加入到Iml膠體金溶液中,振蕩混勻，靜置5min，加入0.1mll0%的NaCl溶液，混勻后靜置2h，離心純化制得膠體金標(biāo)記的牛布魯氏菌抗原。2、血液樣品的處理取100份經(jīng)過牛布魯氏菌抗原免疫的牛血液樣品，血液標(biāo)本收集在潔凈、干燥的容器內(nèi)，將采集的新鮮血液加入濃度為2.5%抗凝劑；血液標(biāo)本在2°C 8°C冷藏可保存48小時(shí)。3、檢測(cè)步驟(I)將100份經(jīng)過處理的血液樣品各100 μ L，標(biāo)準(zhǔn)牛布魯氏菌抗體100 μ L (濃度為10 μ g/ml),去離子水100 μ L,滴入加樣孔；(2)待血液樣品、標(biāo)準(zhǔn)牛布魯氏菌抗體、去離子水流過各自試紙條的測(cè)試區(qū)和質(zhì)控區(qū)，判定樣品中是否含有牛布魯氏菌抗體，判定規(guī)則如下:陽性(-):僅質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紫紅色條帶，在測(cè)試區(qū)內(nèi)無紫紅色條帶出現(xiàn)；陰性(+):兩條紫紅色條帶出現(xiàn)，一條位于測(cè)試區(qū)內(nèi)，另一條位于質(zhì)控區(qū)內(nèi)；無效:當(dāng)質(zhì)控區(qū)不顯示出紫紅色條帶，則無論測(cè)試區(qū)顯示出紫紅色條帶與否，該試紙卡判為無效。判定結(jié)果為:牛血液樣品98份呈陽性，I份呈陰性，I份無效，靈敏度為99%。實(shí)施例3檢測(cè)牛布魯氏菌抗體的試紙卡假陽性率和假陰性測(cè)試實(shí)驗(yàn)1、假陽性測(cè)試(I)取100份普通牛血液樣品，采用血液前處理裝置對(duì)血液樣品進(jìn)行處理；(2)將經(jīng)過處理的100份普通牛血液樣品各100 μ L,去離子水100 μ L,滴入加樣孔；(2)待血液樣品、去離子水流過各自試紙條的測(cè)試區(qū)和質(zhì)控區(qū)，判定樣品中是否含有牛布魯氏菌抗體，判定規(guī)則如下:陽性(-):僅質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紫紅色條帶，在測(cè)試區(qū)內(nèi)無紫紅色條帶出現(xiàn)；陰性(+):兩條紫紅色條帶出現(xiàn)，一條位于測(cè)試區(qū)內(nèi)，另一條位于質(zhì)控區(qū)內(nèi)；無效:當(dāng)質(zhì)控區(qū)不顯示出紫紅色條帶，則無論測(cè)試區(qū)顯示出紫紅色條帶與否，該試紙卡判為無效。判定結(jié)果為:牛血液樣品I份呈陽性，99份呈陰性，全部有效，假陽性率為I %。2、假陰性測(cè)試(I)取100份標(biāo)準(zhǔn)牛布魯氏菌抗體(濃度為10yg/ml)各100 μ L，去離子水100 μ L，滴入加樣孔；(2)待標(biāo)準(zhǔn)牛布魯氏菌抗體、去離子水流過各自試紙條的測(cè)試區(qū)和質(zhì)控區(qū)，判定樣品中是否含有牛布魯氏菌抗體，判定規(guī)則如下:陽性(-):僅質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紫紅色條帶，在測(cè)試區(qū)內(nèi)無紫紅色條帶出現(xiàn)；陰性(+):兩條紫紅色條帶出現(xiàn)，一條位于測(cè)試區(qū)內(nèi)，另一條位于質(zhì)控區(qū)內(nèi)；無效:當(dāng)質(zhì)控區(qū)不顯示出紫紅色條帶，則無論測(cè)試區(qū)顯示出紫紅色條帶與否，該試紙卡判為無效。判定結(jié)果為:牛血液樣品99份呈陽性，I份呈陰性，全部有效，假陰性率為I %。實(shí)施例4檢測(cè)牛布魯氏菌抗體的試紙條其他性能的測(cè)定(I)布魯氏菌抗體現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試紙卡的特異性測(cè)定應(yīng)用制備的布魯氏菌抗體試紙卡檢測(cè)與布魯氏菌種系較近的3種細(xì)菌全血，其結(jié)果均為陰性，表明其特異性好，無交叉。(2)布魯氏菌抗體現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試紙卡的敏感性取外購牛布魯氏菌陽性血清，用ELISA檢測(cè)其平均效價(jià)約為1: 8000，虎紅平板凝集抗原在血液稀釋度低于50倍時(shí)檢測(cè)為陽性；布魯氏菌抗體現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試紙卡測(cè)到的陽性結(jié)果的血液效價(jià)為1: 6000，血液稀釋度> 6000倍時(shí)，試紙卡檢測(cè)線顯色不清晰或無顯色。故布魯氏菌抗體現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)實(shí)在卡的靈敏度明顯高于虎紅平板凝集試驗(yàn)，但其靈敏度仍低于ELISA。(3)布魯氏菌抗體現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試紙卡的重復(fù)性進(jìn)行平行檢測(cè)5個(gè)試紙卡，其檢測(cè)結(jié)果一致，說明該檢測(cè)方法具有可重復(fù)性。(4)布魯氏菌抗體現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試紙卡的穩(wěn)定性4°C放置布魯氏菌抗體現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試紙卡，定期檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，結(jié)果顯示其穩(wěn)定性可保存I年，I年后金釋放速度減慢，層析速度減慢等現(xiàn)象。產(chǎn)品的穩(wěn)定性為4°c環(huán)境為1年。
權(quán)利要求
1.一種利用競爭法檢測(cè)牛布魯氏菌抗體的檢測(cè)試紙卡，其特征在于，所述檢測(cè)試紙卡由外殼⑴和其內(nèi)部的試紙條⑵構(gòu)成，外殼⑴由上板⑶和下板⑷構(gòu)成，上板⑶有檢測(cè)窗(5)和加樣孔￠)，試紙條(2)由底板(7)和在底板(7)上依次粘貼的樣品吸收墊(8)、膠體金標(biāo)記墊(9)、檢測(cè)反應(yīng)區(qū)(10)構(gòu)成，樣品吸收墊(8)正對(duì)加樣孔(6)，檢測(cè)反應(yīng)區(qū)(10)正對(duì)檢測(cè)窗(5)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用競爭法檢測(cè)牛布魯氏菌抗體的檢測(cè)試紙卡，其特征在于，所述底板(7)的材質(zhì)為硝酸纖維膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用競爭法檢測(cè)牛布魯氏菌抗體的檢測(cè)試紙卡，其特征在于，所述膠體金標(biāo)記墊(9)包被有牛布魯氏菌抗原-膠體金標(biāo)記物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種利用競爭法檢測(cè)牛布魯氏菌抗體的檢測(cè)試紙卡，其特征在于，所述牛布魯氏菌抗原-膠體金標(biāo)記物的制備方法為: (1)將牛布魯氏菌抗原在0.005M/LpH7.0的NaCl溶液中4°C透析過夜，4°C，10000-12000rpm 條件下離心 Ih ； (2)將OD526的膠體金溶液的pH調(diào)節(jié)至4.0-9.0 ； (3)將步驟(I)離心得到的牛布魯氏菌抗原用0.005M/L pH9.0的硼酸鹽緩沖溶液稀釋至5 μ g/ml 50 μ g/ml,取Iml稀釋后的牛布魯氏菌抗原加入到Iml膠體金溶液中,振蕩混勻，靜置5min，加入0.1ml 10%的NaCl溶液，混勻后靜置2h，離心純化制得膠體金標(biāo)記的牛布魯氏菌抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用競爭法檢測(cè)牛布魯氏菌抗體的檢測(cè)試紙卡，其特征在于，所述檢測(cè)反應(yīng)區(qū)(10)由包被牛布魯氏菌抗體的測(cè)試區(qū)(T)和包被牛布魯氏菌二抗的質(zhì)控區(qū)(C)組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用競爭法檢測(cè)牛布魯氏菌抗體的檢測(cè)試紙卡，其特征在于，所述樣品吸收墊含有植物凝集素或抗紅細(xì)胞抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用競爭法檢測(cè)牛布魯氏菌抗體的檢測(cè)試紙卡，其特征在于，所述抗紅細(xì)胞抗體為使用人紅細(xì)胞免疫小鼠、羊或兔，常規(guī)制備的抗紅細(xì)胞單克隆抗體。
8.應(yīng)用權(quán)利要求1所述檢測(cè)牛布魯氏菌抗體的檢測(cè)試紙卡的檢測(cè)方法，其特征在于，按照如下步驟進(jìn)行: (1)血液樣品處理:血液標(biāo)本收集在潔凈、干燥的容器內(nèi)，將采集的新鮮血液加入濃度為2.5%抗凝劑； (2)取經(jīng)過處理的血液樣品100μ L，滴入加樣孔； (3)待血液樣品流過測(cè)試區(qū)和質(zhì)控區(qū)，判定樣品中是否含有牛布魯氏菌抗體，判定規(guī)則如下: 陽性(_):僅質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紫紅色條帶，在測(cè)試區(qū)內(nèi)無紫紅色條帶出現(xiàn)； 陰性(+):兩條紫紅色條帶出現(xiàn)，一條位于測(cè)試區(qū)內(nèi)，另一條位于質(zhì)控區(qū)內(nèi)； 無效:當(dāng)質(zhì)控區(qū)不顯示出紫紅色條帶，則無論測(cè)試區(qū)顯示出紫紅色條帶與否，該試紙卡判為無效。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域的一種利用競爭法檢測(cè)牛布魯氏菌抗體的檢測(cè)試紙卡。該所述檢測(cè)試紙卡由外殼和其內(nèi)部的試紙條構(gòu)成，外殼由上板和下板構(gòu)成，上板有檢測(cè)窗和加樣孔，試紙條由底板和在底板上依次粘貼的樣品吸收墊、膠體金標(biāo)記墊、檢測(cè)反應(yīng)區(qū)構(gòu)成，樣品吸收墊正對(duì)加樣孔，檢測(cè)反應(yīng)區(qū)正對(duì)檢測(cè)窗。本發(fā)明還公開了應(yīng)用上述試紙條檢測(cè)牛布魯氏菌抗體的方法。本發(fā)明的牛布魯氏菌抗體現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試紙卡靈敏度和重復(fù)率高，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性能好，假陽率和假陰率低，使用方便，容易觀察區(qū)別，適合于臨床快速診斷和基層、農(nóng)村等流行病學(xué)調(diào)查大規(guī)模應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/532GK103149357SQ20131003307
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月29日
發(fā)明者張明州, 王旻子, 毛開榮, 陳宗倫, 吳海芬, 魏建良, 程曄 申請(qǐng)人:杭州迪恩科技有限公司