專利名稱：轉(zhuǎn)移因子口服液的分子量分布測試方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明特別涉及一種用于對轉(zhuǎn)移因子口服液的分子量分布進行測試的方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)移因子(TF)又稱傳輸因子，由具有細胞性免疫功能的淋巴細胞產(chǎn)生，作為一種特定的細胞因子參與機體的免疫反應(yīng)，能提高動物機體細胞免疫功能，促進機體抗感染和防御能力。轉(zhuǎn)移因子口服液是以口服為給藥形式的免疫增強劑。轉(zhuǎn)移因子屬多肽類物質(zhì)，是由多核苷酸、多肽及其它成份組成的復合分子。其中小分子肽類物質(zhì)的分子量小于5000D，是轉(zhuǎn)移因子的功能標示物，并作為其主要功效成份。當前轉(zhuǎn)移因子中不同分子量多肽的結(jié)構(gòu)研究成為熱點，通過對小分子多肽的分子量和結(jié)構(gòu)研究，對進一步的了解多肽與其功能活性之間的關(guān)系具有重要意義。迄今為止，已有較多關(guān)于以高效液相色譜法對轉(zhuǎn)移因子口服液中游離氨基酸、防腐劑和抑菌劑等進行檢測的報道，但對于其中小分子多肽分子量分布的研究則較少見諸報道。近來，有研究人員采用Follin-酹法(Lowry)對轉(zhuǎn)移因子中多肽含量進行了測定，但該檢測方法只能對樣品中總多肽含量進行測定，無法對不同小分子多肽進行分離后測定，亦無法知道多肽的分子量信息。又及，雖然曾有研究人員以反相高效液相色譜方法對多肽類物質(zhì)進行了檢測，其主要是基于多肽類物質(zhì)的疏水性，在不同介質(zhì)條件下將不同多肽分子進行分離，該方法主要采用有機相作為檢測流動相，但由于疏水性不同的小分子多肽在有機相中的溶解性存在差異，導致檢測結(jié)果出現(xiàn)較大偏差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種轉(zhuǎn)移因子口服液的分子量分布測試方法，其能夠?qū)崿F(xiàn)對轉(zhuǎn)移因子口服液中多肽分子量信息的準確測定，從而克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案:
一種轉(zhuǎn)移因子口服液的分子量分布測試方法，包括:
依據(jù)轉(zhuǎn)移因子口服液中所含小分子多肽的情況，建立色譜檢測條件；
利用所述色譜檢測條件對至少三種選定標準樣品進行測定，建立相應(yīng)的標準圖譜，并由標準圖譜中分子的保留時間與分子量對數(shù)值之間存在的線性關(guān)系，實現(xiàn)對未知小分子多肽的分子量測算；
以及，利用所述色譜檢測條件對與轉(zhuǎn)移因子口服液樣品進行檢測，并依據(jù)檢測結(jié)果及標準圖譜，實現(xiàn)對轉(zhuǎn)移因子口服液樣品中小分子多肽分子量分布的測定。進一步的，所述標準樣品可包括牛血清白蛋白、核糖核酸酶A和尿嘧啶，但不限于此。作為較為優(yōu)選的實施方案之一，所述色譜檢測條件包括:采用水溶性體積排阻色譜柱。作為較為優(yōu)選的具體應(yīng)用方案之一，所述水溶性體積排阻色譜柱可選用蘇州賽分科技有限公司生產(chǎn)的ZeniX-C SEC 100型色譜柱或類似產(chǎn)品，但不限于此。 所述色譜檢測條件還包括:
采用PH值為6.5-7.5的，濃度為50-200 mM的磷酸鹽緩沖液作為流動相，且流速為
0.6-1.2 mL/min.所述色譜檢測條件還包括:將檢測波長設(shè)于210 280 nm。所述色譜檢測條件還可包括:將柱溫控制為室溫。所述小分子多肽的分子量的對數(shù)值Y與小分子多肽在色譜柱中的保留時間X之間的線性關(guān)系具體為:
Y= -0.475X + 7.4804。又及，所述小分子多肽的分子量的對數(shù)值Y與小分子多肽在色譜柱中的保留時間X之間的線性關(guān)系中相關(guān)系數(shù)R2=0.9991。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點至少在于:采用高效液相體積排阻色譜法測定轉(zhuǎn)移因子口服液中小分子多 肽的分子量，方法簡單，易于操作，且能夠?qū)崿F(xiàn)對轉(zhuǎn)移因子口服液中多肽分子量信息的準確測定。


圖1系本發(fā)明一較佳實施方案中牛血清白蛋白、核糖核酸酶A和尿嘧啶分子量標準品色譜圖。圖2系本發(fā)明一較佳實施方案中牛血清白蛋白、核糖核酸酶A和尿嘧啶分子量對數(shù)與保留時間標準曲線圖。圖3系本發(fā)明一較佳實施方案中轉(zhuǎn)移因子口服液中小分子多肽分子量檢測圖譜； 圖4系本發(fā)明實施例1中一種轉(zhuǎn)移因子口服液樣品中小分子多肽分子量檢測圖譜；
圖5系本發(fā)明實施例2中一種轉(zhuǎn)移因子口服液樣品中小分子多肽分子量檢測圖譜。
具體實施例方式本發(fā)明的主要目的在于建立轉(zhuǎn)移因子口服液中不同小分子多肽的分子量測算，其技術(shù)方案的要點在于:首先建立合適的檢測條件，以保證轉(zhuǎn)移因子樣品中所含的全部小分子多肽都能在圖譜上體現(xiàn)出來；其次，通過所建立的檢測條件對選定標準樣品進行檢測，由此建立分子量標準曲線，并據(jù)此標準曲線計算轉(zhuǎn)移因子樣品中的小分子多肽的分子量，而由此獲得的多肽分子量信息，對于每個多肽的結(jié)構(gòu)確認具有重要指導意義。以下結(jié)合若干較佳實施例及相應(yīng)的附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的說明。實施例1:
1.樣品配制
分子量標準品配制:分別準確稱取牛血清白蛋白、核糖核酸酶A和尿嘧啶分子量標準品適量(精確到0.1mg)于10 mL容量瓶中，用純水溶解并定容至刻度，得到濃度分別為
1.0 mg/mL、l.0 mg/mL和0.1 mg/mL的分子量標準品溶液；
樣品配制:取轉(zhuǎn)移因子口服液樣品，其所含總多肽濃度為1.0 mg/mL，該樣品用0.45μ m微孔濾膜過濾后作為樣品溶液。2.色譜條件
2.1.色譜柱:以親水硅膠為基質(zhì)，結(jié)合表面修飾的水溶性體積排阻色譜柱，例如，可選用蘇州賽分科技有限公司出售的Zenix-C SEC 100型色譜柱(3 Mm, 100 A, 7.8 x 300mm ) ο2.2.流動相:150 mM磷酸鹽緩沖液(pH值7.0)
2.3.流速:1.0 mL/min2.4.檢測波長:210 280 nm
2.5.柱溫:室溫
2.6.進樣量:10 μ
3.檢測結(jié)果
3.1按上述色譜條件檢測，得到分子量標準品的檢測信息如下:
參閱圖1系牛血清白蛋白、核糖核酸酶A和尿嘧啶分子量標準品色譜圖。而牛血清白蛋白、核糖核酸酶A和尿嘧啶分子量及其保留時間之間的關(guān)系可參見表I及圖2，并且依據(jù)圖2，可以看到，牛血清白蛋白、核糖核酸酶A和尿嘧啶分子量及其保留時間之間的關(guān)系可以概括為如下線性方程:
Y= -0.475Χ + 7.4804......式 I
其中，相關(guān)系數(shù)R2=0.9991，表明標準品分子量和保留時間存在很好的線性關(guān)系。
表I牛血清白蛋白、核糖核酸酶A和尿嘧啶分子量及其保留時間對照表
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)移因子口服液的分子量分布測試方法，其特征在于，包括: 依據(jù)轉(zhuǎn)移因子口服液中所含小分子多肽的情況，建立色譜檢測條件； 利用所述色譜檢測條件對至少三種選定標準樣品進行測定，建立相應(yīng)的標準圖譜，并由標準圖譜中分子的保留時間與分子量對數(shù)值之間存在的線性關(guān)系，實現(xiàn)對未知小分子多肽的分子量測算； 以及，利用所述色譜檢測條件對轉(zhuǎn)移因子口服液樣品進行檢測，并依據(jù)檢測結(jié)果及所述標準圖譜，實現(xiàn)對轉(zhuǎn)移因子口服液樣品中小分子多肽分子量分布的測定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)移因子口服液的分子量分布測試方法，其特征在于，所述標準樣品包括牛血清白蛋白、核糖核酸酶A和尿嘧啶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)移因子口服液的分子量分布測試方法，其特征在于，所述色譜檢測條件包括:采用水溶性體積排阻色譜柱。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)移因子口服液的分子量分布測試方法，其特征在于，所述水溶性體積排阻色譜柱包括市售的Zenix-C SEC 100型色譜柱。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的轉(zhuǎn)移因子口服液的分子量分布測試方法，其特征在于，所述色譜檢測條件還包括: 采用PH值為6.5-7.5的，濃度為50-200 mM的磷酸鹽緩沖液作為流動相，且流速為0.6-1.2 ml ,/mi η。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的轉(zhuǎn)移因子口服液的分子量分布測試方法，其特征在于，所述色譜檢測條件還包括:將檢測波長設(shè)于210 280 nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的轉(zhuǎn)移因子口服液的分子量分布測試方法，其特征在于，所述色譜檢測條件還包括:將柱溫控制為室溫。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)移因子口服液的分子量分布測試方法，其特征在于，該方法中小分子多肽在色譜柱中的保留時間X與小分子多肽的分子量的對數(shù)值Y之間的線性關(guān)系具體為:Y= -0.475X + 7.4804。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)移因子口服液的分子量分布測試方法，其特征在于，所述小分子多肽的分子量的對數(shù)值Y與小分子多肽在色譜柱中的保留時間X之間的線性關(guān)系中相關(guān)系數(shù)R2=0.9991。
全文摘要
一種轉(zhuǎn)移因子口服液的分子量分布測試方法，包括建立色譜檢測條件，藉以測算轉(zhuǎn)移因子口服液中所含不同小分子多肽的分子量；采用該色譜檢測條件，通過至少三種已知分子量的標準品，在該檢測條件下建立分子量標準曲線，由分子的色譜峰保留時間與分子量對數(shù)值之間存在的線性關(guān)系，實現(xiàn)對未知小分子多肽的分子量測算；利用該色譜檢測條件對轉(zhuǎn)移因子口服液樣品進行檢測，并依據(jù)檢測結(jié)果及標準圖譜，實現(xiàn)對轉(zhuǎn)移因子口服液樣品中不同小分子多肽分子量分布的測定。進一步，該測試方法中優(yōu)先采用水溶性體積排阻色譜柱。本發(fā)明方法簡單，易于操作，能實現(xiàn)對轉(zhuǎn)移因子口服液中多肽分子量信息的準確測定。
文檔編號G01N30/02GK103115982SQ20131003376
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月29日
發(fā)明者龔立冬, 邵娜, 李彧娜, 崔愛艷, 徐香 申請人:蘇州賽分科技有限公司