專利名稱：人靜脈注射免疫球蛋白中活化凝血因子Ⅺ檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種人靜脈注射免疫球蛋白(pH4, Humanintravenous immunoglobulin,以下簡(jiǎn)稱 IVIG)中活化凝血因子 XKActivatedcoagulation factor XI，以下簡(jiǎn)稱FXIa)的檢測(cè)方法。該法可以精確的檢測(cè)出IVIG中FXIa的具體含量，靈敏度可達(dá)0.12 nmol/Lo
背景技術(shù)：
IVIG是由乙型肝炎疫苗免疫的健康人血漿經(jīng)低溫乙醇蛋白分離法提取的免疫球蛋白組分，經(jīng)深加工和病毒滅活等步驟精制而成。IVIG具有免疫替代和免疫調(diào)節(jié)的雙重治療作用，臨床使用廣泛。近年來(lái)隨著IVIG臨床使用數(shù)量的增加，該制品輸注人體后產(chǎn)生的不良反應(yīng)事件也逐漸增加，危害嚴(yán)重。研究表明，此類血液制品中殘存的微量凝血激活物一FXIa是導(dǎo)致患者發(fā)生血栓的主要誘因。目前國(guó)際尚未出臺(tái)關(guān)于IVIG致栓性的強(qiáng)制檢測(cè)規(guī)定。目前《中國(guó)藥典》2010年版三部附錄IX 0規(guī)定，非活化的部分凝血活酶時(shí)間(Non-activated partial thromboplastin time,以下簡(jiǎn)稱NAPTT法)可用于定性檢測(cè)血液制品(如凝血因子濃縮物)中有無(wú)活化凝血因子。其檢測(cè)原理是將待檢測(cè)樣本加入到枸櫞酸抗凝的正常人血漿中，再加入一定濃度的磷脂、Ca2+后測(cè)定樣品凝塊形成時(shí)間。目前該方法存在以下不足:①僅能定性，無(wú)法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)樣品中凝血酶生成過(guò)程的變化；②僅能通過(guò)樣品凝固時(shí)間判定結(jié)果，人為因素影響較大，無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定樣品中活化凝血因子的具體含量。傳統(tǒng)NAPTT法的操作步驟為:(I)制備缺血小板人血衆(zhòng)(Platelet-poor plasma,以下簡(jiǎn)稱PPP):無(wú)菌采集人全血于3.8%枸櫞酸鈉抗凝劑(9:1)中，混勻，以1500轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心30min。用塑料注射器取上層2/3血漿，以3500轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心30min，取上層2/3血漿，分裝于塑料管中，每支3ml，保存_40°C備用；(2)將PPP與腦磷脂懸液混合，37°C放置I分鐘，加經(jīng)稀釋的供試品溶液0.1ml，然后加入已預(yù)熱至37°C的0.025mol/L氯化鈣溶液0.1ml，記錄凝固時(shí)間。同時(shí)做空白對(duì)照。結(jié)果判定:空白對(duì)照凝固時(shí)間不低于200s，實(shí)驗(yàn)成立。1:10和1:100供試品稀釋液凝固時(shí)間應(yīng)不低于150s?；谏鲜鲆蛩?，本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，建立基于凝血酶生成試驗(yàn)(Thrombin generation test,以下簡(jiǎn)稱TGT)法檢測(cè)IVIG中F XI a的新方法,該方法具有良好的重復(fù)性，可準(zhǔn)確定量檢測(cè)樣品中F XI a的含量，進(jìn)一步減少了人為誤差，有效確保了試驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性和可靠性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)所存在的上述不足，建立一種準(zhǔn)確度好、靈敏度高的基于TGT法檢測(cè)IVIG中FXIa的方法，該方法適用于IVIG制品中微量FXIa的檢測(cè)。本發(fā)明的操作步驟與NAPTT法不一致，其技術(shù)解決方案為:(1)枸櫞酸鈉抗凝血漿中加入玉米胰蛋白酶抑制物，可特異、有效地避免因在采血過(guò)程中凝血因子X(jué)I的預(yù)活化，從而得到不含F(xiàn) XI a的血漿，從而分離制備出不含F(xiàn) XI a的PPP ；
(2)反應(yīng)體系中加入凝血酶特異性熒光底物，特異的凝血酶熒光底物以及磷脂劑濃度的確定:凝血酶特異性熒光底物選擇B-VA-AMC，對(duì)不同濃度底物進(jìn)行篩選，其中底物工作濃度為f7mmol/L ;磷脂劑選則腦磷脂，選擇工作濃度為廣3.5μπι01/1 ;利用分光光度計(jì)連接計(jì)算機(jī)對(duì)凝血過(guò)程進(jìn)行掃描，通過(guò)熒光信號(hào)強(qiáng)弱，可間接反映凝血酶生成含量變化，最后繪制動(dòng)力學(xué)曲線；
(3)不同含量的FXI a標(biāo)準(zhǔn)品或IVIG樣本中加入含磷脂劑的凝血酶熒光底物以及鈣離子源啟動(dòng)凝血酶生成反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果通過(guò)熒光分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)凝血酶生成過(guò)程中熒光值的變化，最后使用GraphPad軟件處理數(shù)據(jù)得到凝血酶生成曲線，將受檢樣品的凝血酶生成濃度達(dá)到峰值所需的時(shí)間(Peak time of thrombin,以下簡(jiǎn)稱TTP)與F XI a標(biāo)準(zhǔn)品的TTP進(jìn)行比較，可以間接獲得受檢樣品中F XI a的水平。本發(fā)明的有益效果:①將IVIG樣品與一種經(jīng)特殊預(yù)處理的人PPP混合； 向反應(yīng)體系中添加含有磷脂劑的凝血酶特異熒光底物；③添加起始因子啟動(dòng)TGT，該起始因子組分包括一種鈣離子源、一種磷脂劑；④對(duì)優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行TGT，獲得提供參數(shù)的凝血酶生成曲線；⑤受檢樣品TTP與樣品中所含F(xiàn)XIa水平呈負(fù)有關(guān)。將受檢樣品TTP與FXIa標(biāo)準(zhǔn)品TTP進(jìn)行比較，可以間接獲得受檢樣品中FXIa的水平。本發(fā)明是以TGT為原理，建立一種穩(wěn)定、特異、靈敏的FXIa的檢測(cè)方法，該法適用于IVIG制品中殘留的微量FXIa的檢測(cè)，可用于體外評(píng)估相關(guān)制品的致栓性風(fēng)險(xiǎn)。

具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法作進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明。1.制備不含F(xiàn)XIa的PPP
血漿使用靜脈穿刺法采自健康獻(xiàn)血者。1:9比例的枸櫞酸鈉抗凝血漿中加入濃度為40-150 μ g/ml玉米胰蛋白酶抑制物，混勻，然后4°C離心，1500轉(zhuǎn)/分鐘，30min。用塑料注射器取上層2/3血漿，以3500轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心30分鐘，取上層2/3血漿，分裝于塑料管中，每支2ml，_40°C保存?zhèn)溆茫?br> 2.建立基于TGT的FXIa檢測(cè)方法
(I)優(yōu)化底物濃度
選擇凝血酶特異性熒光底物Boc-Val-Arg-AMC.HCL，可以穩(wěn)定、特異地反映TGT生成過(guò)程的變化。凝血酶特異性熒光底物Boc-Val-Arg-AMC.HCL難溶于Hepes緩沖液，所以操作過(guò)程中先用1/50體積的二甲基亞砜充分溶解，再用Hepes緩沖液稀釋至所需要的體積。不同濃度的底物對(duì)TGT有直接影響，故對(duì)凝血酶特異性熒光底物Boc-Val-Arg-AMC.HCL濃度進(jìn)行優(yōu)化。底物濃度為I 7mmol/L時(shí)，凝血酶生成時(shí)間和熒光信號(hào)較合適。(2)優(yōu)化磷脂劑濃度
含有凝血酶特異性熒光底物的反應(yīng)緩沖液中還應(yīng)添加一定濃度的磷脂劑，才能使得凝血酶生成反應(yīng)得以進(jìn)行，磷脂劑選擇常規(guī)凝血實(shí)驗(yàn)中使用的腦磷脂，考察不同濃度腦磷脂對(duì)凝血酶生成的影響，表明腦磷脂濃度對(duì)凝血酶生成影響不大，選擇Veena C.等[Haematologica jour a I of hematology 2003 88 (05) 547-554]所使用的 I 3.5 μ mol/L03.利用已建立的F XI a檢測(cè)方法，比較不同含量的FXIa標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)TGT影響
配制不同濃度的F XI a標(biāo)準(zhǔn)品，利用2中已建立的基于TGT的F XI a檢測(cè)方法，比較不同含量的FXIa標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)凝血酶生成影響,試驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)經(jīng)GrapgPad Prism作圖軟件中的enzymekinetics-Michaelis Menten數(shù)據(jù)模式處理后，以時(shí)間為X軸、突光變化值(第n+1次熒光值-第η次熒光值)為Y軸得到平滑的凝血酶生成動(dòng)力學(xué)曲線，從圖可以進(jìn)行計(jì)算。4.1VIG樣本中FXIa含量的檢測(cè)
利用2中已建立的基于TGT的FXIa檢測(cè)方法，比較不同IVIG樣本中FXIa對(duì)凝血酶生成的影響。受檢樣品的TTP與樣品 中所含F(xiàn)XIa水平有關(guān)。將受檢樣品的TTP與FXIa標(biāo)準(zhǔn)品的TTP進(jìn)行比較，可以間接獲得受檢樣品中FXIa的水平。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式
，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見(jiàn)地得到的技術(shù)方案的簡(jiǎn)單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。縮略詞對(duì)照表
權(quán)利要求
1.人靜脈注射免疫球蛋白中活化凝血因子X(jué)I檢測(cè)方法，其特征是按以下步驟進(jìn)行:(I)枸櫞酸鈉抗凝血漿中加入玉米胰蛋白酶抑制物，可特異、有效地避免因在采血過(guò)程中F凝血因子X(jué)I的預(yù)活化，從而得到不含活化凝血因子(FXIa)的血漿，從而分離制備出不含活化凝血因子(FXIa)的PPP ； (2)反應(yīng)體系中加入凝血酶特異性熒光底物，特異的凝血酶熒光底物以及磷脂劑濃度的確定:凝血酶特異性熒光底物選擇B-VA-AMC，對(duì)不同濃度底物進(jìn)行篩選，其中底物工作濃度為f7mmol/L ;磷脂劑選則腦磷脂，選擇工作濃度為f3.5iimol/L ;利用分光光度計(jì)連接計(jì)算機(jī)對(duì)凝血過(guò)程進(jìn)行掃描，通過(guò)熒光信號(hào)強(qiáng)弱，可間接反映凝血酶生成含量變化，最后繪制動(dòng)力學(xué)曲線； (3)不同含量的活化人凝血因子FXIa標(biāo)準(zhǔn)品或人靜脈注射丙種球蛋白樣本中加入含磷脂劑的凝血酶熒光底物以及鈣離子源啟動(dòng)凝血酶生成反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果通過(guò)熒光分光光度計(jì)檢監(jiān)測(cè)凝血酶生成過(guò)程中熒光值的變化，最后使用GraphPad軟件處理數(shù)據(jù)得到凝血酶生成曲線，將受檢樣品的凝血酶生成含量達(dá)到最高時(shí)所需時(shí)間TTP與FXIa標(biāo)準(zhǔn)品的TTP進(jìn)行比較，可以間接獲得受檢樣品中FXIa的水平。
全文摘要
本發(fā)明人靜脈注射免疫球蛋白中制品中活化凝血因子X(jué)I檢測(cè)方法，①將IVIG樣品與一種經(jīng)特殊預(yù)處理的人乏血小板血漿(PPP)混合；②向反應(yīng)體系中添加含有磷脂劑的凝血酶特異熒光底物；③添加起始因子啟動(dòng)TGT,該起始因子組分包括一種鈣離子源、一種磷脂劑；④優(yōu)化的反應(yīng)體系獲得提供參數(shù)的凝血酶生成曲線；⑤受檢樣品凝血酶含量達(dá)到峰值時(shí)所需時(shí)間TTP與樣品中所含F(xiàn)XIa水平呈負(fù)有關(guān)。將受檢樣品TTP與FXIa標(biāo)準(zhǔn)品TTP進(jìn)行比較，可以間接獲得受檢樣品中FXIa的水平。這種活化凝血因子FXIa的檢測(cè)方法，適用于人靜脈注射丙種球蛋白(IVIG)制品中殘留的微量FXIa的檢測(cè)，及用于體外評(píng)估相關(guān)制品的致栓性風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK103185710SQ20131004174
公開(kāi)日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2013年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月4日
發(fā)明者馬莉, 孫盼, 李長(zhǎng)清, 袁靖, 陳云華, 劉欣晏, 楊剛 申請(qǐng)人:貴州泰邦生物制品有限公司, 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所