專利名稱：毛細(xì)管酶陣列微反應(yīng)器及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化微反應(yīng)器制作的技術(shù)領(lǐng)域，涉及毛細(xì)管電泳、酶的固載化、陣列酶固定技術(shù)，屬于毛細(xì)管電泳技術(shù)的新型微型化生化反應(yīng)裝置。
背景技術(shù)：
酶微反應(yīng)器是將生物分子固定技術(shù)與現(xiàn)代生化微分析方法相結(jié)合產(chǎn)生的一種新型生化反應(yīng)裝置。這種微型化的反應(yīng)系統(tǒng)由于兼具固定化酶的特異性識(shí)別、可重復(fù)利用及微分析的低消耗等優(yōu)點(diǎn)，在生命科學(xué)研究如蛋白質(zhì)組學(xué)、蛋白酶抑制劑篩選等領(lǐng)域具有非常重要的作用。目前最常見的技術(shù)是毛細(xì)管電泳酶微反應(yīng)器。該技術(shù)結(jié)合了酶的特異性識(shí)別和毛細(xì)管電泳高效分離的優(yōu)點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)(1: Bao J, Regnier F E.J Chromatogr,1992, 608, 217-224 ;2: Kato M, Saka1-Kato K, et al.Anal Chem, 2004, 76,1896-1902 ；3:康經(jīng)武唐忠美發(fā)明專利公開號(hào):CN 1737561A; 4: Tang Z, Wang T,Kang J.Electrophoresis, 2007, 27, 2981 - 2987 ；5:葉芳貴張愛珠陸俊宇趙書林發(fā)明專利公開號(hào):CN102391947A;)等先后有對(duì)毛細(xì)管酶微反應(yīng)器的制作進(jìn)行了報(bào)道。當(dāng)前所研究及報(bào)道的毛細(xì)管電泳酶微反應(yīng)器本質(zhì)屬于單一型酶微反應(yīng)器，制作步驟較為復(fù)雜。并且該類反應(yīng)器只能針對(duì)一種酶的生化行為進(jìn)行研究，限制了它的應(yīng)用，不適合高通量研究?，F(xiàn)有技術(shù)中雖然報(bào)道了毛細(xì)管電泳酶微反應(yīng)器陣列，但該陣列需要應(yīng)用多根毛細(xì)管，難以做到微型化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種高通量的毛細(xì)管酶陣列微反應(yīng)器，能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)多種酶與分析物的相互作用研究并進(jìn)行在線分析。其方法簡(jiǎn)便、通用且成本低。相對(duì)于目前已報(bào)道的毛細(xì)管電泳酶微反應(yīng)器，本發(fā)明可以擴(kuò)展到多種酶的共固定，形成酶陣列，進(jìn)行更高通量的酶反應(yīng)研究。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的毛細(xì)管酶陣列微反應(yīng)器，包括毛細(xì)管以及在毛細(xì)管的一端內(nèi)壁依次排列具有生物催化活性的酶陣列，所述的毛細(xì)管為石英毛細(xì)管，內(nèi)徑為25-220um ;所述的酶陣列微反應(yīng)器依次集成3_10種類型的酶。其所述的毛細(xì)管柱為石英毛細(xì)管柱,柱內(nèi)徑為25_220um。其所述的陣列酶是各種受體蛋白，磷酸化酶、水解酶等，如表皮生長(zhǎng)因子受體，嘌呤核苷磷酸化酶，胰蛋白酶等。其所述酶陣列反應(yīng)器的酶固定過程中可以采用共價(jià)鍵結(jié)合的固定方法，如采用濃度為10%的3-氨丙基三甲氧基硅烷乙醇溶液對(duì)毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行氨基化衍生，也即硅烷化試劑3-氨丙基三甲氧基硅烷水解可產(chǎn)生硅氧負(fù)離子，在酸性條件下可通過硅醚鍵與毛細(xì)管相連接，從而在另一端衍生出氨基。其所述的酶陣列反應(yīng)器的酶的羧基基團(tuán)可與氨基反應(yīng)生成酰胺鍵，通過共價(jià)結(jié)合方式使蛋白酶固定于毛細(xì)管內(nèi)壁。
其所述的酶陣列反應(yīng)器的酶為多種酶陣列，可適用于多種蛋白質(zhì)酶的共固定，形成酶陣列反應(yīng)器。其所述的反應(yīng)器中陣列酶的位置可通過調(diào)節(jié)進(jìn)樣壓力和時(shí)間進(jìn)行控制。其所述的毛細(xì)管酶陣列微反應(yīng)器的制備方法為:首先對(duì)毛細(xì)管內(nèi)壁用0.1-1mol/L的鹽酸預(yù)處理10-30min,再用去離子水沖洗5_10min ;接著利用毛細(xì)管電泳壓力從進(jìn)口端注入一段30-60mm的濃度為10%的3-氨丙基三甲氧基硅烷乙醇溶液，孵化反應(yīng)60_240min ；反向通入空氣去除未鍵合于毛細(xì)管內(nèi)壁的硅烷化試劑后將毛細(xì)管進(jìn)口端與出口端分別置于去離子水中3-10min進(jìn)行清洗；然后壓力進(jìn)樣注入第一段濃度為4-8u/ml的固定酶溶液，長(zhǎng)度為5-15mm，接著正向注入空氣將酶推入到距離進(jìn)樣口較遠(yuǎn)一端與3-氨丙基三甲氧基硅烷反應(yīng)10-20min后清洗進(jìn)口端；重復(fù)以上固定酶步驟，將其它酶依次注入到毛細(xì)管內(nèi)形成酶陣列；酶陣列孵化鍵合至少60min以上，反向通入空氣去除未鍵合的酶；最后將毛細(xì)管進(jìn)口端與出口端分別置于去離子水中3-10min進(jìn)行清洗并采用pH為7.5-9.5，濃度為50-200mmol/L 的緩沖液沖洗 1-lOmin。其所述的毛細(xì)管酶陣列微反應(yīng)器，可基于毛細(xì)管電泳技術(shù)和液相色譜技術(shù)，將分析物注入到毛細(xì)管內(nèi)與毛細(xì)管內(nèi)的陣列酶發(fā)生生物分子間的相互作用。然后通過分離，使分析物或相互作用后的產(chǎn)物流經(jīng)毛細(xì)管微通道，在檢測(cè)窗口處被檢測(cè)到并記錄下譜圖，通過峰形、峰面積、出峰數(shù)量來監(jiān)測(cè)生物分子間的相互作用情況。


圖1為毛細(xì)管酶陣列微反應(yīng)器制備示意圖(1、2、3、4代表不同的酶)；
圖2為制備的胰蛋白酶(Trypsin)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、激活后的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的毛細(xì)管酶陣列微反應(yīng)器。將其安裝到毛細(xì)管電泳儀后，分別單獨(dú)通入Trypsin的底物N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸(BAEE)、PNP的底物肌苷及EGFR底物的三磷酸腺苷(ATP)，孵化、分離后檢測(cè)到的底物和產(chǎn)物峰；
圖3為BAEE、ATP和肌苷混合物同時(shí)通入上述制備的毛細(xì)管酶陣列反應(yīng)器，孵化后利用電泳檢測(cè)的樣品峰(從左至右依次為:1.BAEE, 2.ATP，3.次黃嘌呤(肌苷的產(chǎn)物)，4.肌苷，5.BA (BAEE 的產(chǎn)物)，6.ADP (ATP 的產(chǎn)物);
圖4為BAEE、ATP、肌苷和陰性對(duì)照色氨酸混合物同時(shí)通入毛細(xì)管酶陣列微反應(yīng)器，孵化后利用電泳檢測(cè)的樣品峰(從左至右依次為:1.BAEE，2.次黃嘌呤，3.ATP, 4.色氨酸，5.肌苷，6.BA, 7.ADP)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
毛細(xì)管酶陣列微反應(yīng)器具體的制備過程:將50cm長(zhǎng)的裸毛細(xì)管安裝在毛細(xì)管電泳儀上,0.lmol/L鹽酸預(yù)處理30min后,用去離子水沖洗IOmin。在毛細(xì)管進(jìn)樣端以0.5psi X65s的壓力，下注入長(zhǎng)度為41.78mm的3-氨丙基三甲氧基硅烷乙醇溶液(10%)，孵化反應(yīng)120min。反向通空氣IOmin去除未鍵合的娃燒化試劑,將進(jìn)樣端與出樣端浸入到去離子水中5min進(jìn)行清洗。氨基衍生完成后，使用0.5psi X 15s進(jìn)樣壓力，注入一段9.64mm的Trypsin溶液(4u/ml)。利用空氣進(jìn)樣將酶溶液推入到距離毛細(xì)管進(jìn)樣口 32.14mm的位置，反應(yīng)IOmin后反向通空氣去除未鍵合的Trypsin。以相同壓力再次注入一段9.64mm的EGFR(5u/ml)和表皮生長(zhǎng)因子(0.lng/ml)的混合溶液，利用空氣進(jìn)樣將此酶溶液推入到距離毛細(xì)管進(jìn)樣口 16.07mm的位置，反應(yīng)IOmin后反向通空氣去除未鍵合的EGFR。毛細(xì)管兩端浸入去離子水中5min進(jìn)行清洗。最后注入9.64mm的PNP溶液(5u/ml),使其位于毛細(xì)管進(jìn)樣端口 5mm的位置。反應(yīng)IOmin后反向通空氣去除未鍵合的PNP。形成酶陣列后再孵化90min,未結(jié)合的酶使用反向空氣流清除后洗針。最后用緩沖液緩慢沖洗，制備得到含3種酶的微陣列反應(yīng)器。本發(fā)明的毛細(xì)管酶陣列微反應(yīng)器制備方法簡(jiǎn)便，可適用于不同種類的蛋白酶反應(yīng)器的制備。并且可以達(dá)到多種酶分段獨(dú)立固定的效果，酶微反應(yīng)器的長(zhǎng)度及不同酶的固定位置可通過進(jìn)樣壓力和時(shí)間進(jìn)行調(diào)節(jié)。由上述構(gòu)成的毛細(xì)管電泳酶陣列微反應(yīng)器在用于電泳時(shí)，樣品與特定固載酶發(fā)生特異性相互作用后，在電泳、電滲、壓力等因素的共同作用下，由毛細(xì)管的一端向另一端運(yùn)動(dòng)。在運(yùn)動(dòng)的過程中，樣品的各組分被濃縮并分離。當(dāng)樣品經(jīng)過電泳圖譜采集系統(tǒng)時(shí)，由其記錄下樣品的圖譜；并在相應(yīng)記錄系統(tǒng)中進(jìn)行信號(hào)實(shí)時(shí)顯示和在線或離線處理。實(shí)施例2
使用實(shí)施例1的毛細(xì)管酶陣列微反應(yīng)器，在石英毛細(xì)管內(nèi)壁(內(nèi)徑50 μ m，有效長(zhǎng)度40cm)構(gòu)筑了 3種酶微反應(yīng)器，具體為進(jìn)口端口有長(zhǎng)度為9.64mm的PNP微反應(yīng)器；距離進(jìn)口端16.07mm的位置有長(zhǎng)度為9.64mm的EGFR酶微反應(yīng)器；距離進(jìn)口端32.14mm位置有長(zhǎng)度為9.64mm的Trypsin微反應(yīng)器。將該陣列反應(yīng)器安裝至毛細(xì)管電泳儀上?；诿?xì)管電泳操作程序，經(jīng)H20、100mmol/L硼砂-硼酸緩沖液ρΗ8.0依次壓力沖洗干凈,壓力注入Immol/LBAEE到陣列微反應(yīng)器的位置，長(zhǎng)度不超過酶陣列區(qū)的總長(zhǎng)度，孵化5min后，加25kV正向電壓進(jìn)行分離。采用紫外檢測(cè)，收集200nm的電泳圖譜，可以獲得底物和產(chǎn)物紫外吸收峰見圖2a ；
同上條件，分別壓力注入lmmol/LATP或肌苷到酶陣列微反應(yīng)器的位置，長(zhǎng)度不超過酶陣列區(qū)的總長(zhǎng)度。孵化5min后，加25kV正向電壓進(jìn)行分離。采用紫外檢測(cè)，收集200nm的電泳圖譜，可以獲得底物和產(chǎn)物紫外吸收峰見圖2b和2c。實(shí)施例3
使用實(shí)施例1的制備毛細(xì)管酶陣列微反應(yīng)器，安裝至毛細(xì)管電泳儀上?；诿?xì)管電泳操作程序，經(jīng)H20、100mmol/L硼砂-硼酸緩沖液ρΗ9.5依次壓力沖洗干凈，壓力注入ImmoI/LBAEE, ATP和肌苷混合溶液到反應(yīng)器內(nèi)，長(zhǎng)度覆蓋酶陣列區(qū)。孵化5min后，加25kV正向電壓進(jìn)行分離。采用紫外檢測(cè)，收集200nm的電泳圖譜，可以獲得底物和產(chǎn)物紫外吸收峰見圖3 (從左至右依次為:1.BAEE, 2.ATP, 3.次黃嘌呤，4.肌苷，5.BA，6.ADP)。實(shí)施例4
使用實(shí)施例1的制備毛細(xì)管酶陣列微反應(yīng)器，安裝至毛細(xì)管電泳儀上?；诿?xì)管電泳操作程序，經(jīng)H20、100mmol/L硼砂-硼酸緩沖液ρΗ9.5依次壓力沖洗干凈，壓力注入lmmol/LBAEE、ATP、肌苷和陰性對(duì)照色氨酸混合溶液到反應(yīng)器內(nèi)，長(zhǎng)度覆蓋酶酶陣列區(qū)，孵化5min后，加25kV正向電壓進(jìn)行分離。采用紫外檢測(cè)，收集200nm的電泳圖譜，可以獲得底物和產(chǎn)物紫外吸收峰見圖4 (從左至右依次為:1.BAEE，2.次黃嘌呤，3.ATP, 4.色氨酸，5.肌苷，6.BA, 7.ADP )。
通過上述實(shí)施例可以看出，本發(fā)明將毛細(xì)管電泳和酶陣列微反應(yīng)器制備技術(shù)聯(lián)用，具有以下顯著特點(diǎn):
可以實(shí)現(xiàn)多種靶標(biāo)酶的分段共固定，用于在線分析酶與待分析樣品的特異性相互作用，可通過峰面積、峰形、出峰時(shí)間等變化進(jìn)行觀察。1.對(duì)分析物與固載酶發(fā)生特異性相互作用后產(chǎn)生的峰面積變化，可以給予確鑿的定性。2.可以通過注入不同濃度底物，通過峰面積值變化，計(jì)算酶反應(yīng)活性。3.共價(jià)鍵結(jié)合普遍適用于固定不同種類蛋白酶，也可實(shí)現(xiàn)多種酶的共固定，對(duì)于高通量篩選具有重大意義。4.可以通過固定不同類型蛋白酶，利用酶的不同功能進(jìn)行針對(duì)性研究，例如固定Trypsin可用于蛋白水解,作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的輔助工具。以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何不經(jīng)過創(chuàng)造性勞動(dòng)想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所限定的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種毛細(xì)管酶陣列微反應(yīng)器，其特征在于:包括至少一根毛細(xì)管以及在單一毛細(xì)管樣品進(jìn)口端內(nèi)壁依序分段排列具有能與底物相互作用的酶陣列，所述的毛細(xì)管為石英毛細(xì)管，內(nèi)徑為25-220um ;所述的酶陣列分段集成3_10種類型的酶。
2.根據(jù)權(quán)利I所述的毛細(xì)管酶陣列微反應(yīng)器，其特征在于:所述的酶通過共價(jià)鍵結(jié)合固定于毛細(xì)管而形成；不同酶固定在毛細(xì)管中的不同位置。
3.權(quán)利要求1或2的毛細(xì)管酶陣列微反應(yīng)器，其特征在于:所述的酶陣列的總長(zhǎng)度占毛細(xì)管的總長(zhǎng)度為8-12%。
4.權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的毛細(xì)管酶陣列微反應(yīng)器的制備方法，其特征在于毛細(xì)管的一端內(nèi)壁進(jìn)行氨基化衍生，然后通過調(diào)節(jié)不同酶的進(jìn)樣壓力和時(shí)間，以控制酶的固定位置從而形成陣列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于:首先對(duì)毛細(xì)管內(nèi)壁用0.1-1mol/L的鹽酸預(yù)處理10-30min，再用去離子水沖洗5_10min ;接著利用毛細(xì)管電泳壓力從樣品進(jìn)口端注入一段30-60mm的濃度為10%的3-氨丙基三甲氧基硅烷乙醇溶液，反應(yīng)鍵合60-240min ;反向通入空氣去除未鍵合于毛細(xì)管內(nèi)壁的硅烷化試劑后將毛細(xì)管進(jìn)口端與出口端分別置于去離子水中3-10min進(jìn)行清洗；然后壓力進(jìn)樣注入第一段濃度為4-8u/ml的固定酶溶液，長(zhǎng)度為5-15mm,接著正向注入空氣將酶推入到距離進(jìn)樣口較遠(yuǎn)一端與3-氨丙基三甲氧基硅烷孵化反應(yīng)10-20min ;反向通入空氣推出后多余的酶溶液并清洗毛細(xì)管進(jìn)口端；重復(fù)以上固定步驟，將其它酶依次注入到毛細(xì)管內(nèi)形成單獨(dú)區(qū)段的酶陣列；酶陣列孵化60min以上后反向通入空氣去除未鍵合的酶；最后將毛細(xì)管進(jìn)口端與出口端分別置于去離子水中3-10min進(jìn)行清洗并采用pH為7.5-9.5、濃度為50-200mmol/L的緩沖液沖洗1-1Omin0
6.權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的毛細(xì)管酶陣列微反應(yīng)器在檢測(cè)酶與底物相互作用中的應(yīng)用，其特征在于:基于毛細(xì)管電泳技術(shù)和液相色譜技術(shù)同時(shí)實(shí)現(xiàn)多種酶與底物的相互作用的檢測(cè)。
7.權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的毛細(xì)管酶陣列微反應(yīng)器在同時(shí)應(yīng)用于多種酶抑制劑的高通量篩選中的應(yīng)用，其特征在于:基于毛細(xì)管電泳技術(shù)和液相色譜技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行篩選。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種毛細(xì)管酶陣列微反應(yīng)器及應(yīng)用。本發(fā)明基于共價(jià)固定技術(shù)將多種酶可尋址分段的構(gòu)筑于毛細(xì)管內(nèi)，構(gòu)成酶陣列微反應(yīng)器。該反應(yīng)器是多種類型酶反應(yīng)器的集成，單位時(shí)間內(nèi)可同時(shí)實(shí)現(xiàn)多種酶相互作用的高通量分析，大大縮短了研究周期。其方法簡(jiǎn)便、成本低廉、分析高效且易于自動(dòng)化，用于酶抑制劑、藥物的高通量篩選等，具有重大的科研價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)G01N27/453GK103091385SQ20131004443
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月5日
發(fā)明者申剛義, 于婉婷, 張愛芹, 崔箭, 曾鳴, 烏日?qǐng)D 申請(qǐng)人:中央民族大學(xué)