專利名稱：快速鑒別重組乙型肝炎疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速鑒別重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品質(zhì)量的方法，所述方法可以快速而有效地檢測重組乙型肝炎疫苗類產(chǎn)品的品質(zhì)，特別是可以快速判斷此類產(chǎn)品的真?zhèn)巍?br> 背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒Ofepatitis B Virus，可縮寫HBV)是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科(hepadnavividae)。HBV能夠引起肝臟炎性病變。甚至肝硬化和肝癌。全球約有
3.8億HBV慢性感染者，我國是乙肝病毒感染的高發(fā)區(qū)，約有1.2億人是乙型肝炎表面抗原(HBV Surface antigen，HBsAg)攜帶者。因此，接種乙型肝炎疫苗是阻斷HBV傳播最有效的方法。在本發(fā)明中，提及的術(shù)語“重組乙型肝炎疫苗(酵母)”表示的含義是其屬于生物制品的一種，是重組酵母(例如釀酒酵母或漢遜酵母)表達(dá)的HBsAg經(jīng)純化，加入鋁佐劑而成，可以直接肌肉注射到病人體內(nèi)，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗乙型肝炎病毒的保護(hù)性抗體，用于預(yù)防乙型肝炎。市售的重組乙型肝炎疫苗為乳白色混懸液體，規(guī)格一般按照含HBsAg的量分為
10μ g/ml和20 μ g/ml兩種。接種對象主要是乙型肝炎易感者，包括新生兒、從事醫(yī)療工作的醫(yī)護(hù)人員以及其他高危人群。有資料顯示，中國乙型肝炎疫苗每年的需求量約3600萬份，并以每年15%的速度大幅度增長，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于全球10%的平均增長水平。疫苗檢驗(yàn)的速度要能跟上市場增長的需求，而疫苗成品檢測周期比較長。目前，重組乙型肝炎疫苗的檢驗(yàn)主要依據(jù)《中國藥典》2010年版三部，其中的鑒別試驗(yàn)可以快速鑒別疫苗的真?zhèn)?。該鑒別試驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢查，應(yīng)證明含有HBsAg。由于重組酵母表達(dá)的HBsAg與鋁佐劑通過物理作用力吸附在一起很難解離下來，用ELISA的方法直接檢測存在困難。根據(jù)以往的實(shí)驗(yàn)需要用處理液解離，再稀釋到合適的濃度后進(jìn)行檢測。此外，衛(wèi)生部要求自2010年10月I日起執(zhí)行《中華人民共和國藥典(2010年版)》后，HBsAg ELISA試劑盒由原來的一步法變?yōu)閮刹椒?，檢驗(yàn)時間也由原來的2個小時左右增加到3個多小時。ELISA檢測時間的延長，再加上樣品前處理的時間，一個鑒別試驗(yàn)要用4-5個小時才能完成，操作過程繁瑣且消耗時間長，不能體現(xiàn)鑒別試驗(yàn)快速檢驗(yàn)的特點(diǎn)。因此，迫切需要一種檢測速度快、專屬性強(qiáng)的高效檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速鑒別重組乙型肝炎疫苗(酵母)產(chǎn)品質(zhì)量的方法，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)采用如本發(fā)明所述方法可以快速而有效地檢測重組乙型肝炎疫苗(酵母)類產(chǎn)品的品質(zhì)，特別是可以快速判斷此類產(chǎn)品的真?zhèn)?。此外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，該方法不但適用于重組乙型肝炎疫苗(釀酒酵母)和重組乙型肝炎疫苗(漢遜酵母)等重組酵母表達(dá)獲得的乙型肝炎疫苗，而且還適用于甲型乙型肝炎聯(lián)合疫苗這種包含重組乙型肝炎疫苗(酵母)的混配物。
具體而言，本發(fā)明第一方面提供了一種快速鑒別重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品質(zhì)量的方法，該方法包括以下步驟:(i)取待檢測的重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品，用處理液對該產(chǎn)品進(jìn)行解離，得到經(jīng)解離處理的重組乙型肝炎疫苗測試液；(ii)將步驟(i)所得測試液加載到膠體金試紙條的加樣端(本領(lǐng)域技術(shù)人員通常將該加樣端制成加樣墊的形式，因此該加樣端亦可稱為加樣墊)，或者將膠體金試紙條的加樣端浸入到步驟(i)所得測試液中；(iii)測試液在毛細(xì)作用下沿膜向膠體金試紙條的另一端(本領(lǐng)域技術(shù)人員通常將該另一端制成吸水墊的形式，因此該另一端亦可稱為吸水墊)移動，觀察膠體金試紙條檢測區(qū)的質(zhì)控線和檢測線顯色情況；(iv)根據(jù)膠體金試紙條檢測區(qū)的質(zhì)控線和檢測線顯色情況，判斷所測重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述的重組乙型肝炎疫苗選自:重組乙型肝炎疫苗(釀酒酵母)、重組乙型肝炎疫苗(漢遜酵母)、甲型乙型肝炎聯(lián)合疫苗。上述三種疫苗均已收載于2010年版中國藥典三部中；然而，盡該藥典還收載了另一種乙型肝炎疫苗即重組乙型肝炎疫苗(CH0細(xì)胞)，然而令人遺憾的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明方法針對這種乙型肝炎疫苗卻并不適用，例如本發(fā)明方法針對該重組乙型肝炎疫苗(CH0細(xì)胞)的最低靈敏度在50 μ g/ml以上，而本發(fā)明方法針對上述三種疫苗的最低靈敏度在2 μ g/ml以下。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述的處理液是包含TritonX-100、二乙醇胺和PBS的水溶液。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述的處理液中包含0.1-0.3%的TritonX-100,2-3%的二乙醇胺和2-10mmol/L的PBS。其中所述“2-10mmol/L的PBS”是指以磷酸根離子計的摩爾濃度，在本發(fā)明中有類似表述時，亦具有類似含義。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述的處理液中包含0.2%的Triton X-100、
2.5%的二乙醇胺和約5.3mmol/L的PBS。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述的PBS是磷酸二氫鈉二水合物與磷酸氫二鈉十二水合物以重量比1:7.5的比例的組合。在本發(fā)明下文具體實(shí)施方式
的試驗(yàn)中，如未另外說明，所用到的處理液中包含:0.2%的Triton X-100、
2.5%的二乙醇胺和5.3mmol/L的PBS，所述PBS是磷酸二氫鈉二水合物與磷酸氫二鈉十二水合物以重量比1-J.5的比例的組合。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述的處理液是用10%TritonX_100、20% 二乙醇胺和PBS溶液混合配制成的。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述的PBS溶液是指以磷酸根離子計的摩爾濃度 6.2mmol/L 的 PBS 溶液。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述的PBS溶液是照如下方法配制的:取磷酸二氫鈉二水合物0.226g與磷酸氫二鈉十二水合物1.698g，加適量水溶解，加水稀釋至1000ml,即得(為 6.2mmol/L 的 PBS 溶液)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述的處理液是用0.20ml的10%TritonX-100、1.25ml的20% 二乙醇胺和8.55ml的PBS溶液混合配制成的。在本發(fā)明第一方面方法的一個實(shí)施方案中，所述的處理液是用0.20ml的10%Triton X_100、l.25ml的20% 二乙醇胺和8.55ml的PBS溶液混合配制成的，并且所述PBS溶液是照如下方法配制的:取磷酸二氫鈉二水合物0.226g與磷酸氫二鈉十二水合物
1.698g，加適量水溶解，加水稀釋至1000ml，即得。在使用此處理液時，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，如果向該處理液中加入濃度約0.7^0.9%的氯化鈉時，出現(xiàn)質(zhì)控線和檢測線顯色暗淡，并且針對重組乙型肝炎疫苗(釀酒酵母)和重組乙型肝炎疫苗(漢遜酵母)的最低靈敏度在35 μ g/ml以上，因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明處理液中未添加氯化鈉。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述的重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品中，乙型肝炎表面抗原含量可以為5-50 μ g/ml的范圍，例如10-20 μ g/ml的范圍，例如為10 μ g/ml或20 μ g/mlο根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(i)中所述的解離是在室溫下進(jìn)行的。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(i)中所述的解離是照如下方式進(jìn)行的:取所述待檢測的重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品500 μ I (該體積可記為VI)，離心并棄去上清460 μ 1，下層溶液(其體積可記為V2)中加處理液40 μ I (該體積可記為V3)，混勻，使進(jìn)行反應(yīng)(例如進(jìn)行約10-30min，在本發(fā)明下文具體實(shí)施方式
的試驗(yàn)中，如未另外說明，反應(yīng)進(jìn)行約15min)，得到待測樣品溶液，得到經(jīng)解離處理的重組乙型肝炎疫苗測試液。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(ii)中所述的膠體金試紙條由加樣墊(其在本發(fā)明中亦可稱為加樣端，測試液樣品由此端添加)、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊順次連接而成。

根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(ii)中，所述膠體金試紙條的膠體金結(jié)合墊包被有膠體金-抗體。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(ii)中，所述膠體金試紙條的硝酸纖維素膜包被有相互分離的、依次平行排列的檢測線和質(zhì)控線，所述依次平行排列的方向?yàn)樗黾訕訅|至所述吸樣墊的方向。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(ii)中，所述硝酸纖維素膜上的所述檢測線為包被在硝酸纖維素膜上的抗_HBs。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(ii)中，所述硝酸纖維素膜上的所述質(zhì)控線為包被在硝酸纖維素膜上的羊抗鼠IgG。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(ii)中，所述膠體金試紙條由加樣墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊順次連接而成；所述膠體金結(jié)合墊包被有膠體金-抗體；所述硝酸纖維素膜包被有相互分離的、依次平行排列的檢測線和質(zhì)控線，所述依次平行排列的方向?yàn)樗黾訕訅|至所述吸樣墊的方向；所述檢測線為包被在硝酸纖維素膜上的抗-HBs ;所述質(zhì)控線為包被在硝酸纖維素膜上的羊抗鼠IgG。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(iii)中，使測試液在毛細(xì)作用下沿膜移至膠體金試紙條的吸水墊后，在30分鐘內(nèi)觀察膠體金試紙條檢測區(qū)的質(zhì)控線和檢測線顯色情況。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(iv)中，如果膠體金試紙條檢測區(qū)的質(zhì)控線和檢測線位置同時出現(xiàn)顯色條帶(通常而言在白色背景下顯典型的鮮紅色條帶)，則可斷定所測重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品為真品(即含有乙型肝炎表面抗原)；如果膠體金試紙條檢測區(qū)僅質(zhì)控線位置出現(xiàn)顯色條帶，則可斷定所測重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品為偽劣產(chǎn)品(即其中不含有乙型肝炎表面抗原)。本發(fā)明第二方面提供了一種用于快速鑒別重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品質(zhì)量的試劑盒，該試劑盒中包括:(a)處理液；(b)膠體金試紙條；和(C)操作方法說明書。根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述的重組乙型肝炎疫苗選自:重組乙型肝炎疫苗(釀酒酵母)、重組乙型肝炎疫苗(漢遜酵母)、甲型乙型肝炎聯(lián)合疫苗。根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述的處理液是溶解在一個瓶子中的包含Triton X-100、二乙醇胺和PBS的水溶液(預(yù)先配制好的，即用型)。根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述的處理液中包含0.1-0.3%的TritonX-100、2-3% 的二乙醇胺和 2-1OmmoI/L 的 PBS。根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述的處理液中包含0.2%的Triton X-100、
2.5%的二乙醇胺和約5.3mmol/L的PBS。根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述的PBS是磷酸二氫鈉二水合物與磷酸氫二鈉十二水合物以重量比1:7.5的比例的組合。根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述的處理液是用10%TritonX-100、20% 二乙醇胺和PBS溶液混合配制成的。根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述的PBS溶液是指以磷酸根離子計的摩爾濃度6.2mmol/L的PBS溶液。根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述的PBS溶液是照如下方法配制的:取磷酸二氫鈉二水合物0.226g與磷酸氫二鈉十二水合物1.698g，加適量水溶解，加水稀釋至1000ml,即得(為 6.2mmol/L 的 PBS 溶液)。根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述的處理液是用0.20ml的10%TritonX-100、1.25ml的20% 二乙醇胺和8.55ml的PBS溶液混合配制成的。在本發(fā)明第二方面試劑盒的一個實(shí)施方案中，所述的處理液是用0.20ml的10%Triton X_100、l.25ml的20% 二乙醇胺和8.55ml的PBS溶液混合配制成的，并且所述PBS溶液是照如下方法配制的:取磷酸二氫鈉二水合物0.226g與磷酸氫二鈉十二水合物
1.698g，加適量水溶解，加水稀釋至1000ml，即得。根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述的處理液包括三個相互隔離的溶液(即分別分裝在三個瓶子中的溶液)，在臨用時將它們現(xiàn)混，所述三個溶液分別是:10%TritonX-100溶液、20% 二乙醇胺溶液和PBS溶液。其中所述PBS溶液是照如下方法配制的:取磷酸二氫鈉二水合物0.226g與磷酸氫二鈉十二水合物1.698g，加適量水溶解，加水稀釋至1000ml,即得(濃度以磷酸根離子計為6.2mmol/L)。在一個實(shí)施方案中，所述的處理液是在臨用時將上述三個相互隔離的溶液(即分別分裝在三個瓶子中的溶液)現(xiàn)混配成，混合比例是:0.20ml 的 10%Triton X-100、1.25ml 的 20% 二乙醇胺和 8.55ml 的 PBS 溶液。根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述的膠體金試紙條由加樣墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊順次連接而成。根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述膠體金試紙條的膠體金結(jié)合墊包被有膠體金-抗體。根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述膠體金試紙條的硝酸纖維素膜包被有相互分離的、依次平行排列的檢測線和質(zhì)控線，所述依次平行排列的方向?yàn)樗黾訕訅|至所述吸樣墊的方向。
根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述硝酸纖維素膜上的所述檢測線為包被在硝酸纖維素膜上的抗-HBs。根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述硝酸纖維素膜上的所述質(zhì)控線為包被在硝酸纖維素膜上的羊抗鼠IgG。根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述膠體金試紙條由加樣墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊順次連接而成；所述膠體金結(jié)合墊包被有膠體金-抗體；所述硝酸纖維素膜包被有相互分離的、依次平行排列的檢測線和質(zhì)控線，所述依次平行排列的方向?yàn)樗黾訕訅|至所述吸樣墊的方向；所述檢測線為包被在硝酸纖維素膜上的抗-HBs ;所述質(zhì)控線為包被在硝酸纖維素膜上的羊抗鼠IgG。根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述操作方法說明書記載了使用該試劑盒進(jìn)行快速鑒別重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品質(zhì)量的方法，該方法包括以下步驟:(i)取待檢測的重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品，用處理液對該產(chǎn)品進(jìn)行解離，得到經(jīng)解離處理的重組乙型肝炎疫苗測試液；(ii)將步驟(i)所得測試液加載到膠體金試紙條的加樣端，或者將膠體金試紙條的加樣端浸入到步驟(i)所得測試液中；(iii)測試液在毛細(xì)作用下沿膜向膠體金試紙條的另一端移動，觀察膠體金試紙條檢測區(qū)的質(zhì)控線和檢測線顯色情況；(iv)根據(jù)膠體金試紙條檢測區(qū)的質(zhì)控線和檢測線顯色情況，判斷所測重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量。根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述操作方法說明書中記載的重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品中，乙型肝炎表面抗原含量為10 μ g/ml或20 μ g/ml。根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述操作方法說明書中記載的解離是在室溫下進(jìn)行的。根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述操作方法說明書中記載的解離是照如下方式進(jìn)行的:取所述待檢測的重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品500 μ I (該體積可記為VI)，離心并棄去上清460 μ 1，下層溶液(其體積可記為V2)中加處理液40 μ I (該體積可記為V3)，混勻，使進(jìn)行反應(yīng)(例如進(jìn)行約10-30min，在本發(fā)明下文具體實(shí)施方式
的試驗(yàn)中，如未另外說明，反應(yīng)進(jìn)行約15min)，得到待測樣品溶液，得到經(jīng)解離處理的重組乙型肝炎疫苗測試液。根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述操作方法說明書中記載的步驟(iii)中，使測試液在毛細(xì)作用下沿膜移至膠體金試紙條的吸水墊后，在30分鐘內(nèi)觀察膠體金試紙條檢測區(qū)的質(zhì)控線和檢測線顯色情況。根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒，其中所述操作方法說明書中記載的步驟(iv)中，如果膠體金試紙條檢測區(qū)的質(zhì)控線和檢測線位置同時出現(xiàn)顯色條帶(通常而言在白色背景下顯典型的鮮紅色條帶)，則可斷定所測重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品為真品(即含有乙型肝炎表面抗原)；如果膠體金試紙條檢測區(qū)僅質(zhì)控線位置出現(xiàn)顯色條帶，則可斷定所測重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品為偽劣產(chǎn)品(即其中不含有乙型肝炎表面抗原)。本發(fā)明任一方面的任一實(shí)施方案可以與一個或多個其它實(shí)施方案進(jìn)行任意組合，只要這種組合不會出現(xiàn)矛盾。當(dāng)然在相互之間組合時，必要的話可對相應(yīng)特征作適當(dāng)修飾。下面對本發(fā)明的各個方面和特點(diǎn)作進(jìn)一步的描述。
本發(fā)明所引述的所有文獻(xiàn)，它們的全部內(nèi)容通過引用并入本文，并且如果這些文獻(xiàn)所表達(dá)的含義與本發(fā)明不一致時，以本發(fā)明的表述為準(zhǔn)。此外，本發(fā)明使用的各種術(shù)語和短語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般含義，即便如此，本發(fā)明仍然希望在此對這些術(shù)語和短語作更詳盡的說明和解釋，提及的術(shù)語和短語如有與公知含義不一致的，以本發(fā)明所表述的含義為準(zhǔn)。本發(fā)明所提供的快速鑒別重組乙型肝炎疫苗(酵母)的方法，是采用免疫膠體金技術(shù)對處理液解離后的待測乙型肝炎疫苗進(jìn)行檢測，根據(jù)顯色結(jié)果判斷所述待測乙型肝炎疫苗的真?zhèn)巍Ｉ鲜鲞^程中，所述用免疫膠體金技術(shù)對解離后的待測乙型肝炎疫苗進(jìn)行檢測的方法具體可為用膠體金試紙條對所述解離后的待測乙型肝炎疫苗進(jìn)行檢測。在本發(fā)明一個實(shí)施方案中，所述膠體金試紙條由加樣墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊順次連接而成；所述膠體金結(jié)合墊包被有膠體金-抗體；所述硝酸纖維素膜包被有相互分離的、依次平行排列的檢測線和質(zhì)控線，所述依次平行排列的方向?yàn)樗黾訕訅|至所述吸樣墊的方向；所述檢測線為包被在硝酸纖維素膜上的抗-HBs ;所述質(zhì)控線為包被在硝酸纖維素膜上的羊抗鼠IgG。在本發(fā)明一個實(shí)施方案中，所述根據(jù)顯色結(jié)果判斷所述待測乙型肝炎疫苗的真?zhèn)蔚姆椒ň唧w為下述1)、2):I)若所述膠體金試紙條上質(zhì)控線位置和檢測線位置同時出現(xiàn)顯色條帶，則所述待測乙型肝炎疫苗(酵母)為真品；2)若所述膠體金試紙條上僅質(zhì)控線位置出現(xiàn)顯色條帶，則所述待測乙型肝炎疫苗(酵母)為偽劣產(chǎn)品。在本發(fā)明一個實(shí)施方案中，所述處理液解離后的乙型肝炎疫苗(酵母)的理論濃度為 62.5 μ g/ml 或 125 μ g/ml。在本發(fā)明一個實(shí)施方案中，所述重組乙型肝炎疫苗(酵母)藥品為標(biāo)注內(nèi)含乙型肝炎表面抗原含量(M，其例如為10 μ g/ml或20 μ g/ml)的重組乙型肝炎疫苗藥品。在本發(fā)明一個實(shí)施方案中，所述處理液解離的乙型肝炎疫苗是按照如下所述方法得到的:將所述重組乙型肝炎疫苗500 μ I (Vl)，離心并棄去上清460 μ 1，下層溶液(V2，40 μ I)中加處理液40 μ I (V3)，在室溫下進(jìn)行反應(yīng)(例如10-30min,通常15min即可)，得到所述處理液解離的乙型肝炎疫苗；其中，所述理論濃度(C)的計算公式如下:C=M X V1A2 X V2/ (VV3)。在本發(fā)明一個實(shí)施方案中，所述處理液是用0.20ml的10%TritonX_100、1.25ml的20% 二乙醇胺和8.55ml的6.2mmol/L的PBS混合配制成的。在本發(fā)明一個實(shí)施方案中，所述膠體金試紙條可以根據(jù)已知方法制備，或者亦可以從市場上購得，例如可以是購自北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司的乙型肝炎表面抗原診斷試劑盒(膠體金法)，產(chǎn)品編號為:wj-1110。在本發(fā)明下文的具體試驗(yàn)中，如未另外說明，所述的膠體金試紙條是上述WJ-1110。在本發(fā)明一個實(shí)施方案中，適用的疫苗產(chǎn)品中，內(nèi)含乙型肝炎表面抗原含量可以為5-50 μ g/ml的范圍，例如10-20 μ g/ml的范圍，例如為10 μ g/ml或20 μ g/ml。
乙型肝炎表面抗原膠體金法診斷試劑條主要檢驗(yàn)臨床血液標(biāo)本HBsAg是否呈陽性，很少用于生物制品的檢測。本發(fā)明采用特定處理液將疫苗上的鋁佐劑解離下來，再用膠體金法檢測疫苗中的HBsAg。樣品前處理簡單，與《中國藥典》2010年版三部中采用ELI SA的方法檢測比較，需要的輔助儀器少，檢測速度快(本發(fā)明檢測時間連同樣品制備時間30min內(nèi)就能完成，而藥典方法需要在3小時以上)。另外，實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明方法具有很好的耐用性，并且靈敏度高、準(zhǔn)確度好、可重復(fù)性強(qiáng)、特異性高，不受其他生物制品的影響，檢測結(jié)果可靠。本發(fā)明采用膠體金標(biāo)記的抗體呈現(xiàn)鮮紅色，在白色背景下，條帶清晰，目視即可觀察，極易判讀；并且操作簡單，僅需將試紙條插入解離后的待測樣本中進(jìn)行測定，不需要專業(yè)技術(shù)人員。本發(fā)明適用于乙型肝炎疫苗(酵母)快速現(xiàn)場檢測的要求，特別是本發(fā)明方法可以在30min左右獲得結(jié)果，比現(xiàn)行藥典方法大大加快。


圖1為試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為試紙條的測試結(jié)果判斷示意圖。
具體實(shí)施例方式下面通過具體的實(shí)施例/實(shí)驗(yàn)例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但是，應(yīng)當(dāng)理解為，這些實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例僅僅是用于更詳細(xì)具體地說明之用，而不應(yīng)理解為用于以任何形式限制本發(fā)明。本發(fā)明對試驗(yàn)中所使用到的材料以及試驗(yàn)方法進(jìn)行一般性和/或具體的描述。雖然為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，在下文中，如果未特別說明，本發(fā)明所用材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中使用的試紙條為北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的乙型肝炎表面抗原診斷試劑盒(膠體金法)，產(chǎn)品編號為:wj-1110，生產(chǎn)批號:Y20120603。實(shí)施例1、快速鑒別重組乙型肝炎疫苗(酵母)的方法一、試紙條的結(jié)構(gòu)(圖1)所述膠體金試紙條由加樣墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊順次連接而成；所述膠體金結(jié)合墊包被有膠體金-抗體；所述硝酸纖維素膜包被有相互分離的、依次平行排列的檢測線和質(zhì)控線，所述依次平行排列的方向?yàn)樗黾訕訅|至所述吸樣墊的方向；所述檢測線為包被在硝酸纖維素膜上的抗-HBs ;所述質(zhì)控線為包被在硝酸纖維素膜上的羊抗鼠IgG ;所述加樣墊中部設(shè)一標(biāo)記有“MAX”的線，記作“MAX線”;所述檢測線、質(zhì)控線與MAX線平行。二、方法簡介:本方法基于膠體金免疫層析技術(shù)，以膠體金為顯色標(biāo)記物，將試紙條浸入測試液后，測試液由于毛細(xì)作用，沿膜向前移動。測試液中若含有HBsAg，達(dá)到金標(biāo)抗體區(qū)域后，與金標(biāo)抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物；溶液再繼續(xù)上行，到達(dá)檢測區(qū)后，如果測試液中含有HBsAg且含量足夠高，與包被在檢測區(qū)的抗-HBs發(fā)生特異性結(jié)合，則檢測線顯色；如果測試液中的HBsAg含量不足或不含有HBsAg，則檢測線不顯色；測試中，過剩的金標(biāo)抗體必須到達(dá)質(zhì)控線位置，并且質(zhì)控線處包被的二抗與抗體發(fā)生免疫作用，使質(zhì)控線呈現(xiàn)出紅色條帶，否則試驗(yàn)不成立，需要重新測定。三、檢測步驟:1、樣品前處理不同規(guī)格的重組乙型肝炎疫苗(酵母)按下述方法處理，即為待測樣品溶液。下述中的理論濃度即為按照藥品標(biāo)注的HBsAg含量及稀釋的倍數(shù)換算后得到的濃度。10 μ g/ml規(guī)格的疫苗取500 μ I,室溫下4000rpm離心5min,棄去上清460 μ I,加處理液40 μ 1，混勻，反應(yīng)15min，得到待測樣品溶液；處理液解離后的疫苗理論濃度為62.5 μ g/ml ；20 μ g/ml規(guī)格的疫苗取500 μ I,室溫下4000rpm離心5min,棄去上清460 μ I,加處理液40 μ 1，混勻，反應(yīng)15min，得到待測樣品溶液；處理液解離后的疫苗理論濃度為125 μ g/mlο其中，所述的處理液是由0.20ml的10%Triton X_100、L 25ml的20% 二乙醇胺和
8.55ml的6.2mmol/L的PBS混合配制而成，具體參見本發(fā)明上文。2、檢測過程:將試紙條有“MAX”標(biāo)志的一端插入待測樣品溶液中(深度不超過“MAX”標(biāo)志)，待測樣品溶液擴(kuò)展至試紙條頂端，30分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。3、檢測結(jié)果判定:下述檢測結(jié)果中，“陽性”指重組乙型肝炎疫苗中含有HBsAg的真品；“陰性”指假
冒偽劣產(chǎn)品。I)陽性結(jié)果:如果在質(zhì)控線和檢測線位置同時顯現(xiàn)出紅色線(圖2A)，則表明所測樣品溶液中含有HBsAg且含量足夠高，藥品為真品。2)陰性結(jié)果:如果只在質(zhì)控線位置顯現(xiàn)出紅色線(圖2B)，則表明所測樣品溶液中HBsAg含量不足或不含有HBsAg，藥品為假冒偽劣產(chǎn)品。3)結(jié)果不成立:如果在質(zhì)控線位置沒有顯現(xiàn)出紅色線(圖2C)，則無論檢測區(qū)是否顯現(xiàn)紅色線，均判斷為結(jié)果不成立，需要重新測定。實(shí)施例2、本發(fā)明檢測方法的準(zhǔn)確度檢測對28批市售的重組乙型肝炎疫苗(酵母)包括甲型乙型肝炎聯(lián)合疫苗(科興生物，含釀酒酵母型重組乙型肝炎疫苗，以下表中注明的規(guī)格是以該重組乙型肝炎疫苗量計)、重組乙型肝炎疫苗(天壇生物，釀酒酵母型；華蘭生物，漢遜酵母型)離心后的上清液以及處理液按照實(shí)施例1中所述方法進(jìn)行檢測(此方法每個樣品檢測耗時約0.35、.6小時)，對這些樣品還照《中國藥典》2010年版三部收載的方法進(jìn)行檢測(例如該藥典第133頁“3.3.1鑒別試驗(yàn)”中記載的酶聯(lián)免疫法檢測，此方法每個樣品檢測耗時約4.Γ4.8小時)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，兩種方法檢測結(jié)果一致，陽性檢出率100%。說明本發(fā)明方法適用于目前市售重組乙型肝炎疫苗(酵母)中HBsAg的檢測。

表1:本發(fā)明方法的耐用性檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.快速鑒別重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品質(zhì)量的方法，該方法包括以下步驟: (i)取待檢測的重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品，用處理液對該產(chǎn)品進(jìn)行解離，得到經(jīng)解離處理的重組乙型肝炎疫苗測試液； ( )將步驟(i)所得測試液加載到膠體金試紙條的加樣端，或者將膠體金試紙條的加樣端浸入到步驟(i)所得測試液中； (iii)測試液在毛細(xì)作用下沿膜向膠體金試紙條的另一端移動，觀察膠體金試紙條檢測區(qū)的質(zhì)控線和檢測線顯色情況； (iv)根據(jù)膠體金試紙條檢測區(qū)的質(zhì)控線和檢測線顯色情況，判斷所測重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的重組乙型肝炎疫苗選自:重組乙型肝炎疫苗(釀酒酵母)、重組乙型肝炎疫苗(漢遜酵母)、甲型乙型肝炎聯(lián)合疫苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的處理液是包含TritonX-100、二乙醇胺和PBS的水溶液；優(yōu)選地，其中所述的處理液中包含0.1-0.3%的Triton X-100,2-3%的二乙醇胺和 2-1OmmoI/L 的 PBS。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的處理液中包含:0.2%的TritonX-100、2.5%的二乙醇胺和5.3mmol/L的PBS，所述PBS是磷酸二氫鈉二水合物與磷酸氫二鈉十二水合物以重量比1:7.5的比例的組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于以下(I)至(3)任一項或多項的組合: (1)所述的重組乙型肝炎疫苗 產(chǎn)品中，乙型肝炎表面抗原含量可以為5-50μg/ml的范圍； (2)步驟⑴中所述的解離是在室溫下進(jìn)行的；和/或 (3)步驟(i)中所述的解離是照如下方式進(jìn)行的:取所述待檢測的重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品500 μ 1，離心并棄去上清460 μ 1，下層溶液中加處理液40 μ 1，混勻，使進(jìn)行反應(yīng)約10-30min,得到待測樣品溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于以下(I)至(6)任一項或多項的組合: (1)步驟(ii)中所述的膠體金試紙條由加樣墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊順次連接而成； (2)步驟(ii)中，所述膠體金試紙條的膠體金結(jié)合墊包被有膠體金-抗體； (3)步驟(ii)中，所述膠體金試紙條的硝酸纖維素膜包被有相互分離的、依次平行排列的檢測線和質(zhì)控線，所述依次平行排列的方向?yàn)樗黾訕訅|至所述吸樣墊的方向； (4)步驟(ii)中，所述硝酸纖維素膜上的所述檢測線為包被在硝酸纖維素膜上的抗-HBs ； (5)步驟(ii)中，所述硝酸纖維素膜上的所述質(zhì)控線為包被在硝酸纖維素膜上的羊抗鼠IgG ;和/或 (6)步驟(ii)中，所述膠體金試紙條由加樣墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊順次連接而成；所述膠體金結(jié)合墊包被有膠體金-抗體；所述硝酸纖維素膜包被有相互分離的、依次平行排列的檢測線和質(zhì)控線，所述依次平行排列的方向?yàn)樗黾訕訅|至所述吸樣墊的方向；所述檢測線為包被在硝酸纖維素膜上的抗-HBs ;所述質(zhì)控線為包被在硝酸纖維素膜上的羊抗鼠IgG。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于: 步驟(iii)中，使測試液在毛細(xì)作用下沿膜移至膠體金試紙條的吸水墊后，在30分鐘內(nèi)觀察膠體金試紙條檢測區(qū)的質(zhì)控線和檢測線顯色情況；和/或 步驟(iv)中，如果膠體金試紙條檢測區(qū)的質(zhì)控線和檢測線位置同時出現(xiàn)顯色條帶，則可斷定所測重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品為真品；如果膠體金試紙條檢測區(qū)僅質(zhì)控線位置出現(xiàn)顯色條帶，則可斷定所測重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品為偽劣產(chǎn)品。
8.一種用于快速鑒別重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品質(zhì)量的試劑盒，該試劑盒中包括:(a)處理液；(b)膠體金試紙條；和(C)操作方法說明書。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的試劑盒，其特征在于以下(I)至(12)任一項或多項的組合: (1)所述的重組乙型肝炎疫苗選自:重組乙型肝炎疫苗(釀酒酵母)、重組乙型肝炎疫苗(漢遜酵母)、甲型乙型肝炎聯(lián)合疫苗； (2)所述的處理液是溶解在一個瓶子中的包含TritonX-100、二乙醇胺和PBS的水溶液；(3)所述的處理液中包含0.1-0.3%的Triton X-100,2-3%的二乙醇胺和2_10mmol/L的 PBS ； (4)所述的處理液中包含0.2%的Triton X_100、2.5%的二乙醇胺和約5.3mmol/L的PBS，所述的PBS是磷酸二氫鈉二水合物與磷酸氫二鈉十二水合物以重量比1:7.5的比例的組合； (5)所述的處理液包括三個相互隔離的溶液，在臨用時將它們現(xiàn)混，所述三個溶液分別是:10%Triton X-100溶液、20% 二乙醇胺溶液和PBS溶液，其中所述PBS溶液是照如下方法配制的:取磷酸二氫鈉二水合物0.226g與磷酸氫二鈉十二水合物1.698g，加適量水溶解，加水稀釋至1000ml，即得； (6)所述的處理液是在臨用時將上述三個相互隔離的溶液現(xiàn)混配成，混合比例是:0.20ml 的 10%Triton Χ_100、1.25ml 的 20% 二乙醇胺和 8.55ml 的 PBS 溶液； (J)所述的膠體金試紙條由加樣墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊順次連接而成； (8)所述膠體金試紙條的膠體金結(jié)合墊包被有膠體金-抗體； (9)所述膠體金試紙條的硝酸纖維素膜包被有相互分離的、依次平行排列的檢測線和質(zhì)控線，所述依次平行排列的方向?yàn)樗黾訕訅|至所述吸樣墊的方向； (10)所述硝酸纖維素膜上的所述檢測線為包被在硝酸纖維素膜上的抗-HBs； (11)所述硝酸纖維素膜上的所述質(zhì)控線為包被在硝酸纖維素膜上的羊抗鼠IgG； (12)所述膠體金試紙條由加樣墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊順次連接而成；所述膠體金結(jié)合墊包被有膠體金-抗體；所述硝酸纖維素膜包被有相互分離的、依次平行排列的檢測線和質(zhì)控線，所述依次平行排列的方向?yàn)樗黾訕訅|至所述吸樣墊的方向；所述檢測線為包被在硝酸纖維素膜上的抗-HBs ;所述質(zhì)控線為包被在硝酸纖維素膜上的羊抗鼠IgG。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的試劑盒，其特征在于以下(I)至(6)任一項或多項的組合: (I)所述操作方法說明書記載了使用該試劑盒進(jìn)行快速鑒別重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品質(zhì)量的方法，該方法包括以下步驟:(1)取待檢測的重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品，用處理液對該產(chǎn)品進(jìn)行解離，得到經(jīng)解離處理的重組乙型肝炎疫苗測試液； (ii)將步驟(i)所得測試液加載到膠體金試紙條的加樣端，或者將膠體金試紙條的加樣端浸入到步驟(i)所得測試液中； (iii)測試液在毛細(xì)作用下沿膜向膠體金試紙條的另一端移動，觀察膠體金試紙條檢測區(qū)的質(zhì)控線和檢測線顯色情況； (iv)根據(jù)膠體金試紙條檢測區(qū)的質(zhì)控線和檢測線顯色情況，判斷所測重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量； (2)所述操作方法說明書中記載的重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品中，乙型肝炎表面抗原含量為 10 μ g/ml 或 20 μ g/ml ； (3)所述操作方法說明書中記載的解離是在室溫下進(jìn)行的； (4)所述操作方法說明書中記載的解離是照如下方式進(jìn)行的:取所述待檢測的重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品500 μ 1，離心并棄去上清460 μ 1，下層溶液中加處理液40 μ 1，混勻，使進(jìn)行反應(yīng)10-30min,得到待測樣品溶液； (5)所述操作方法說明書中記載的步驟(iii)中，使測試液在毛細(xì)作用下沿膜移至膠體金試紙條的吸水墊后，在30分鐘內(nèi)觀察膠體金試紙條檢測區(qū)的質(zhì)控線和檢測線顯色情況； (6)所述操作方法說明書中記載的步驟(iv)中，如果膠體金試紙條檢測區(qū)的質(zhì)控線和檢測線位置同時出現(xiàn)顯色條帶，則可斷定所測重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品為真品；如果膠體金試紙條檢測區(qū)僅質(zhì)控線位置出現(xiàn)顯色條帶，則可斷定所測重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品為偽劣產(chǎn)品O
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速鑒別重組乙型肝炎疫苗的方法。該方法可以快速鑒別重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品質(zhì)量的方法，包括以下步驟(i)對待檢測的重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品用處理液對該產(chǎn)品進(jìn)行解離；(ii)將步驟(i)所得測試液加載到膠體金試紙條的加樣端，或者將膠體金試紙條的加樣端浸入到步驟(i)所得測試液中；(iii)測試液在毛細(xì)作用下沿膜向膠體金試紙條的另一端移動，觀察膠體金試紙條檢測區(qū)的質(zhì)控線和檢測線顯色情況；(iv)根據(jù)膠體金試紙條檢測區(qū)的質(zhì)控線和檢測線顯色情況，判斷所測重組乙型肝炎疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量。本發(fā)明方法可以在相當(dāng)短的時間內(nèi)獲得結(jié)果。
文檔編號G01N33/558GK103175958SQ201310052048
公開日2013年6月26日 申請日期2013年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月17日
發(fā)明者王靜, 周長明, 呂雯, 白亦昊, 王志斌, 趙明, 郭洪祝 申請人:北京市藥品檢驗(yàn)所