專利名稱：神經(jīng)元特異性烯醇化酶含量檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人體內(nèi)酶含量的檢測試劑盒，尤其涉及人體內(nèi)神經(jīng)元特異性烯醇化酶含量的檢測試劑盒及其制備方法，屬于人體神經(jīng)元特異性烯醇化酶含量的檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
小細(xì)胞肺癌(Small Cell Lung Cancer，SCLC)約占肺癌的20%，惡性程度高，倍增時間短，轉(zhuǎn)移早而廣泛，對化療、放療敏感，初治緩解率高，但極易發(fā)生繼發(fā)性耐藥，容易復(fù)發(fā)，治療以全身化療為主。如果能在發(fā)病后早辨別高?；颊卟⒓皶r進(jìn)行治療，則小細(xì)胞肺癌的病死率及預(yù)后將會有明顯改善。因此，在SCLC的診斷及預(yù)后過程中，腫瘤標(biāo)志物具有重要的作用。

近年來,神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)作為SCLC的腫瘤標(biāo)志物，被廣泛的應(yīng)用于醫(yī)療診斷。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)是參與糖酵解途徑的烯醇化酶中的一種，存在于神經(jīng)組織和神經(jīng)內(nèi)分泌組織中。NSE在腦組織細(xì)胞的活性最高，外周神經(jīng)和神經(jīng)分泌組織的活性水平居中，最低值見于非神經(jīng)組織、血清和脊髓液。NSE存在4種二聚體同功酶(αα，αβ，αγ，ββ和γγ)形式,它們由三種不同的亞單位α，β，Y組成。小細(xì)胞肺癌患者的NSE水平明顯高于肺腺癌、肺鱗癌、大細(xì)胞肺癌等非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，可用于鑒別診斷。并且小細(xì)胞肺癌治療有效時NSE濃度逐漸降低至正常水平，復(fù)發(fā)時血清NSE升高，神經(jīng)元特異性烯醇化酶監(jiān)測小細(xì)胞肺癌的復(fù)發(fā)，比臨床確定復(fù)發(fā)要早4 12周。神經(jīng)元特異性烯醇化酶還可用于神經(jīng)母細(xì)胞瘤和腎母細(xì)胞瘤的鑒別診斷，前者神經(jīng)元特異性烯醇化酶異常增高而后者增高不明顯，對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的早期診斷亦有較高的臨床應(yīng)用價值，也可用來監(jiān)測神經(jīng)母細(xì)胞瘤的病情變化，評價療效和預(yù)報復(fù)發(fā)。還有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞腫瘤，如嗜鉻細(xì)胞瘤，胰島細(xì)胞瘤，甲狀腺髓樣癌，黑色素瘤，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等患者的血清NSE含量也會增高。研究還發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清中NSE含量的動態(tài)變化可以作為預(yù)測癌細(xì)胞是否有腦轉(zhuǎn)移趨勢的一個重要指標(biāo)。目前臨床上神經(jīng)元特異性烯醇化酶的測定方法主要有放免法、ELLSA法、化學(xué)發(fā)光法，其中酶聯(lián)免疫法自動化程度不高，且受人為操作因素影響很大；放射免疫法存在著放射物質(zhì)的污染問題；而化學(xué)發(fā)光法靈敏度雖高，但測定線性范圍較小且檢測成本較高，需要配套的化學(xué)發(fā)光檢測儀，這些原因?qū)е缕鋺?yīng)用范圍較小。迄今為止，臨床上缺乏一種操作簡單、靈敏度高、線性范圍寬的檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)含量的試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種操作簡單、靈敏度高、線性范圍寬的神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)含量檢測試劑盒。本發(fā)明的目的之二是提供一種所述神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)含量檢測試劑盒的制備方法。
本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:一種神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)含量檢測試劑盒，由彼此獨立的試劑I和試劑II組成，所述試劑I的組分包括:生物緩沖劑、防腐劑、無機鹽、促凝劑和水；所述試劑II的組分包括:包被神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒、生物緩沖劑、助懸劑、防腐劑和水。本發(fā)明通過大量的試驗發(fā)現(xiàn)，包被神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒的粒徑的大小對于檢測的靈敏性、準(zhǔn)確性及線性范圍等有著非常顯著的影響，本發(fā)明通過大量的試驗最終確定，當(dāng)包被神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒的粒徑為80-240nm時,相比于其它的粒徑的膠乳顆粒，其檢測的靈敏度及線性范圍等特性有非常顯著的改善。由此，本發(fā)明試劑盒中的包被神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒的粒徑優(yōu)選為80-240nm，采用此粒徑的膠乳顆粒制備的檢測試劑盒其靈敏度及線性范圍廣等特性明顯優(yōu)于其它粒徑的包被神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒。其中，當(dāng)包被神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒的粒徑為150nm時，檢測的靈敏度及線性范圍能達(dá)到最好的效果。制備包被神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆?？梢杂卸喾N制備方法，諸如化學(xué)交聯(lián)法、物理吸附法等；本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)，采用化學(xué)交聯(lián)法制備的致敏膠乳顆，神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體與膠乳顆粒結(jié)合緊密，不容易從膠乳顆粒上脫落，提高了抗體結(jié)合的穩(wěn)定性，可顯著提高檢測試劑盒的穩(wěn)定性。作為一種優(yōu)選的方案，本發(fā)明所述的包被神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒采用下述步驟進(jìn)行制備:(I)洗滌膠乳；(2)活化膠乳；(3)致敏膠乳；(4)封閉膠乳；(5)洗滌。其中，優(yōu)選的，所述的洗滌膠乳包括:將PBS緩沖液和表面活性劑依次加入到粒徑為80-240nm的膠乳溶液中混合均勻，離心棄上清，沉淀用PBS緩沖液復(fù)溶，超聲震蕩，使膠乳顆粒均勻分散；優(yōu)選的，所述的活化膠乳包括:將1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)用磷酸鹽緩沖溶液溶解后加入步驟(I)的膠乳溶液中，震蕩混合均勻，置于25°C恒溫?fù)u床反應(yīng)；優(yōu)選的，所述的致敏膠乳包括:向步驟(2)的反應(yīng)溶液中加入神經(jīng)元特異性烯醇化酶單克隆抗體和多克隆抗體，震蕩混合均勻，置于水平搖床上在室溫下進(jìn)行反應(yīng)；優(yōu)選的，所述封閉膠乳包括:向步驟(3)的反應(yīng)產(chǎn)物中加入甘氨酸溶液混合均勻，室溫下反應(yīng)后，再向反應(yīng)產(chǎn)物中加入BSA溶液，混合均勻，于室溫下反應(yīng)；優(yōu)選的，步驟(5)中所述的洗滌包括:將步驟(4)的反應(yīng)產(chǎn)物離心棄上清，用超純水洗滌沉淀兩次，再用PBS緩沖液復(fù)溶，即得。本發(fā)明采用神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的單克隆抗體和神經(jīng)元特異性烯醇化酶多克隆抗體采用化學(xué)交聯(lián)法復(fù)合包被膠乳顆粒，能夠有效提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。試劑I的pH值的范圍優(yōu)選為7.0-8.0，試劑II的pH值的范圍優(yōu)選為6.5-7.5。為了達(dá)到更好的檢測效果，本發(fā)明每I升試劑I中各組分的用量為:生物緩沖劑l-100g，促凝劑l_60g，防腐劑0.02-10g，無機鹽l_80g，余量為水；本發(fā)明的試劑II中包被神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)單克隆抗體或多克隆抗體的膠乳顆粒，可特異性識別并結(jié)合血清或尿液中的NSE抗原，每I升試劑II中各組分的含量為:包被神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒0.05-10g,生物緩沖劑l_80g，助懸劑l-80mL,防腐劑0.02-10g,余量為水。進(jìn)一步優(yōu)選的，每I升試劑I中各組分的用量為:生物緩沖劑7_20g，促凝劑3-20g,防腐劑0.l-5g，無機鹽2-15g，余量為水；每I升試劑II中各組分的用量為:包被神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒
0.5-5g，生物緩沖劑5-30g，助懸劑5-50mL，防腐劑0.l_6g，余量為水。最優(yōu)選為:每I升試劑I中各組分的用量為:生物緩沖劑12.lg，促凝劑Sg，防腐劑lg，無機鹽10g，余量為水；每I升試劑II中各組分的用量為:包被神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒
1.5g，生物緩沖劑10.5g，助懸劑20mL，防腐劑lg，余量為水。本發(fā)明所述的生物緩沖劑是能夠用于維持一定PH值的各種生物緩沖劑，例如三羥甲基氨基甲烷(Tris)、三羥甲基甲胺基乙磺酸(TES)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、N-(2-羥乙基)哌嗪-N’ -2-乙烷磺酸(HEPES)、三羥甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)、哌嗪-1，4- 二羥基丙磺酸(P0PS0)、3- (N-嗎啉)丙磺酸(MOPS)中的一種或是幾種；為了達(dá)到更好的檢測效果，本發(fā)明試劑I所述的生物緩沖劑優(yōu)選為三羥甲基氨基甲烷，本發(fā)明試劑II所述的生物緩沖劑優(yōu)選為3- (N-嗎啉)丙磺酸。本發(fā)明試劑I所述的促凝劑可以促進(jìn)抗原抗體反應(yīng)，有利于膠乳顆粒交聯(lián)物的形成和增大，提高檢測靈敏度和線性范圍，諸如PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、PEG-10000,PEG-20000中的一種或幾種復(fù)配均可作為本發(fā)明試劑盒中的促凝劑，優(yōu)選為PEG-6000。本發(fā)明所述試劑I和試劑II中的防腐劑主要是為了防止細(xì)菌滋生導(dǎo)致的產(chǎn)品變質(zhì)，所以任何一種能起到防止細(xì)菌滋生作用的防腐劑均能適用于本發(fā)明，如:苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸、山梨酸鉀、疊氮鈉及其鹽等中的一種或幾種等；本發(fā)明優(yōu)選疊氮鈉作為試劑I或試劑II中的防腐劑。本發(fā)明試劑I所述無機鹽是為了維持反應(yīng)體系的穩(wěn)定性并能控制膠乳顆粒的反應(yīng)度，如:氯化鈉、氯化鉀或氯化鎂等中的一種或幾種復(fù)配，優(yōu)選為氯化鈉。本發(fā)明所述試劑II中的助懸劑可以幫助膠乳顆粒維持一個很好的分散狀態(tài)，防止膠乳顆粒下沉影響檢測試劑盒的品質(zhì)及開瓶穩(wěn)定性，常用的助懸劑為乙二醇、丙三醇、乳糖和麥芽糖等一種或幾種復(fù)配，本發(fā)明優(yōu)選乙二醇作為助懸劑。本發(fā)明的目的之二是提供一種制備所述檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)試劑盒的方法，包括:(I)制備試劑1:將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，定容，得到試劑I ;(2)制備試劑I1:制備神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體包被的膠乳顆粒溶液；將其余各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中得到混合溶液；將膠乳顆粒溶液與混合溶液混合均勻，定容，得到試劑II ; (3)將試劑I和試劑II單獨分裝，密封，即得。本發(fā)明的目的之三是提供所述神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)檢測試劑盒檢測樣品中NSE含量的檢測方法(該方法為兩點終點法)，包括以下步驟:向2.5 μ L待檢測樣本(校準(zhǔn)管以校準(zhǔn)品做樣品，空白以蒸餾水為樣品，購自英國Randox公司)中加入120 μ L的試劑I充分混勻，于37°C恒溫5分鐘，再向混合體系中加入30 μ L試劑II，混勻，37°C恒溫5分鐘后，空白管調(diào)零，波長570nm，測定各管吸光度Al，4分鐘后測定各管吸光度A2，計算ΛΑ = Α2-Α1。根據(jù)多點校準(zhǔn)品濃度和對應(yīng)吸光度變化值ΛΑ，采用多點非線性校準(zhǔn)模式確定工作曲線，樣本吸光度變化在工作曲線上相對應(yīng)的濃度值即為測定濃度。本發(fā)明檢測試劑盒采用粒徑為80_240nm的膠乳顆粒制備包被神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)抗體的膠乳顆粒，能有效保證試劑盒的高靈敏度及較寬的檢測線性范圍，同時本發(fā)明檢測試劑盒抗體包被膠乳顆粒的工藝采用化學(xué)法保證了檢測試劑盒具有良好的開瓶穩(wěn)定性好，包被膠乳顆粒的NSE抗體能特異性的識別樣本中的抗原，保證試劑盒具有良好的特異性。


圖1本發(fā)明檢測試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。圖2本發(fā)明檢測試劑盒以及對照檢測試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。圖3本發(fā)明檢測試劑盒37 °C熱穩(wěn)定性試驗結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更加清楚。但這些實施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。預(yù)備實施例1(I)洗漆膠乳:取ImL濃度為10%粒徑為80nm的膠乳溶液(購自PolyMicrospheres公司)于50mL離心管中，再向離心管中加入9mL pH7.0的PBS緩沖液，震蕩混合均勻，后再向離心管中加入4 μ L吐溫-20，震蕩混合均勻，將離心管置于離心機中于25000轉(zhuǎn)/min，離心30min，棄上清，并用9mL pH7.0的PBS緩沖液復(fù)溶，超聲震蕩60秒，使膠乳顆粒均勻分散。(2)活化膠乳:準(zhǔn)確稱取50mgl_乙基_3_ (3_ 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)和50mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)并用ImL0.12M磷酸鹽緩沖溶液溶解，并將此溶液加A(I)步膠乳溶液中，震蕩混合均勻，并置于25°C恒溫?fù)u床上，200轉(zhuǎn)/min，反應(yīng)Ih ；(3)致敏膠乳:向(2)步反應(yīng)完成的溶液中加入lmLlmg/mL神經(jīng)元特異性烯醇化酶單克隆抗體和lmLlmg/mL神經(jīng)元特異性烯醇化酶多克隆抗體(武漢華美生物工程有限公司有售)，震蕩混合均勻，置于水平搖床上，室溫，200轉(zhuǎn)/min，反應(yīng)IOh ；(4)封閉膠乳:步驟(3)反應(yīng)完成后，向反應(yīng)體系中加入200 μ L5%濃度的甘氨酸溶液，混合均勻，并于室溫下靜置反應(yīng)45min，再向反應(yīng)體系中加入100 μ L5%濃度的BSA溶液，混合均勻，并于室溫下靜置反應(yīng)20min ；(5)洗漆:將(4)步反應(yīng)完成的體系于15000轉(zhuǎn)/min,離心30min,棄上清,并用超純水洗滌沉淀兩次，即得包被神經(jīng)元特異性烯醇化酶白抗體的膠乳顆粒，用IOmL pH7.0的PBS緩沖液復(fù)溶，得包被抗體的膠乳顆粒溶液。預(yù)備實施例2(I)洗滌膠乳:取ImL濃度為10%粒徑為240nm的膠乳溶液(購自PolyMicrospheres公司)于5OmL離心管中，再向離心管中加入9mL pH7.0的PBS緩沖液，震蕩混合均勻，后再向離心管中加入4μ L吐溫-20，震蕩混合均勻，將離心管置于離心機中于25000轉(zhuǎn)/min，離心30min，棄上清，并用9mL pH7.0的PBS緩沖液復(fù)溶，超聲震蕩60秒，使膠乳顆粒均勻分散。(2)活化膠乳:準(zhǔn)確稱取50mgl_乙基_3_ (3_ 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)和50mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)并用ImL0.12M磷酸鹽緩沖溶液溶解，并將此溶液加A(I)步膠乳溶液中，震蕩混合均勻，并置于25°C恒溫?fù)u床上，200轉(zhuǎn)/min，反應(yīng)Ih ；(3)致敏膠乳:向(2)步反應(yīng)完成的溶液中加入lmLlmg/mL神經(jīng)元特異性烯醇化酶單克隆抗體和lmLlmg/mL多克隆抗體(武漢華美生物工程有限公司)，震蕩混合均勻，置于水平搖床上，室溫，200轉(zhuǎn)/mi η,反應(yīng)IOh ；(4)封閉膠乳:步驟(3)反應(yīng)完成后，向反應(yīng)體系中加入200 μ L5%濃度的甘氨酸溶液，混合均勻，并于室溫下靜置反應(yīng)45min，再向反應(yīng)體系中加入100 μ L5%濃度的BSA溶液，混合均勻，并于室溫下靜置反應(yīng)20min ；(5)洗漆:將(4)步反應(yīng)完成的體系于15000轉(zhuǎn)/min,離心30min,棄上清,并用超純水洗滌沉淀兩次，即得包被神經(jīng)元特異性烯醇化酶白抗體的膠乳顆粒，用IOmL pH7.0的PBS緩沖液復(fù)溶，得包被抗體的膠乳顆粒溶液。預(yù)備實施例3(I)洗滌膠乳:取ImL濃度為10%粒徑為150nm的膠乳溶液(購自PolyMicrospheres公司)于50mL離心管中，再向離心管中加入9mL pH7.0的PBS緩沖液,震蕩混合均勻，后再向離心管中加入4yL吐溫-20，震蕩混合均勻，將離心管置于離心機中于25000轉(zhuǎn)/min，離心30min，棄上清，并用9mL pH7.0的PBS緩沖液復(fù)溶，超聲震蕩60秒，使膠乳顆粒均勻分散。(2)活化膠乳:準(zhǔn)確稱取50mgl_乙基_3_ (3_ 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)和50mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)并用ImL0.12M磷酸鹽緩沖溶液溶解，并將此溶液加A(I)步膠乳溶液中，震蕩混合均勻，并置于25°C恒溫?fù)u床上，200轉(zhuǎn)/min，反應(yīng)Ih ；(3)致敏膠乳:向(2)步反應(yīng)完成的溶液中加入lmLlmg/mL神經(jīng)元特異性烯醇化酶單克隆抗體和lmLlmg/mL多克隆抗體(武漢華美生物工程有限公司有售)，震蕩混合均勻，置于水平搖床上，室溫，200轉(zhuǎn)/min，反應(yīng)IOh ；(4)封閉膠乳:步驟(3)反應(yīng)完成后，向反應(yīng)體系中加入200 μ L5%濃度的甘氨酸溶液，混合均勻，并于室溫下靜置反應(yīng)45min，再向反應(yīng)體系中加入100 μ L5%濃度的BSA溶液，混合均勻，并于室溫下靜置反應(yīng)20min ；(5)洗漆:將(4)步反應(yīng)完成的體系于15000轉(zhuǎn)/min,離心30min,棄上清,并用超純水洗滌沉淀兩次，即得包被神經(jīng)元特異性烯醇化酶白抗體的膠乳顆粒，用IOmL pH7.0的PBS緩沖液復(fù)溶，得包被抗體的膠乳顆粒溶液。預(yù)備實施例4(I)洗滌膠乳:取ImL濃度為10%粒徑為200nm的膠乳溶液(購自PolyMicrospheres公司)于5OmL離心管中，再向離心管中加入9mL pH7.0的PBS緩沖液，震蕩混合均勻，后再向離心管中加入4μ L吐溫-20，震蕩混合均勻，將離心管置于離心機中于25000轉(zhuǎn)/min，離心30min，棄上清，并用9mL pH7.0的PBS緩沖液復(fù)溶，超聲震蕩60秒，使膠乳顆粒均勻分散。
(2)活化膠乳:準(zhǔn)確稱取50mgl_乙基_3_ (3_ 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)和50mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)并用ImL0.12M磷酸鹽緩沖溶液溶解，并將此溶液加A(I)步膠乳溶液中，震蕩混合均勻，并置于25°C恒溫?fù)u床上，200轉(zhuǎn)/min，反應(yīng)Ih ；(3)致敏膠乳:向(2)步反應(yīng)完成的溶液中加入lmLlmg/mL神經(jīng)元特異性烯醇化酶單克隆抗體和lmLlmg/mL多克隆抗體(武漢華美生物工程有限公司有售)，震蕩混合均勻，置于水平搖床上，室溫，200轉(zhuǎn)/min，反應(yīng)IOh ；(4)封閉膠乳:步驟(3)反應(yīng)完成后，向反應(yīng)體系中加入200 μ L5%濃度的甘氨酸溶液，混合均勻，并于室溫下靜置反應(yīng)45min，再向反應(yīng)體系中加入100 μ L5%濃度的BSA溶液，混合均勻，并于室溫下靜置反應(yīng)20min ；(5)洗漆:將(4)步反應(yīng)完成的體系于15000轉(zhuǎn)/min,離心30min,棄上清,并用超純水洗滌沉淀兩次，既得包被神經(jīng)元特異性烯醇化酶白抗體的膠乳顆粒，用IOmL pH7.0的PBS緩沖液復(fù)溶，得包被抗體的膠乳顆粒溶液。實施例1檢測試劑盒的制備1、試劑I的制備:按所述用量取各組分:
三羥甲基氨基甲烷(Tris)12.1g
WTr6000Sg
疊氮鈉0.25mL
氣化鈉9g將上述各組分溶解于900mL蒸餾水或雙蒸水中，用2mol/L鹽酸和2mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.5，后用蒸餾水定容至I升，密封4°C保存，備用。2、試劑II的制備: 按所述用量取各組分:3-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS)10.5g疊氮鈉IOg乙二醇20mL將上述各組分溶解于700mL蒸餾水或雙蒸水中，后加入15份預(yù)備實施例3制備的包被NSE抗體的膠乳顆粒溶液，用2mol/L鹽酸和2mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0，后用蒸餾水定容至I升，密封4°C保存，備用。實施例2檢測試劑盒的制備1、試劑I的制備:按所述用量取各組分:-:羥屮+搞鉍坫屮烷(Tris)12.1g
re(;-6()()0Sg
鈴 M鈉0.25mL
^化納9g將上述各組分溶解于900mL蒸餾水或雙蒸水中，用2mol/L鹽酸和2mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.5，后用蒸餾水定容至I升，密封4°C保存，備用。2、試劑II的制備:按所述用量取各組分:3-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS)10.5g疊氮鈉IOg乙二醇20mL將上述各組分溶解于700mL蒸餾水或雙蒸水中，后加入15份預(yù)備實施例1制備的包被NSE抗體的膠乳顆粒溶液，用2mol/L鹽酸和2mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0，后用蒸餾水定容至I升，密封4°C保存，備用。實施例31、試劑I的制備:按所述用量取各組分:
■ 羥屮坫鉍坫中烷(Tris)17g
PEG-6WM)12g
MM0.4ral.蒙〔化鈉9g將上述各組分溶解于900mL蒸餾水或雙蒸水中，用2mol/L鹽酸和2mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.3，后用蒸餾水定容至I升，密封4°C保存，備用。2、試劑II的制備:按所述用量取各組分:3-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS)20g防腐劑0.2mL乙二醇25mL將上述各組分溶解于800mL蒸餾水或雙蒸水中，后加入10份預(yù)備實施例2制備的包被NSE抗體的膠乳顆粒溶液，用 2mol/L鹽酸和2mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.2，后用蒸餾水定容至I升，密封4°C保存，備用。實施例41、試劑I的制備:按所述用量取各組分:
權(quán)利要求
1.神經(jīng)元特異性烯醇化酶含量的檢測試劑盒，其特征在于:該檢測試劑盒由彼此獨立的試劑I和試劑II組成；其中，試劑I的組分包括:生物緩沖劑、防腐劑、促凝劑、無機鹽和水；試劑II的組分包括:包被神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒、生物緩沖劑、防腐齊U、助懸劑和水。
2.按照權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于:所述包被神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒的粒徑是80-240nm,優(yōu)選為150nm。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的檢測試劑盒，其特征在于:所述包被神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒由神經(jīng)元特異性烯醇化酶單克隆抗體和神經(jīng)元特異性烯醇化酶多克隆抗體復(fù)合包被粒徑是80-240nm的膠乳顆粒制備而成。
4.按照權(quán)利要求1-3任何一項所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的包被神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒采用下述步驟制備得到:(I)洗滌膠乳；(2)活化膠乳；(3)致敏膠乳；(4)封閉膠乳；(5)洗滌。
5.按照權(quán)利要求4所述的檢測試劑盒，其特征在于:所述的洗滌膠乳包括:將磷酸鹽緩沖液和表面活性劑依次加入到粒徑為80-240nm的膠乳溶液中混合均勻，離心棄上清，沉淀用磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，超聲震蕩，使膠乳顆粒均勻分散； 所述的活化膠乳包括:將1-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺用磷酸鹽緩沖溶液溶解后加入步驟(I)的膠乳溶液中，震蕩混合均勻，置于恒溫?fù)u床進(jìn)行反應(yīng)； 所述的致敏膠乳包括:向步驟(2)的反應(yīng)溶液中加入神經(jīng)元特異性烯醇化酶單克隆抗體和神經(jīng)元特異性烯醇化酶多克隆抗體，震蕩混合均勻，置于水平搖床上在室溫下進(jìn)行反應(yīng)； 所述封閉膠乳包括:向步驟(3)的反應(yīng)產(chǎn)物中加入甘氨酸溶液混合均勻，室溫下反應(yīng)后，再向反應(yīng)產(chǎn)物中加入 BSA溶液，混合均勻于室溫下反應(yīng)； 步驟(5)中所述的洗滌包括:將步驟(4)的反應(yīng)產(chǎn)物離心棄上清，用超純水洗滌沉淀兩次，再用磷酸鹽緩沖液復(fù)溶。
6.按照權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于:每I升試劑I中各組分的用量為:生物緩沖劑Ι-lOOg，促凝劑l-60g，防腐劑0.02-10mL，無機鹽l_40g，余量為水；每I升試劑II中各組分的用量為:包被神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒0.05-10g，生物緩沖劑l-80g，助懸劑l-80mL，防腐劑0.02_10g，余量為水。
7.按照權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于:每I升試劑I中各組分的用量為:生物緩沖劑7-20g，促凝劑3-20g,防腐劑0.l_5g，無機鹽2_15g ;優(yōu)選為:生物緩沖劑12.lg，促凝劑8g,防腐劑Ig,無機鹽IOg ； 每I升試劑II中各組分的用量為:包被神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒0.05-5g，生物緩沖劑5-30g，助懸劑5-50mL，防腐劑0.l_6g ;優(yōu)選為:包被神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒1.5g，生物緩沖劑10.5g，助懸劑20mL，防腐劑lg。
8.按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的促凝劑為PEG-6000;所述的助懸劑為乙二醇；所述的無機鹽為氯化鈉； 試劑I中所述的生物緩沖劑為三羥甲基氨基甲烷；試劑II中所述生物緩沖劑為3- (N-嗎啉)丙磺酸。
9.按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:試劑I的pH值的范圍為7.0-8.0，試劑II的PH值的范圍為6.5-7.5。
10.一種制備權(quán)利要求1所述檢測試劑盒的方法，包括:(1)制備試劑1:將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，定容得到試劑I ;(2)制備試劑I1:首先制備神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體包被的膠乳顆粒溶液；將其余各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中得到混合溶液；將神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體包被的膠乳溶液與混合溶液混合均勻，定容，得到試劑II ；(3)將試劑I和試劑II單獨分裝， 密封，即得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種神經(jīng)元特異性烯醇化酶含量檢測試劑盒及其制備方法，屬于人體神經(jīng)元特異性烯醇化酶含量檢測領(lǐng)域。所述檢測試劑盒由彼此獨立的試劑Ⅰ和試劑Ⅱ組成，其中，試劑Ⅰ的組分包括生物緩沖劑、防腐劑、促凝劑、無機鹽和水；試劑Ⅱ的組分包括包被神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒、生物緩沖劑、防腐劑、助懸劑和水。本發(fā)明用神經(jīng)元特異性烯醇化酶單克隆體和多克隆抗體復(fù)合包被粒徑為80-240nm的膠乳顆粒，保證檢測試劑盒具有高靈敏度及較寬的檢測線性范圍，具有操作簡便、快速、特異性強、穩(wěn)定性好，靈敏度高等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/573GK103175964SQ20131005514
公開日2013年6月26日 申請日期2013年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月21日
發(fā)明者華權(quán)高, 沈鶴霄, 許可, 閆彩霞, 黃愛, 伍衛(wèi)姣, 舒芹, 鄢寶, 趙暢 申請人:武漢華美生物工程有限公司