專利名稱：快速檢測(cè)生物細(xì)胞死活狀態(tài)的熒光染色試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞計(jì)數(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種快速檢測(cè)生物細(xì)胞死活狀態(tài)的熒光染色試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前測(cè)定活細(xì)胞數(shù)的方法有光學(xué)顯微鏡讀數(shù)計(jì)數(shù)法、平板涂布培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)法、光電比濁法、最大或然數(shù)法，以及膜過(guò)濾法等。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法:將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱計(jì)菌器)，于顯微鏡下直接觀察計(jì)數(shù)。該方法簡(jiǎn)便、快速、直觀，可以用于酵母、細(xì)菌、霉菌孢子和動(dòng)物細(xì)胞等懸液的計(jì)數(shù)。缺點(diǎn)為不能準(zhǔn)確識(shí)別細(xì)胞的死活狀態(tài)，所測(cè)得的結(jié)果通常是死細(xì)胞和活細(xì)胞的總和。平板菌落計(jì)數(shù)法:將待測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋，使其中的微生物菌落或動(dòng)物細(xì)胞充分分散成單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)，取一定量的稀釋樣液接種到平板培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可見的菌落或細(xì)胞群落，即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞。這種方法廣泛適用于生物制品檢驗(yàn)(如活菌制劑)，以及食品、飲料和水(包括水源)等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測(cè)。缺點(diǎn)是，由于待測(cè)樣品往往不易完全分散成單個(gè)細(xì)胞，所以經(jīng)培養(yǎng)后形成的單菌落可能來(lái)自樣品中的2-3個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞，或者由于菌體的生長(zhǎng)周期不同，在同一種培養(yǎng)基中由于適應(yīng)性的差異，有的菌體需要3天即可長(zhǎng)出菌落，有的菌體需要I個(gè)星期甚至更長(zhǎng)的時(shí)間，因此平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果往往偏低，通常使用菌落形成單位(colony-formingunits, cfu)而不以絕對(duì)菌落數(shù)來(lái)表示樣品的活菌含量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種快速檢測(cè)生物細(xì)胞死活狀態(tài)的熒光染色試劑盒及其應(yīng)用，該試劑盒可以快速實(shí)時(shí)地觀察或者檢測(cè)樣品中各種細(xì)胞的活細(xì)胞與死細(xì)胞的數(shù)量，直觀簡(jiǎn)便，排除了其它物質(zhì)的干擾和培養(yǎng)周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)，不僅適用于動(dòng)物細(xì)胞，并且還適用于大部分的革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。本發(fā)明的一種快速檢測(cè)生物細(xì)胞死活狀態(tài)的熒光染色試劑盒，所述試劑盒包括花青素染料和碘化丙啶染料，花青素染料的儲(chǔ)存濃度為5-6mM，碘化丙啶染料的儲(chǔ)存濃度為100 μ g/mL。所述花青素染料所使用的稀釋緩沖液為IXTE buffer [含ImM EDTA(乙二胺四乙酸)的IOmM Tris-HCl (三羥甲基氨基甲烷-HCl)緩沖液，pH8.0]。這種染料能滲透到所有狀態(tài)下的細(xì)胞，它傾向于結(jié)合細(xì)胞內(nèi)雙鏈DNA，對(duì)于單鏈DNA和RNA的結(jié)合較少，對(duì)細(xì)胞的核酸進(jìn)行染色，使細(xì)胞發(fā)出綠色熒光。所述花青素染料使用時(shí)稀釋1000-10000倍。所述花青素染料溶劑為二甲基亞砜，使用時(shí)的工作最終濃度(工作濃度指的是與細(xì)胞染色時(shí)的實(shí)際濃度)為5-6 μ M0
花青素染料，其結(jié)構(gòu)式為:
權(quán)利要求
1.一種快速檢測(cè)生物細(xì)胞死活狀態(tài)的熒光染色試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包括花青素染料和碘化丙啶染料，花青素染料的儲(chǔ)存濃度為5-6mM，碘化丙啶染料的儲(chǔ)存濃度為100 μ g/mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)生物細(xì)胞死活狀態(tài)的熒光染色試劑盒，其特征在于:所述花青素染料所使用的稀釋緩沖液為IXTE buffer，碘化丙啶染料所使用的稀釋劑是超純水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)生物細(xì)胞死活狀態(tài)的熒光染色試劑盒，其特征在于:所述花青素染料使用時(shí)稀釋1000-10000倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)生物細(xì)胞死活狀態(tài)的熒光染色試劑盒，其特征在于:所述花青素染料使用時(shí)的工作最終濃度為5-6 μ M。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)生物細(xì)胞死活狀態(tài)的熒光染色試劑盒，其特征在于:所述花青素染料的溶劑為二甲基亞砜，碘化丙啶染料的溶劑為超純水。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)生物細(xì)胞死活狀態(tài)的熒光染色試劑盒，其特征在于:所述碘化丙啶染料的工作最終濃度為10-20 μ g/mL。
7.—種如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)生物細(xì)胞死活狀態(tài)的熒光染色試劑盒的應(yīng)用，其特征在于:檢測(cè)步驟如下:在生物樣品液中加入試劑盒中的花青素染料和碘化丙啶，利用熒光顯微鏡觀察計(jì)數(shù)或者利用微孔熒光讀板器在發(fā)射光波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)不同顏色熒光值的強(qiáng)弱反映生物樣品中細(xì)胞的存活狀態(tài)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種快速檢測(cè)生物細(xì)胞死活狀態(tài)的熒光染色試劑盒的應(yīng)用，其特征在于:所述利用熒光顯微鏡觀察計(jì)數(shù)的具體步驟包括: (O吸取細(xì)胞懸液于包有錫箔紙的離心管中； (2)加入體積比為1-2:1的花青素染料和碘化丙啶的混合染料，細(xì)胞懸液與混合染料的體積比為7:3，上下?lián)u動(dòng)，置于黑暗中10-30分鐘；或者加入與細(xì)胞懸液體積比為4:1的花青素染料，上下?lián)u動(dòng)，置于黑暗中10-30分鐘，測(cè)活體；或者加入與細(xì)胞懸液體積比為9:1的PI染料，上下?lián)u動(dòng)，置于黑暗中10-30分鐘，測(cè)死體； (3)將染過(guò)色的生物樣品液通過(guò)0.2 μ m的黑色過(guò)濾膜過(guò)濾，使細(xì)胞截留在黑色過(guò)濾膜上，將過(guò)濾膜轉(zhuǎn)移到載玻片上，在膜中央滴一滴無(wú)熒光精油，蓋上蓋玻片； (4)將玻片置于突光顯微鏡下,在蓋玻片中央滴一滴無(wú)突光鏡油，用100倍的油鏡觀察，分別在花青素染料和PI染料的最適激發(fā)光下進(jìn)行檢測(cè)，目鏡中呈綠色的細(xì)胞是活體，呈紅色的細(xì)胞是死體。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種快速檢測(cè)生物細(xì)胞死活狀態(tài)的熒光染色試劑盒的應(yīng)用，其特征在于:所述利用微孔熒光讀板器在發(fā)射光波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)的具體步驟包括: (1)將含有細(xì)胞的培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)0.2 μ m的過(guò)濾膜過(guò)濾，將收集的細(xì)胞用生理鹽水重懸； (2)在微孔板中加入細(xì)胞懸液，在微孔中加入體積比為1-2:1的花青素染料和碘化丙啶的混合染料，細(xì)胞懸液與混合染料的體積比為7:3，上下?lián)u動(dòng)，置于黑暗中10-30分鐘；或者加入與細(xì)胞懸液體積比為4:1的花青素染料，上下?lián)u動(dòng)，置于黑暗中10-30分鐘，測(cè)活體；或者加入與細(xì)胞懸液體積比為9:1的PI染料，上下?lián)u動(dòng)，置于黑暗中10-30分鐘，測(cè)死體；微孔內(nèi)總體積不超過(guò)300 μ L，染色10-30分鐘，在激發(fā)光為460nm-500nm，發(fā)射光為500nm-530nm的條件下檢測(cè)其熒光強(qiáng)度值， 熒光的強(qiáng)弱反映了此細(xì)胞懸液中活體的數(shù)量，在激發(fā)光為460nm-530nm，發(fā)射光為600nm_640nm的條件下檢測(cè)其熒光強(qiáng)度值，熒光的強(qiáng)弱反映了此細(xì)胞懸液中死體的數(shù) 量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)生物細(xì)胞死活狀態(tài)的熒光染色試劑盒及其應(yīng)用，試劑盒包括花青素染料和碘化丙啶染料。檢測(cè)步驟如下在細(xì)胞懸液中加入試劑盒中的花青素染料和碘化丙啶，利用熒光顯微鏡觀察計(jì)數(shù)或者利用微孔熒光讀板器在發(fā)射光波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)不同顏色熒光值的強(qiáng)弱反映生物樣品液中細(xì)胞的存活狀態(tài)。本發(fā)明可以快速實(shí)時(shí)地觀察或者檢測(cè)樣品中各種細(xì)胞的活細(xì)胞與死細(xì)胞的數(shù)量，直觀簡(jiǎn)便，排除了其它物質(zhì)的干擾和培養(yǎng)周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)，不僅適用于動(dòng)物細(xì)胞，并且還適用于大部分的革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。
文檔編號(hào)G01N15/10GK103175768SQ201310060140
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月26日
發(fā)明者洪楓, 張碩, 杜倩雯, 蘭水, 陳琳, 李登新 申請(qǐng)人:東華大學(xué)