專利名稱：一種基于嗅覺受體傳感器檢測氣味物質(zhì)丁二酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測技術(shù)，尤其涉及一種基于嗅覺受體傳感器檢測氣味物質(zhì)丁二酮的方法。
背景技術(shù)：
生物嗅覺系統(tǒng)能夠快速、靈敏地感受并分辨出空氣中的氣味物質(zhì)，這得益于嗅覺受體能夠與空氣中氣味分子特異性地結(jié)合。傳統(tǒng)氣體傳感器設(shè)計(jì)中，敏感材料多采用導(dǎo)電聚合物、高分子材料等，缺點(diǎn)是特異性差。氣味分子種類繁多，多是結(jié)構(gòu)各異的小分子量揮發(fā)性有機(jī)氣體，尤其當(dāng)檢測環(huán)境中的空氣中含有多種氣味時(shí)，特異性地檢測某種氣味變得相對困難。新興的生物傳感器擬從仿生的角度解決這一問題，模仿生物嗅覺系統(tǒng)利用嗅覺受體對氣味分子的特異性識別，為特異性檢測氣體提供了新的技術(shù)途徑。因此，如何獲得高度特異的氣體敏感材料，并將其與二級傳感器的有效穩(wěn)定耦合，實(shí)現(xiàn)氣味分子的特異性檢測是目前氣體傳感器進(jìn)一步發(fā)展亟需解決的難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用嗅覺受體蛋白作為敏感材料結(jié)合石英晶體微天平構(gòu)建嗅覺受體傳感器進(jìn)行氣體特異性檢測的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:一種基于嗅覺受體傳感器檢測氣味物質(zhì)丁二酮的方法，該方法包括以下步驟:
(1)制備嗅覺受體蛋白0DR-10；
(2)固定嗅覺受體蛋白0DR-10在石英晶體微天平表面構(gòu)建嗅覺受體傳感器；
(3)將潔凈空氣以lmL/s的流速泵入檢測腔內(nèi)，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)后，再將濃度確定的含有氣味物質(zhì)丁二酮的待測氣體泵入檢測腔，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率再次穩(wěn)定后，諧振頻率的改變量即為嗅覺受體傳感器對此濃度下的氣體物質(zhì)丁二酮的響應(yīng)值；最后再將潔凈空氣泵入檢測腔內(nèi)，清洗檢測腔，即完成一次檢測過程；至少間隔IOmin后，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率穩(wěn)定后可泵入另一濃度待測氣體到檢測腔進(jìn)行下一次檢測；重復(fù)上述步驟，得到一系列濃度的氣體物質(zhì)丁二酮引起的傳感器諧振頻率改變量，得到丁二酮濃度-諧振頻率改變量曲線；
(4)對于未知濃度的氣體物質(zhì)丁二酮的檢測，首先將潔凈空氣以lmL/s的流速泵入檢測腔內(nèi)，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)Ftl后，再將濃度未知的待測氣體泵入檢測腔，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率再次穩(wěn)定到F1后，得到諧振頻率改變量F1- Ftl，根據(jù)上述步驟得到的丁二酮濃度-諧振頻率改變量曲線推算出待測氣體物質(zhì)丁二酮的濃度，實(shí)現(xiàn)對丁二酮的濃度測定。進(jìn)一步地，所述步驟(I)包括以下子步驟:
(1.1)構(gòu)建表達(dá)載體:首先采用基因工程技術(shù)對含有嗅覺受體蛋白0DR-10基因和rho-tag信號妝序列全長cDNA飽攝MtPEGFP-Nl/rho-tag/odr-10 (其基因序列如SEQ IDN0.1所示)進(jìn)行適當(dāng)改造，構(gòu)建適用于嗅覺受體傳感器使用的嗅覺受體蛋白的表達(dá)載體，使其N末端帶有融合表達(dá)的His6-tag標(biāo)簽；首先，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，獲取和擴(kuò)增嗅覺受體蛋白ODR-1O基因和rho-tag信號肽序列全長cDNA，并在N末端添加融合表達(dá)的His6_tag標(biāo)簽，上游引物序列SEQ ID N0.2 ;下游引物序列如SEQ ID N0.3所示；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)在50 μ L 反應(yīng)體系中進(jìn)行，包括 I μ L PEGFP-Nl/rho-tag/odr-lOJ^ML, I μ L 上游引物，I μ L 下游引物，4 μ L濃度為IOmM的dNTP混合物，0.5 μ L高保真聚合酶STAR (Takara,日本)，10 μ L PCR緩沖液(含Mg2+)和32.5 μ L去離子水，溫度循環(huán)首先是95°C預(yù)變性3分鐘，接著進(jìn)行30循環(huán)的94°C變性30秒、60°C退火30秒、72°C延伸70秒，最后是10°C降溫10秒。擴(kuò)增后獲得的產(chǎn)物通過限制性內(nèi)切酶的雙酶切反應(yīng)亞克隆到表達(dá)M(AtpcDNA3.1(+)的多克隆位點(diǎn)命I琳BernH /之間，完成嗅覺受體蛋白的表達(dá)載體pcDNA3.1 (+)/his6-tag/rho-tag/odr-W的構(gòu)建,其基因序列如SEQ ID N0.4通過測序進(jìn)行鑒定;
(1.2)轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞HEK-293:HEK_293細(xì)胞培養(yǎng)液為添加了體積百分比為10%的胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μ g/mL)的DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37°C、體積百分比為5% CO2的培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)染之前一天，HEK-293細(xì)胞被接種于六孔培養(yǎng)皿中，每孔接種500 μ L濃度為0.5 2Χ IO5 cells/mL的細(xì)胞，在不含抗生素的DMEM高糖培養(yǎng)基里生長至融合度約為80-90%，待轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染試劑為Iipofectamin 2000，使用步驟1.1構(gòu)建好的表達(dá)載體制J.1 (+)/his6-tag/rho-tag/odr-10轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞；用無血清DMEM培養(yǎng)液把4 μ g表達(dá)載體稀釋至50 μ L，混勻；再用無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋10 μ L的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Iipfectamin 2000至50 μ L，在室溫下孵育5分鐘；接著把稀釋后的表達(dá)載體和Iipfectamin 2000混合至總體積為100 μ L,搖勻，室溫孵育20分鐘；六孔板的每個(gè)孔中加入100 μ L表達(dá)載體和Iipfectamin 2000的混合液，前后搖板混勻后，在37°C、體積百分比為5% CO2的培養(yǎng)箱孵育24-48小時(shí)后，嗅覺受體蛋白即表達(dá)在HEK-293細(xì)胞膜表面，以備用作嗅覺受體傳感器的敏感材料；
(1.3)提取嗅覺受體蛋白0DR-10:為將步驟1.2中制備的嗅覺受體蛋白0DR-10用作嗅覺受體傳感器的敏感材料，使用膜蛋白提取試劑盒從轉(zhuǎn)染后的HEK-293細(xì)胞中提取嗅覺受體蛋白0DR-10 ;先收集轉(zhuǎn)染48小時(shí)的HEK-293細(xì)胞，用4°C的去離子水離心洗3次，每次5分鐘；然后加入ImL蛋白提取緩沖液、I μ L蛋白酶抑制劑、I μ L DDT，超聲破碎4次，然后40C 14000g離心10分鐘，棄沉淀，上清液轉(zhuǎn)至一新的離心管中水浴10分鐘，室溫下13000離心5分鐘，樣品分為上下兩層，下層含有細(xì)胞膜蛋白；取下層樣品，加入500yL 4°C滅菌水，4°C放置5分鐘，然后37°C水浴10分鐘，室溫下13000離心5分鐘，樣品分為上下兩層，重復(fù)此步驟5次；最終得到的下層樣品即為膜蛋白混合物，其中包含帶有融合His6-tag標(biāo)簽的嗅覺受體蛋白0DR-10 ;-70°C保存待用。所述步驟(2)具體為:本發(fā)明的嗅覺受體傳感器制備過程如下:將石英晶體微天平置于乙醇中浸泡10分鐘,氮?dú)飧稍?；然后IM NaOH水溶液中浸泡20分鐘,去離子水清洗；IM HCl溶液中浸泡5分鐘；新配置的濃H2SO4與H2O2 (體積比2:3)混合液浸泡I分鐘，氮?dú)飧稍?，以完成石英晶體微天平的徹底清潔；利用金巰鍵自組裝反應(yīng)在石英晶體微天平的金電極上共價(jià)固定一層可以特異性識別融合表達(dá)的His6-tag標(biāo)簽的巰基化單鏈DNA適配體，該適配體由5’末端共價(jià)修飾 了 HS-(CH2)6基團(tuán)的SEQ ID N0.5所示的基因序列組成，室溫下反應(yīng)21小時(shí)；然后封閉分子(Il-MUA)封閉石英晶體微天平傳感器的金電極表面未反應(yīng)的位點(diǎn)，封閉條件為室溫下I小時(shí)；把步驟1.5制備的含有嗅覺受體蛋白的細(xì)胞膜蛋白混合液均勻孵育在石英晶體微天平傳感器的金電極表面，并放在室溫孵育過夜，使嗅覺受體蛋白通過融合表達(dá)的His6-tag標(biāo)簽與適配體發(fā)生特異性的結(jié)合反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)嗅覺受體蛋白在石英晶體微天平傳感器的金電極表面特異性固定和純化；細(xì)胞膜的磷脂雙分子層有利于保持嗅覺受體蛋白ODR-1O的天然構(gòu)象；N2吹干后將表面固定有嗅覺受體蛋白的石英晶體微天平安裝在檢測系統(tǒng)中，完成嗅覺受體傳感器的構(gòu)建，以用于氣味物質(zhì)的檢測。本發(fā)明的有益效果，本發(fā)明采用現(xiàn)代分子克隆技術(shù)，制備出能特異性結(jié)合氣味分子丁二酮的嗅覺受體蛋白0DR-10，用作氣體傳感器的敏感材料，克服了傳統(tǒng)的氣體檢測中敏感材料特異差、靈敏度低的缺點(diǎn)。采用適配體自組裝固定技術(shù)實(shí)現(xiàn)嗅覺受體在二級傳感器表面的有效耦合固定，不僅可以提高傳感器的穩(wěn)定性，而且適配體特異有效結(jié)合嗅覺受體蛋白的能力實(shí)現(xiàn)嗅覺受體蛋白在傳感器芯片上的一步純化，其它無關(guān)膜蛋白由于缺乏與適配體的親和力不能被固定在傳感器表面，進(jìn)而提高了嗅覺受體蛋白在傳感器表面的固定效率和分布密度，克服了傳統(tǒng)敏感材料不能有效與二級傳感器耦合的問題，最終有助于提高傳感器的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性。該檢測方法采用有效固定了嗅覺受體蛋白的石英晶體微天平作為嗅覺受體傳感器，可以實(shí)現(xiàn)對氣味分子丁二酮的實(shí)時(shí)、快速、特異性檢測，克服了傳統(tǒng)檢測技術(shù)流程復(fù)雜、特異性低、敏感性差、無法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測的缺點(diǎn)，適用于復(fù)雜氣體環(huán)境中氣體的實(shí)時(shí)特異性監(jiān)測。該嗅覺受體作為敏感材料特異性檢測氣體的這些優(yōu)點(diǎn)和功能可以滿足復(fù)雜氣體環(huán)境中氣味分子的特異性實(shí)時(shí)快速檢測，可廣泛用于生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境保護(hù)和食品行業(yè)等相關(guān)領(lǐng)域。


圖1是本發(fā)明制備嗅覺受體蛋白0DR-10的基因結(jié)構(gòu) 圖2是本發(fā)明將固定嗅覺受體蛋白0DR-10在石英晶體微天平上的示意 圖3是本發(fā)明嗅覺受體傳感器檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu) 圖4是本發(fā)明制備嗅覺受體蛋白0DR-10的RT-PCR結(jié)果 圖5是本發(fā)明制備嗅覺受體蛋白0DR-10的Western blot結(jié)果 圖6是本發(fā)明嗅覺受體傳感器檢測幾種氣味物質(zhì)的結(jié)果 圖7是本發(fā)明嗅覺受體傳感器檢測不同濃度丁二酮的結(jié)果 圖中，融合表達(dá)的His6-tag基因1、rho-tag信號肽基因2、嗅覺受體蛋白0DR-10基因
3、脂質(zhì)雙分子層4、嗅覺受體蛋白5、融合表達(dá)的His6-tag標(biāo)簽6、封閉分子7、適配體8、金電極9、石英晶體10、第一氣閥11、注射泵12、廢氣氣袋13、氣體管路14、檢測腔的蓋子15、檢測腔體16、橡膠密封圈17，石英晶體微天平18、信號輸出電極19、QCM200檢測系統(tǒng)20、潔凈空氣氣袋21、待測氣體氣袋22、第二氣閥23。
具體實(shí)施例方式下面詳細(xì)介紹以嗅覺受體蛋白0DR-10作為敏感元件結(jié)合石英晶體微天平傳感器制備嗅覺受體傳感器檢測氣體的基本原理以及具體步驟。本發(fā)明基于嗅覺受體傳感器檢測氣味物質(zhì)丁二酮的方法，包括以下步驟:1、制備嗅覺受體蛋白ODR-1O
1.1表達(dá)載體的構(gòu)建
首先采用基因工程技術(shù)對含有嗅覺受體蛋白0DR-10基因3和rho-tag信號肽2序列全I(xiàn) cmk飽質(zhì)第LPEGFP-Nl/rho-tag/odr-ΙΟ (其基因序列如SEQ ID N0.1所示)進(jìn)行適當(dāng)改造，構(gòu)建適用于嗅覺受體傳感器使用的嗅覺受體蛋白5的表達(dá)載體，使其N末端帶有融合表達(dá)的His6-tag標(biāo)簽6 ;首先，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，獲取和擴(kuò)增嗅覺受體蛋白0DR-10基因3和rho-tag信號肽2序列全長cDNA,并在N末端添加融合表達(dá)的His6_tag標(biāo)簽,上游引物序列SEQ ID N0.2:5’ -AGAGGTACCGATGCACCACCACCACCACCACATGAACGGGACCGAGGGCCCAA-3' 其中下劃線部分為治7/7 I酶切位點(diǎn)，虛線部分為融合表達(dá)的His6-tag基因I序列，以便使后續(xù)表達(dá)的嗅覺受體蛋白5的N末端含有融合表達(dá)的His6-tag標(biāo)簽6，有助于嗅覺受體蛋白5在傳感器表面的有效固定；下游引物序列如SEQ ID勵(lì).3所示:5’_ cgc^gatcctcacgtcggaacttgagacaaat-3’，其中下劃線部分為及麗Y I酶切位點(diǎn)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)在50 μ L反應(yīng)體系中進(jìn)行，包括I μ L PEGFP-Nl/rho-tag/odr-10質(zhì)Μ ，I μ L上游引物，I μ L下游引物，4 μ L濃度為IOmM的dNTP混合物，0.5 μ L高保真聚合酶STAR ，IOyL的PCR緩沖液(含Mg2+)和32.5 μ L去離子水，溫度循環(huán)首先是95°C預(yù)變性3分鐘，接著進(jìn)行30循環(huán)的94°C變性30秒、60°C退火30秒、720C延伸70秒，最后是10°C降溫10秒。擴(kuò)增后獲得的產(chǎn)物his6_tag/通過限制性內(nèi)切酶的雙酶切反應(yīng)亞克隆到表達(dá)載體pciWA .7句的多克隆位點(diǎn)Kpn I和BamH /之間，完成嗅覺受體蛋白5的表達(dá)載體pcDNA3.1 (+)/his6-tag/rho-tag/odr-10的構(gòu)建，其基因序列如SEQ ID N0.4通過測序進(jìn)行鑒定。1.2轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞HEK-293
HEK-293細(xì)胞培養(yǎng)液為添加了體積百分比為10%的胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μ g/mL)的DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37°C、體積百分比為5% CO2的培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)染之前一天，HEK-293細(xì)胞被接種于六孔培養(yǎng)皿中，每孔接種500 μ L濃度為0.5 2X IO5 cells/mL的細(xì)胞，在不含抗生素的DMEM高糖培養(yǎng)基里生長至融合度約為80_90%，待轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染試劑為Iipofectamin 2000，使用步驟1.1構(gòu)建好的表達(dá)載體pciWA .7 PJ/his6-tag/rho-tag/odr-10轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞；用無血清DMEM培養(yǎng)液把4 μ g表達(dá)載體稀釋至50 μ L,混勻；再用無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋10 μ L的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Iipfectamin2000至50 μ L，在室溫下孵育5分鐘；接著把稀釋后的表達(dá)載體和Iipfectamin 2000混合至總體積為100 μ L，搖勻，室溫孵育20分鐘；六孔板的每個(gè)孔中加入100 μ L表達(dá)載體和Iipfectamin 2000的混合液，前后搖板混勻后，在37°C、體積百分比為5% CO2的培養(yǎng)箱孵育24-48小時(shí)后，嗅覺受體蛋白5即表達(dá)在HEK-293細(xì)胞膜表面，以用備作嗅覺受體傳感器的敏感材料。1.3逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)
采用RT-PCR的方法檢測嗅覺受體蛋白5在細(xì)胞內(nèi)mRNA水平的表達(dá)水平以驗(yàn)證其成功表達(dá)制備；HEK-293細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，按Trizol —步法提取細(xì)胞的總RNA ;先取出六孔板細(xì)胞至滅好菌的超凈工作臺，吸棄培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)輕輕地洗一遍；然后向每孔加入0.5 mL Trizol試劑，用移液器吹打細(xì)胞使之脫落、裂解；再將上述Trizol裂解后細(xì)胞液轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中，在室溫(15°C 30°C )下放置5分鐘；向上述EP管中按照每I mL Trizol加0.2 mL氯仿的比例加入氯仿，蓋上蓋子，在手中用力震蕩15秒，室溫下(15°C 30°C)放置2 3分鐘后，12000 g (2°C 8°C)離心18分鐘；從離心機(jī)中取出EP管后樣品分為三層，底層的黃色有機(jī)相、中間層和上層的水相；將上層水相取出至一新的1.5 mL EP管中，按照每I mL Trizol加0.5 mL異丙醇的比例加入異丙醇,在室溫下(15°C 30°C)放置10分鐘，12000 g (2°C 8°C )離心10分鐘，然后棄去上清液；再按照每I mL Trizol加I mL 75%乙醇的比例進(jìn)行渦旋混合洗滌，之后7500 g (2°C 8°C)離心5分鐘，棄去上清液；沉淀物即為細(xì)胞的總RNA，使之室溫下自然干燥；用不含RNA酶的去離子水溶解RNA沉淀，置于_70°C冰箱保存待用；然后取5 μ L RNA溶液，通過檢測260nm及280 nm波長下紫外吸光度，估算其純度，并計(jì)算核酸含量(RNA在260 nm波長下吸光度為I時(shí)，濃度相當(dāng)于40 yg/mL)。將RNA溶液稀釋至濃度為0.2 μ g/μ L，然后從中取5 μ L至PCR小管，再加入Iμ L隨機(jī)六聚引物、I μ L濃度均為10 mM的dNTP混合物、3 μ L不含RNA酶的去離子水混勻，短暫離心數(shù)秒，在PCR儀上70°C反應(yīng)5分鐘進(jìn)行變性；于冰浴下冷卻退火；再依次加入4μ L 5倍濃度PrimerScript 緩沖液、0.5 μ L濃度為40 U/μ L的RNA酶抑制劑、I μ L濃度為200 U/μ L的PrimeScripteRTase和4.5 μ L不含RNA酶的去離子水，混勻?yàn)?0 μ L的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液；于PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為:30°C反應(yīng)10分鐘、42° C反應(yīng)45分鐘、95°C反應(yīng)5分鐘；停止反應(yīng)后，取出逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物立即置于冰上；產(chǎn)物放在_20°C保存。之后以上述獲得的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物基因序列如SEQID N0.2:5’ -AGAGGTACCGATGCACCACCACCACCACCACATGAACGGGACCGAGGGCCCAA-3’ ；下游引物基因序列如 SEQ ID N0.3 所不:5，-cgcggatcctcacgtcggaacttgagacaaat_3，:冰浴下，IuL逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA模板、I μ L上游引物、I μ L下游引物、4 μ L濃度為IOmM的dNTP混合物、
0.5 μ L高保真聚合酶STAR 、IOyL PCR緩沖液(含Mg2+)和32.5 μ L去離子水混合為總量為50 μ L的反應(yīng)體系，95°C預(yù)變性3分鐘，接著進(jìn)行30循環(huán)的94°C變性30秒、60°C退火30秒、72°C延伸70秒，最后是10°C降溫10秒；PCR產(chǎn)物電泳后通過紫外成像系統(tǒng)觀察電泳條帶確定嗅覺受體蛋白0DR-10基因3在細(xì)胞內(nèi)mRNA水平的表達(dá)。1.4 Western blot 鑒定
采用Western blot技術(shù)從蛋白水平鑒定嗅覺受體5在HEK-293細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況；首先在RIPA強(qiáng)裂解液加入PMSF，使PMSF終濃度為ImM待用；取出轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的HEK-293細(xì)胞至超凈工作臺，吸棄培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液洗一次，棄掉廢液，置于冰上；向六孔板的每個(gè)孔中加入200 μ L裂解液，反復(fù)吹打細(xì)胞，使裂解液與細(xì)胞充分接觸30分鐘；細(xì)胞充分裂解后，14000g離心5分鐘，取上清至離心管中即獲得嗅覺受體蛋白樣品；取50 μ L樣品至
1.5mL的EP管中，加入12.5 μ L 5倍loading緩沖液混勻，100。。煮沸10分鐘，12000g室溫離心I分鐘，上清液加入蛋白SDS-PAGE凝膠，120V電壓下進(jìn)行蛋白電泳；然后轉(zhuǎn)至PVDF膜，浸于質(zhì)量百分比為2.5%的牛血清白蛋白溶液中，室溫?fù)u床孵育I小時(shí)，完成封閉；然后用TBST溶液洗3遍，每次10分鐘，加入一抗(抗His6-tag鼠IgG)，4°C孵育過夜；取出PVDF膜用TBST溶液洗3遍，每次10分鐘，加入1:500的二抗(DyLight680標(biāo)記山羊抗小鼠IgG)室溫避光搖床孵育I小時(shí)；置于Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)下掃描分析；預(yù)計(jì)目標(biāo)蛋白大小為45kD ;通過Western blot蛋白電泳條帶的位置鑒定嗅覺受體蛋白5是否在HEK-293細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)。
1.5提取嗅覺受體蛋白0DR-10
為將步驟1.2中制備的嗅覺受體蛋白5用作嗅覺受體傳感器的敏感材料，使用膜蛋白提取試劑盒從轉(zhuǎn)染后的HEK-293細(xì)胞中提取嗅覺受體蛋白0DR-10 ;先收集轉(zhuǎn)染48小時(shí)的HEK-293細(xì)胞，用4°C的去離子水離心洗3次，每次5分鐘；然后加入ImL蛋白提取緩沖液、IuL蛋白酶抑制劑、I μ L DDT，超聲破碎4次，然后4°C 14000g離心10分鐘，棄沉淀，上清液轉(zhuǎn)至一新的離心管中水浴10分鐘，室溫下13000離心5分鐘，樣品分為上下兩層，下層含有細(xì)胞膜蛋白；取下層樣品，加入500 μ L 4°C滅菌水，4°C放置5分鐘，然后37°C水浴10分鐘，室溫下13000離心5分鐘，樣品分為上下兩層，重復(fù)此步驟5次；最終得到的下層樣品即為膜蛋白混合物，其中包含帶有融合His6-tag標(biāo)簽的嗅覺受體蛋白0DR-10 ;-70°C保存待用。本步驟I中，子步驟1.3和1.4用于驗(yàn)證嗅覺受體蛋白已成功表達(dá)在細(xì)胞膜表面，并非本步驟I的必要子步驟。2、固定嗅覺受體蛋白0DR-10在石英晶體微天平表面構(gòu)建嗅覺受體傳感器 本發(fā)明中嗅覺受體傳感器以嗅覺受體蛋白0DR-10為敏感材料，固定在石英晶體微天
平表面，具體構(gòu)建過程如下；將石英晶體微天平18置于乙醇中浸泡10分鐘，氮?dú)飧稍铮蝗缓驣M NaOH水溶液中浸泡20分鐘，去離子水清洗；1M HCl溶液中浸泡5分鐘；新配置的濃H2SO4與H2O2 (體積比2:3)混合液浸泡I分鐘，氮?dú)飧稍?，以完成石英晶體微天平18的徹底清潔；利用金巰鍵自組裝反應(yīng)在石英晶體微天平18的金電極9上共價(jià)固定一層可以特異性識別融合表達(dá)的His6-tag標(biāo)簽6的巰基化單鏈DNA適配體8，該適配體8由5’末端共價(jià)修飾了 HS-(CH2)6 基團(tuán)的 SEQ ID N0.5 所示的基因序列組成(5’-HS-(CH2)6_GCTATGGGTGGTCTGGTTGGGATTGGCCCCGGGAGCTGGC-3’)，室溫下反應(yīng)21小時(shí)；然后封閉分子7 (11-MUA)封閉石英晶體微天平傳感器的金電極17表面未反應(yīng)的位點(diǎn)，封閉條件為室溫下I小時(shí)；把步驟1.5制備的含有嗅覺受體蛋白5的細(xì)胞膜蛋白混合液均勻孵育在石英晶體微天平傳感器的金電極9表面,并放在室溫孵育過夜,使嗅覺受體蛋白5通過融合表達(dá)的His6-tag標(biāo)簽6與適配體8發(fā)生特異性的結(jié)合反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)嗅覺受體蛋白5在石英晶體微天平傳感器的金電極9表面特異性固定和純化；細(xì)胞膜的磷脂雙分子層4有利于保持嗅覺受體蛋白0DR-10的天然構(gòu)象；N2吹干后將表面固定有嗅覺受體蛋白5的石英晶體微天平18安裝在檢測系統(tǒng)中，完成嗅覺受體傳感器的構(gòu)建，以用于氣味物質(zhì)的檢測。3、氣味物質(zhì)丁二酮的檢測
3.1石英晶體微天平傳感器原理
本發(fā)明中使用石英晶體微天平作為嗅覺受體傳感器的二級傳感器，石英晶體微天平是一種質(zhì)量敏感型傳感器，基本原理是石英晶體的諧振頻率與其表面的表面微小的壓力改變相關(guān)，通過記錄石英晶體諧振頻率的改變監(jiān)測石英晶體表面微小的壓力變化?；诖嗽?，也可以通過監(jiān)測石英晶體諧振頻率的變化來檢測石英晶體表面微小的質(zhì)量變化。利用這個(gè)原理將石英晶體微天平與嗅覺受體蛋白結(jié)合構(gòu)建嗅覺受體傳感器，嗅覺受體蛋白作為敏感元件固定在石英晶體微天平敏感電極表面，與待測物質(zhì)發(fā)生特異性吸附作用后，石英晶體微天平可以到檢測這一過程。當(dāng)氣味物質(zhì)被固定于石英晶體表面的嗅覺受體蛋白所吸附時(shí)，石英晶體微天平表面的質(zhì)量也發(fā)生變化，引起石英晶體諧振頻率的改變，而且頻率的改變與石英晶體表面質(zhì)量的改變成正比，滿足公式其中為石英晶體諧振頻率的變化(Hz)，^為石英晶體表面的質(zhì)量變化(g)，f為相關(guān)系數(shù)，Z7為石英晶體的初始頻率(MHz)，A為電極總的表面積(cm2)，r為晶體的密度(g/cm3)， 為晶體的厚度(cm)。因此，通過監(jiān)測石英晶體諧振頻率的變化可以計(jì)算出其表面的質(zhì)量變化，獲得氣味物質(zhì)與表面嗅覺受體蛋白相互作用信息，間接計(jì)算出氣味物質(zhì)的濃度，最終實(shí)現(xiàn)對氣味物質(zhì)的特異性檢測。3.2嗅覺受體傳感器檢測氣體的過程
石英晶體微天平傳感器18諧振頻率的信號通過傳感器電極接口 19傳送到QCM200檢測系統(tǒng)20 (Stanford Research Systems, Inc., USA),以記錄氣味物質(zhì)與嗅覺受體蛋白5相互作用引起的石英晶體微天平傳感器18諧振頻率的改變量；首先打開第一氣閥11并關(guān)閉第二氣閥23，由注射泵12通過氣體管路14將潔凈空氣氣袋21中的空氣以lmL/s的流速泵入檢測腔內(nèi)，待石英晶體微天平傳感器18的諧振頻率達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)后，再打開第二氣閥23并關(guān)閉第一氣閥11將濃度確定的含有氣味物質(zhì)丁二酮的待測氣體從待測氣體氣袋22泵入檢測腔，待石英晶體微天平傳感器18的諧振頻率再次穩(wěn)定后，諧振頻率的改變量即為傳感器對此濃度下的氣體物質(zhì)丁二酮的響應(yīng)值；最后再打開第一氣閥11并關(guān)閉第二氣閥23，將潔凈空氣泵入檢測腔內(nèi)，清洗氣體檢測腔，即完成一次檢測過程；至少間隔IOmin后，待石英晶體微天平傳感器18的諧振頻率穩(wěn)定后可泵入另一待測氣體到檢測腔進(jìn)行下一次檢測；重復(fù)上述步驟，得到一系列濃度的氣體物質(zhì)丁二酮引起的傳感器諧振頻率改變量，得到丁二酮濃度-諧振頻率改變量曲線。對于未知濃度的氣體物質(zhì)丁二酮的檢測，首先打開第一氣閥11并關(guān)閉第二氣閥23，由注射泵12通過氣體管路14將潔凈空氣氣袋21中的空氣以lmL/s的流速泵入檢測腔內(nèi)，待石英晶體微天平傳感器18的諧振頻 率達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)Ftl后，再打開第二氣閥23并關(guān)閉第一氣閥11將濃度未知的待測氣體從待測氣體氣袋22泵入檢測腔，待石英晶體微天平傳感器18的諧振頻率再次穩(wěn)定到F1后，得到諧振頻率改變量F1- F0,根據(jù)上述步驟得到的丁二酮濃度-諧振頻率改變量曲線推算出待測氣體物質(zhì)丁二酮的濃度，實(shí)現(xiàn)對丁二酮的濃度測定。下面結(jié)合附圖和實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，本發(fā)明的目的和效果將變得更加明顯。如圖1所示，本發(fā)明制備的嗅覺受體蛋白0DR-10的基因結(jié)構(gòu)圖，圖中，融合表達(dá)的His6-tag基因1、rho-tag信號肽基因2、嗅覺受體蛋白0DR-10基因3，這種基因結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)表達(dá)的嗅覺受體蛋白0DR-10在N末端帶有融合表達(dá)的His6-tag標(biāo)簽和rho-tag信號肽，融合表達(dá)的His6-tag標(biāo)簽有助于將嗅覺受體蛋白0DR-10有效地固定在石英晶體微天平的金電極，rho-tag信號肽有利于嗅覺受體蛋白0DR-10在細(xì)胞膜的正確定位；圖2所示為本發(fā)明中嗅覺受體蛋白0DR-10固定在石英晶體微天平表面上的示意圖，N末端融合表達(dá)有His6-tag標(biāo)簽6的嗅覺受體蛋白5,通過His6_tag標(biāo)簽6與適配體8之間的特異性相互結(jié)合被固定在石英晶體10表面的金電極9上，細(xì)胞膜成分的脂質(zhì)雙分子層4有利于保持嗅覺受體蛋白5的天然構(gòu)象，封閉分子7用于封閉金電極表面的裸露位點(diǎn)；圖3所示為嗅覺受體傳感器檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖，其中石英晶體微天平18的表面即圖2所示，表面已經(jīng)成功固定好嗅覺受體蛋白0DR-10，通過控制第一氣閥11和第二氣閥23將潔凈空氣氣袋21和待測氣體氣袋22由注射泵12泵入檢測腔體16中，檢測腔的蓋子15通過螺紋旋在檢測腔體16上方，廢氣通過氣體管路14進(jìn)入廢氣氣袋13，橡膠密封圈17用于將石英晶體微天平18固定在檢測腔體16中，信號輸出電極19將石英晶體微天平18的諧振頻率信號連接至QCM200檢測系統(tǒng)20內(nèi)進(jìn)行信號的實(shí)時(shí)記錄；圖4是是本發(fā)明制備嗅覺受體蛋白ODR-1O的RT-PCR結(jié)果圖，目標(biāo)條帶大約在1.lkb，提示嗅覺受體蛋白5在細(xì)胞內(nèi)mRNA水平上顯著表達(dá)；圖5本發(fā)明制備嗅覺受體蛋白0DR-10的Western blot結(jié)果圖，目標(biāo)條帶大約在45KD,表明在蛋白質(zhì)水平已經(jīng)將嗅覺受體蛋白5成功表達(dá)在HEK-293細(xì)胞內(nèi)；圖6是本發(fā)明嗅覺受體傳感器檢測幾種氣味物質(zhì)的結(jié)果圖，該結(jié)果說明采用嗅覺受體蛋白0DR-10作為敏感材料的嗅覺受體傳感器對氣味物質(zhì)丁二酮最敏感，其他幾種氣體引起的響應(yīng)相對較小，因此該嗅覺受體傳感器具有良好的特異性；圖7是本發(fā)明制備的嗅覺受體傳感器檢測不同濃度丁二酮的結(jié)果圖，最低檢測下限大約為1.5ppm,檢測靈敏度大約為0.55 ±0.024 Hz/ppm,綜上所述此嗅覺受體傳感器能夠靈敏、特異地檢測氣味物質(zhì)丁二酮。<110>浙江大學(xué)
〈120〉一種基于嗅覺受體傳感器檢測氣味物質(zhì)丁二酮的方法
〈160〉5
<170>PatentIn version 3.3
〈210〉 I〈211〉 5778〈212〉 DNA
<213> Caenorhabditis eIegans〈400〉 I
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg60
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca180
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc240
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta300
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac360
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg420
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg480
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt540
acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta600
ccggactcag atctcgagat gaacgggacc gagggcccaa acttctacgt gcctttctcc660
aacaagacgg gcgtggtgga attcatgtcg ggagaattgt ggattaccct agttgacaca720gcggacattg tcggcgtcac cctcaccttc tgtgtcaaca ttgttcttct cggacttctg780
aaaacacgtg gaaaaaactt gggcacttat aaatatctca tggcgttttt ctcagtattc840
tcgatttttt acgccatcat cgagttcata ttacgaccta taatgcatat tgagaacacc900
actttctttt tgatctcaag gaaaagattc aactactcca ccaaacttgg aaaaatcaac960
tctgcgtttt actgtgcttg ttttgccacc agttttgttg tctcaggagt tcactttgtt1020
tatcgatatt ttgcaacttg caaaccgaat ctacttcgtt tgttcaactt gccaactctt1080
ctactttggc cacttggttg cagtgtaccc gtgacaatgt gggctagtgt ctcatatttt1140
ttgtatccag ataccgagta cacggaagcg gctgtcacca atgtactaaa taaccactat1200
aactggatca aaaaggagaa tgtatcgtac attgcatacg tctattacca atacgaaaac1260
ggagtaaggc atatctacct caaaaacttg cttggatgct ttgttcatta ctttgtcatg1320
tcgatgacgt ttgttgtgat gttctactgc ggatatgcca cgtggaaaac tatgaatgaa1380
cacaaggatg tatctgatag aactcgagcg ctacagaaac aacttttcaa agctttagtt1440
cttcagacac tcatcccaac tatcttcatg tacgccccaa ctggagtcat gttcatcgca1500
ccgttttttg acgtgaattt gaatgcaaac gccaatttca ttgtgttttg ctcatttctg1560
tacccgggac tcgatccact cattctgatt ttgatcattc gtgatttccg aagaacaata1620
ttcaatttct tgtgtggaaa gaaaaacagt gttgatgaat cccgctcgac aacaagagcc1680
aatttgtctc aagttccgac gtgaggatcc accggtcgcc accatggtga gcaagggcga1740
ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca1800
caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa1860
gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac1920ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa1980
gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa2040
ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct2100
gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta2160
caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt2220
caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa2280
cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc2340
cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac2400
cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag taaagcggcc gcgactctag2460
atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac2520
ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca2580
gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt2640
tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttaagg cgtaaattgt2700
aagcgttaat attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct cattttttaa2760
ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt2820
gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa2880
agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag2940
ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt3000
tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg3060agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc3120
cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg3180
aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata3240
accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt cctgaggcgg aaagaaccag3300
ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt3360
atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca3420
gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta3480
actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga3540
ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg cctctgagct attccagaag3600
tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaag atcgatcaag agacaggatg3660
aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt3720
ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt3780
gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc3840
cctgaatgaa ctgcaagacg aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc3900
ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga3960
agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat4020
ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca4080
agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga4140
tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc4200
gagcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat4260catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga4320
ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg4380
ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt4440
ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgagc gggactctgg ggttcgaaat gaccgaccaa4500
gcgacgccca acctgccatc acgagatttc gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg4560
ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg4620
ctggagttct tcgcccaccc tagggggagg ctaactgaaa cacggaagga gacaataccg4680
gaaggaaccc gcgctatgac ggcaataaaa agacagaata aaacgcacgg tgttgggtcg4740
tttgttcata aacgcggggt tcggtcccag ggctggcact ctgtcgatac cccaccgaga4800
ccccattggg gccaatacgc ccgcgtttct tccttttccc caccccaccc cccaagttcg4860
ggtgaaggcc cagggctcgc agccaacgtc ggggcggcag gccctgccat agcctcaggt4920
tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg4980
aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga5040
gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta5100
atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa5160
gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact5220
gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca5280
tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt5340
accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg5400ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag5460
cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta5520
agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat5580
ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgeteg5640
tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc5700
ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac5760
cgtattaccg ccatgcat5778
〈210〉2
〈211〉53
〈212〉DNA〈213〉人工設(shè)計(jì)
〈400〉 2
agaggtaccg atgcaccacc accaccacca catgaacggg accgagggcc caa53
〈210〉3
〈211〉32
〈212〉DNA〈213〉人工設(shè)計(jì)
〈400〉 3
cgcggatcct cacgtcggaa cttgagacaa at32
〈210〉4
〈211〉6322
〈212〉DNA
<213>Caenorhabditis elegans
〈400〉4gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc900
gtttaaactt aagcttggta ccgatgcacc accaccacca ccacatgaac gggaccgagg960
gcccaaactt ctacgtgcct ttctccaaca agacgggcgt ggtggaattc atgtcgggag1020
aattgtggat taccctagtt gacacagcgg acattgtcgg cgtcaccctc accttctgtg1080
tcaacattgt tcttctcgga cttctgaaaa cacgtggaaa aaacttgggc acttataaat1140
atctcatggc gtttttctca gtattctcga ttttttacgc catcatcgag ttcatattac1200gacctataat gcatattgag aacaccactt tctttttgat ctcaaggaaa agattcaact1260
actccaccaa acttggaaaa atcaactctg cgttttactg tgcttgtttt gccaccagtt1320
ttgttgtctc aggagttcac tttgtttatc gatattttgc aacttgcaaa ccgaatctac1380
ttcgtttgtt caacttgcca actcttctac tttggccact tggttgcagt gtacccgtga1440
caatgtgggc tagtgtctca tattttttgt atccagatac cgagtacacg gaagcggctg1500
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gatgctttgt tcattacttt gtcatgtcga tgacgtttgt tgtgatgttc tactgcggat1680
atgccacgtg gaaaactatg aatgaacaca aggatgtatc tgatagaact cgagcgctac1740
agaaacaact tttcaaagct ttagttcttc agacactcat cccaactatc ttcatgtacg1800
ccccaactgg agtcatgttc atcgcaccgt tttttgacgt gaatttgaat gcaaacgcca1860
atttcattgt gttttgctca tttctgtacc cgggactcga tccactcatt ctgattttga1920
tcattcgtga tttccgaaga acaatattca atttcttgtg tggaaagaaa aacagtgttg1980
atgaatcccg ctcgacaaca agagccaatt tgtctcaagt tccgacgtga ggatccacta2040
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gcccgtttaa acccgctgat cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt2160
ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta2220
ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg2280
ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc2340ggtgggctct atggcttctg aggcggaaag aaccagctgg ggctctaggg ggtatcccca2400
cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc2460
tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac2520
gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag2580
tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc2640
atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg2700
actcttgttc caaactggaa caacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata2760
agggattttg ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa2820
cgcgaattaa ttctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca2880
gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc2940
ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata3000
gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg3060
ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc tgcctctgag3120
ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa aaagctcccg3180
ggagcttgta tatccatttt cggatctgat caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg3240
attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc3300
tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg3360
caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag3420
gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc3480
gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat3540ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg3600
cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc3660
gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag3720
catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc3780
gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc3840
cgcttttctg gatteatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata3900
gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc3960
gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac4020
gagttcttct gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc4080
catcacgaga tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt4140
tccgggacgc cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag ttcttcgccc4200
accccaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt4260
tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg4320
tatcttatca tgtctgtata ccgtcgacct ctagctagag cttggcgtaa tcatggtcat4380
agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa4440
gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc4500
gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc4560
aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact4620
cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac4680ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa4740
aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg4800
acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa4860
gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc4920
ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac4980
gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac5040
cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg5100
taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt5160
atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa5220
cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct5280
cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtttttt tgtttgcaag cagcagatta5340
cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc5400
agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca5460
cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa5520
cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat5580
ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct5640
taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt5700
tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat5760
ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta5820
atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg5880
權(quán)利要求
1.一種基于嗅覺受體傳感器檢測氣味物質(zhì)丁二酮的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (O制備嗅覺受體蛋白ODR-1O ； (2)固定嗅覺受體蛋白0DR-10在石英晶體微天平表面構(gòu)建嗅覺受體傳感器； (3)將潔凈空氣以lmL/s的流速泵入檢測腔內(nèi)，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)后，再將濃度確定的含有氣味物質(zhì)丁二酮的待測氣體泵入檢測腔，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率再次穩(wěn)定后，諧振頻率的改變量即為嗅覺受體傳感器對此濃度下的氣體物質(zhì)丁二酮的響應(yīng)值；最后再將潔凈空氣泵入檢測腔內(nèi)，清洗氣體檢測腔，即完成一次檢測過程；至少間隔IOmin后，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率穩(wěn)定后可泵入另一濃度待測氣體到檢測腔進(jìn)行下一次檢測；重復(fù)上述步驟，得到一系列濃度的氣體物質(zhì)丁二酮引起的傳感器諧振頻率改變量，得到丁二酮濃度-諧振頻率改變量曲線； (4)對于未知濃度的氣體物質(zhì)丁二酮的檢測，首先將潔凈空氣以lmL/s的流速泵入檢測腔內(nèi)，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)Ftl后，再將濃度未知的待測氣體泵入檢測腔，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率再次穩(wěn)定到F1后，得到諧振頻率改變量F1- Ftl，根據(jù)上述步驟3得到的丁二酮濃度-諧振頻率改變量曲線獲得待測氣體物質(zhì)丁二酮的濃度，實(shí)現(xiàn)對丁二酮的濃度測定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基于嗅覺受體傳感器檢測氣味物質(zhì)丁二酮的方法，其特征在于，所述步驟I包括以下子步驟: (1.0構(gòu)建表達(dá)載體:首先采用基因工程技術(shù)對含有嗅覺受體蛋白0DR-10基因和rho-tag信號妝序列全長cDNA飽質(zhì)MlPEGFP-Nl/rho-tag/odr-ΙΟ (其基因序列如SEQ IDN0.1所示)進(jìn)行適當(dāng)改造，構(gòu)建適用于嗅覺受體傳感器使用的嗅覺受體蛋白的表達(dá)載體，使其N末端帶有融合表達(dá)的His6-tag標(biāo)簽；首先，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，獲取和擴(kuò)增嗅覺受體蛋白0DR-10基因和rho-tag信號肽序列全長cDNA，并在N末端添加融合表達(dá)的His6_tag標(biāo)簽，上游引物序列SEQ ID N0.2 ;下游引物序列如SEQ ID N0.3所示；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在50 μ L反應(yīng)體系中進(jìn)行，溫度循環(huán)首先是95°C預(yù)變性3分鐘，接著進(jìn)行30循環(huán)的94°C變性30秒、60°C退火30秒、72°C延伸70秒，最后是10°C降溫10秒；擴(kuò)增后獲得的產(chǎn)物rho-tag/odr-10通過限制性內(nèi)切酶的雙酶切反應(yīng)亞克隆到表達(dá)載體pcDNA3.1 (+)的多克隆位點(diǎn)Kpn I和BernH /之間，完成嗅覺受體蛋白的表達(dá)載體pciWA .1 (+)/his6~tag/rho-tag/odr-10的構(gòu)建，其基因序列如SEQ ID N0.4通過測序進(jìn)行鑒定； (1.2)轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞HEK-293:HEK_293細(xì)胞培養(yǎng)液為添加了體積百分比為10%的胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μ g/mL)的DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37°C、體積百分比為5% CO2的培養(yǎng)箱；轉(zhuǎn)染之前一天，HEK-293細(xì)胞被接種于六孔培養(yǎng)皿中，每孔接種500 μ L濃度為0.5 2Χ IO5 cells/mL的細(xì)胞，在不含抗生素的DMEM高糖培養(yǎng)基里生長至融合度約為80-90%，待轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染試劑為Iipofectamin 2000，使用步驟1.1構(gòu)建好的表達(dá)載體制J.1 (+)/his6-tag/rho-tag/odr-10轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞；用無血清DMEM培養(yǎng)液把4 μ g表達(dá)載體稀釋至50 μ L，混勻；再用無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋10 μ L的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Iipfectamin 2000至50 μ L，在室溫下孵育5分鐘；接著把稀釋后的表達(dá)載體和Iipfectamin 2000混合至總體積為100 μ L,搖勻，室溫孵育20分鐘；六孔板的每個(gè)孔中加入100 μ L表達(dá)載體和Iipfectamin 2000的混合液，前后搖板混勻后，在37°C、體積百分比為5% CO2的培養(yǎng)箱孵育24-48小時(shí)后，嗅覺受體蛋白即表達(dá)在HEK-293細(xì)胞膜表面，以備用作嗅覺受體傳感器的敏感材料； (1.3)提取嗅覺受體蛋白0DR-10:為將步驟1.2中制備的嗅覺受體蛋白0DR-10用作嗅覺受體傳感器的敏感材料，使用膜蛋白提取試劑盒從轉(zhuǎn)染后的HEK-293細(xì)胞中提取嗅覺受體蛋白0DR-10 ;先收集轉(zhuǎn)染48小時(shí)的HEK-293細(xì)胞，用4°C的去離子水離心洗3次，每次5分鐘；然后加入ImL蛋白提取緩沖液、I μ L蛋白酶抑制劑、I μ L DDT，超聲破碎4次，然后40C 14000g離心10分鐘，棄沉淀，上清液轉(zhuǎn)至一新的離心管中水浴10分鐘，室溫下13000離心5分鐘，樣品分為上下兩層，下層含有細(xì)胞膜蛋白；取下層樣品，加入500 μ L 4°C滅菌水，4°C放置5分鐘，然后37°C水浴10分鐘，室溫下13000離心5分鐘，樣品分為上下兩層，重復(fù)此步驟5次；最終得到的下層樣品即為膜蛋白混合物，其中包含帶有融合His6-tag標(biāo)簽的嗅覺受體蛋白0DR-10 ;-70°C保存待用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基于嗅覺受體傳感器檢測氣味物質(zhì)丁二酮的方法，其特征在于，所述步驟2具體為:將石英晶體微天平置于乙醇中浸泡10分鐘，氮?dú)飧稍铮蝗缓驣MNaOH水溶液中浸泡20分鐘，去離子水清洗；1M HCl溶液中浸泡5分鐘；濃H2SO4與H2O2按體積比2:3組成的混合液中浸泡I分鐘，氮?dú)飧稍?，以完成石英晶體微天平的徹底清潔；利用金巰鍵自組裝反應(yīng)在石英晶體微天平的金電極上共價(jià)固定一層可以特異性識別融合表達(dá)的His6-tag標(biāo)簽的巰基化單鏈DNA適配體，該適配體由5’末端共價(jià)修飾了 HS-(CH2)6基團(tuán)的SEQ ID N0.5所示的基因序列組成，室溫下反應(yīng)21小時(shí)；然后封閉分子Il-MUA封閉石英晶體微天平傳感器的金電極表面未反應(yīng)的位點(diǎn)，封閉條件為室溫下I小時(shí)；把步驟1.5制備的含有嗅覺受體蛋白的細(xì)胞膜蛋白混合液均勻孵育在石英晶體微天平傳感器的金電極表面，并放在室溫孵育 過夜，使嗅覺受體蛋白通過融合表達(dá)的His6-tag標(biāo)簽與適配體發(fā)生特異性的結(jié)合反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)嗅覺受體蛋白在石英晶體微天平傳感器的金電極表面特異性固定和純化。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于嗅覺受體傳感器檢測氣味物質(zhì)丁二酮的方法，首先在HEK-293細(xì)胞表面表達(dá)了帶有His6-tag標(biāo)簽的嗅覺受體蛋白ODR-10，并提取出來將其利用適配體有效地固定在石英晶體微天平表面構(gòu)建成嗅覺受體傳感器；通過測試一系列確定濃度氣味物質(zhì)丁二酮，得到丁二酮濃度-諧振頻率改變量標(biāo)準(zhǔn)曲線；然后測試未知濃度待測氣體，根據(jù)石英晶體微天平諧振頻率的改變量和丁二酮濃度-諧振頻率改變量標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測氣體中氣味物質(zhì)丁二酮的濃度。本發(fā)明方法所需儀器簡單、操作方便，解決了敏感元件嗅覺受體蛋白ODR-10與石英晶體微天平的穩(wěn)定耦合，實(shí)現(xiàn)了快速、特異地檢測氣味物質(zhì)丁二酮。
文檔編號G01N5/02GK103149111SQ20131006040
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月26日
發(fā)明者杜立萍, 吳春生, 鄒玲, 王平 申請人:浙江大學(xué)