專利名稱：一種集成軟彈性細胞電化學(xué)傳感器的微流控芯片及其制法和在細胞動態(tài)分析中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及集成軟彈性細胞電化學(xué)傳感器的微流控芯片及其制法和在細胞動態(tài)分析中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
發(fā)展原位、快速的分析新方法一直是分析化學(xué)界的重大挑戰(zhàn)。尤其在細胞生物學(xué)領(lǐng)域，隨著分析樣品的復(fù)雜性、多樣性，對這些分析方法提出了更高的要求。細胞作為生命活動的基本單位，其行為的發(fā)展變化對疾病的發(fā)生、發(fā)展都具有重要意義。一個活細胞可以被描述為一個在細胞界面上電子生成和遷移的電化學(xué)動態(tài)系統(tǒng)。近年來，一系列用于細胞傳感的電化學(xué)方法發(fā)展起來(參見:(a) Zhang, J.J.; Zheng, T.T.; Cheng, F.F.; Zhang, J.R.; Zhu, J.J.Anal.Chem.2011, 83, 7902.(b) Min, K.; Jo, H.;Song, K.; Cho, M.; Chun, Y.S.; Jon, S.; Kim, ff.J.; Ban, C.Biomaterials 2011,32, 2124.(c) Takahashi, Y.; Miyamoto, T.; Shiku, H.; Asano, R.; Yasukawa, T.;Kumagai, 1.; Matsue, T.Anal.Chem.2009, 81, 2785.(d) Chang, B.-Y.; Park,S.-M.Annu.Rev.Anal.Chem.2010, 3, 207.(e) Wang, ff.; Foley, K.; Shan, X.;Wang, S.; Eaton, S.; Nagaraj, V.J.; ffiktor, P.; Patel, U.; Tao, N.Nature Chem.2011，3，249.)。在諸多分析方法中，基于細胞芯片的電化學(xué)方法以其簡單、快速且具有高靈敏性和無損性而發(fā)展迅速(參見:(f) Wang, L.; Yin, H.; Xing, ff.; Yu, Z.; Guo, M.;Cheng, J.Biosens.Bioelectron.2010, 25, 990.(g) Lee, J.H.; Oh, B.K.; Choi,B.; Jeong, S.; Choi, J.ff.Biochip J.2010，4，1.(h) El-Said, ff.A.; Yea, C.H.; Kim, H.; Oh, B.K.; Choi, J.-ff.Biosens.Bioelectron.2009, 24, 1259.(i)El-Said, ff.A.; Kim, T.-H.; Kim, H.; Choi, J.-ff.Biosens.Bioelectron.2010,26，1486.(j) Ka , M.A.; Kim, T.H.; An, J.H.; Choi, J.ff.Anal.Chem.2011，83，2104.)。但培養(yǎng)腔室內(nèi)試劑的不充分移除對準確分析造成了一定的困難，且基于硅基底的金電極的加工過程需要昂貴的儀器設(shè)備從而限制了該裝置在普通實驗室的使用。微流控芯片以其操作便捷、試劑耗樣量少、便于各功能單元的集成等諸多優(yōu)點而受到人們的廣泛青睞(參見:(k) Cao, J.T.; Hao, X.Y.; Zhu, Y.D.; Sun, K.; Zhu, J.J.Anal.Chem.2012，84，6775.(I) Li, L.-Μ.; Wang, ff.; Zhang, S.-H.; Chen, S.-J.; Guo,S.-S.; Franpais, 0.; Cheng, J.-K.; Huang, ff.-H.Anal.Chem.2011, 83, 9524.)。雖然目前已有將軟彈性電極材料集成于微流控芯片平臺上的研究(參見=Sameenoi, Y.;Mensack, Μ.M.; Boonsong, K.; Ewing, R.; Dungchai, ff.; Chailapakul, 0.; Cropek,D.Μ.; Henry, C.S.Analyst 2011，136，3177-3184.)，但至今尚未有基于 PDMS-金 /銀軟彈性細胞電化學(xué)傳感器集成在微流控芯片平臺上并進行細胞動態(tài)行為分析的報道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種集成軟彈性細胞電化學(xué)傳感器的微流控芯片及其制法和在細胞動態(tài)分析中的應(yīng)用
具體而言，本發(fā)明以PDMS為芯片材料和軟彈性電化學(xué)傳感器基底材料，提供了一種集成軟彈性細胞電化學(xué)傳感器的微流控芯片及其在細胞動態(tài)分析中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種集成軟彈性細胞電化學(xué)傳感器的微流控芯片，如圖1所示，它由三層PDMS薄片組成:具有集成有微流管道和細胞培養(yǎng)微腔的PDMS中間層；具有金膜工作電極的PDMS底層和具有金膜輔助電極和銀參比電極的PDMS上層，集成有微流管道和細胞培養(yǎng)微腔的PDMS中間層有如下結(jié)構(gòu):它是一片厚1±0.1mm的PDMS薄片，PDMS薄片上有一條液體引入流路凹槽1，在液體引入流路凹槽的上游端有一個穿透PDMS薄片的、由硅橡膠材料制作的、與液體引入流路凹槽連通的圓形小管2，圓形小管用于試劑或細胞的輸入，在液體引入流路凹槽I的下游末端連接一個圓形細胞培養(yǎng)微腔凹槽3，細胞培養(yǎng)微腔凹槽3的下游連接一條液體導(dǎo)出流路凹槽4，在液體導(dǎo)出流路凹槽4的上游端距細胞培養(yǎng)微腔凹槽3邊緣1±0.5mm處有一個圓形通孔5，圓形通孔用于芯片內(nèi)流體與上層的輔助電極和參比電極接觸，液體導(dǎo)出流路凹槽4的下游端連接圓形通孔液體出口 6 ;具有金膜工作電極的PDMS底層是一片鍍有一條金膜7的PDMS薄片，金膜7的寬度應(yīng)大于圓形細胞培養(yǎng)微腔凹槽3的直徑，金膜的長度方向垂直于液體引入流路凹槽I的長度方向，PDMS中間層的集成有微流管道和細胞培養(yǎng)微腔的一面向下，與PDMS底層鍍有金膜7的一面封合，如此構(gòu)成液體引入流路、細胞培養(yǎng)微腔和液體導(dǎo)出流路；具有金膜輔助電極和銀參比電極的PDMS上層是一片鍍有金膜輔助電極8和銀參比電極9的PDMS薄片，金膜輔助電極8與銀參比電極9平行且相距0.5 ± 0.03mm,以保證兩者之間電絕緣又能同時與圓形通孔5下的芯片內(nèi)流體接觸，金膜輔助電極8與銀參比電極9的長度方向垂直于液體引入流路凹槽I的長度方向，三層PDMS薄片封合構(gòu)成集成軟彈性細胞電化學(xué)傳感器的微流控芯片。上述的微流控芯片，所述的液體引入流路凹槽I優(yōu)選的是長15±0.2mm、寬
0.3±0.05謹和深60±5μπι的凹槽。上述的微流控芯片，所述的圓形細胞培養(yǎng)微腔凹槽3優(yōu)選的是直徑為3±0.5mm和深60±5μπι的凹槽。上述的微流控芯片，所述的液體導(dǎo)出流路凹槽4優(yōu)選的是長10±0.2mm，寬
0.15±0.05謹和深60±5μπι的凹槽。上述的微流控芯片，所述的圓形通孔5優(yōu)選的是直徑為3±0.5mm的圓形小孔。上述的微流控芯片，所述的金膜工作電極7優(yōu)選的是長20±2mm、寬4±0.5mm的金膜；金膜輔助電極8優(yōu)選的是長20±2mm、寬2±0.2mm的金膜；銀膜參比電極9優(yōu)選的是長20 ± 2mm、寬 2 ± 0.2mm 的銀膜。一種制備上述的集成軟彈性細胞電化學(xué)傳感器的微流控芯片的方法，它包括下列步驟:
步驟1.如圖1a所示,在一片厚I±0.1mm的PDMS薄片上制作一條液體引入流路凹槽
1、圓形細胞培養(yǎng)微腔凹槽3、液體導(dǎo)出流路凹槽4和液體出口，在液體導(dǎo)出流路凹槽4的上游端距細胞培養(yǎng)微腔凹槽3邊緣1±0.5mm處開一個圓形通孔5，在液體導(dǎo)出流路凹槽4上游頂端插入連接一圓形小管2，圓形小管2與液體導(dǎo)出流路凹槽4連通，制得集成有微流管道和細胞培養(yǎng)微腔的PDMS中間層，備用；
步驟2.如圖1b所示，在一片PDMS薄片上通過化學(xué)沉積方法制作一條金膜條帶為金膜工作電極7，金膜的寬度不小于圓形細胞培養(yǎng)微腔凹槽3的直徑，金膜工作電極7的長度方向垂直于PDMS薄片的長度方向，制得具有金膜工作電極的PDMS底層，備用；
步驟3.如圖1c所示，在一片PDMS薄片上通過化學(xué)沉積方法制作一條金膜條帶為金膜輔助電極8和用銀膠制作一條銀膜條帶為銀膜參比電極9，金膜輔助電極8和銀膜參比電極9互相平行，相距0.5±0.03mm,以保證兩者之間電絕緣又能同時兩電極部分被圓形通孔5覆蓋，制得具有金膜輔助電極和銀參比電極的PDMS上層，備用；
步驟4.首先將步驟2制得的具有金膜工作電極的PDMS底層和步驟I制得的具有集成有微流管道和細胞培養(yǎng)微腔的PDMS中間層通過氧等離子體清洗器處理I min后將兩芯片不可逆封合，封合時將細胞培養(yǎng)微腔凹槽3處于金膜工作電極7的正上方，并形成液體弓I入流路、細胞培養(yǎng)微腔和液體導(dǎo)出流路，然后通過超薄防水雙面膠將步驟3制得的具有金膜輔助電極和銀參比電極的PDMS上層與集成有微流管道和細胞培養(yǎng)微腔的PDMS中間層封合，PDMS上層的金膜輔助電極8和銀膜參比電極9與PDMS中間層的圓形通孔5對正，使圓形通孔5部分覆蓋金膜輔助電極8和銀膜參比電極9，即制得所述的集成軟彈性細胞電化學(xué)傳感器的微流控芯片。本發(fā)明的PDMS-金膜工作電極通過掃描電化學(xué)顯微鏡表征,表明PDMS-金膜表面由金顆粒致密地排布而成，均勻的膜表面為的電化學(xué)分析提供了良好的電極表面環(huán)境(見圖 2A)。本發(fā)明的微流控芯片通過在0.5 M H2SO4溶液中的循環(huán)伏安行為表征，表明該PDMS-金膜電極具有與傳統(tǒng)金電極一致的電化學(xué)行為特征(見圖2B)。本發(fā)明的微流控芯片通過在鐵氰化鉀混合溶液中不同掃速下的循環(huán)伏安行為表征，表明該體系當中電子傳遞是一個受擴散控制的過程，與傳統(tǒng)三電極體系一致(見圖2C和D)。本發(fā)明的微流控芯片對受測試的細胞行為可以通過電化學(xué)的示差脈沖伏安法進行檢測。本發(fā)明的微流控芯片可以對受測細胞通過電化學(xué)信號和光學(xué)觀察對細胞增殖和凋亡過程進行監(jiān)測。本發(fā)明的微流控芯片對受測細胞通過電化學(xué)信號和光學(xué)觀察對細胞增殖和凋亡過程進行監(jiān)測的步驟如下:
步驟1.將I X IO5 X IO6 cells mr1細胞懸液通過集成軟彈性細胞電化學(xué)傳感器的輸入試劑或細胞的圓形小管2利用重力作用引入到細胞培養(yǎng)微腔內(nèi)；
步驟2.通過平衡出入口液面高度使液流保持靜止6 h，讓細胞貼壁生長；
步驟3.將0.01 M，pH 7.4的PBS (用氮氣除氧30min)引入培養(yǎng)微腔對細胞進行沖洗后，在形同PBS溶液中進行細胞增殖電化學(xué)測試，并通過光學(xué)顯微鏡對細胞形態(tài)進行觀察并用CCD拍攝；
步驟4.電化學(xué)測試完成后， 將培養(yǎng)基引入細胞培養(yǎng)微腔，在不同細胞培養(yǎng)時間點(6 -48 h)按步驟3對細胞增殖行為過程進行電化學(xué)監(jiān)測和光學(xué)拍攝；
步驟5.在步驟4完成細胞增殖檢測后，將含有5(Γ150 μΜ抗腫瘤藥物依托泊苷的培養(yǎng)基引入細胞培養(yǎng)微腔，在不同細胞培養(yǎng)時間點(4 48 h)按步驟3對細胞凋亡行為過程進行電化學(xué)監(jiān)測和光學(xué)拍攝。采用本發(fā)明的微流控芯片對受測細胞通過電化學(xué)信號和光學(xué)觀察對細胞增殖和凋亡過程進行監(jiān)測的結(jié)果表明本發(fā)明的微流控芯片可以靈敏監(jiān)測細胞增殖和凋亡過程。


圖1為本發(fā)明的微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖，圖1a為集成有微流管道和細胞培養(yǎng)微腔的PDMS中間層；圖1b為具有金膜工作電極的PDMS下層；圖1c為具有金膜輔助電極和銀參比電極的PDMS上層，其中:1為液體引入流路凹槽；2為圓形小管；3為細胞培養(yǎng)微腔凹槽；4為液體導(dǎo)出流路凹槽；5為圓形通孔；6為液體出口 ；7為金膜工作電極；8為金膜輔助電極；9為銀膜參比電極。圖2為本發(fā)明微流控芯片的表征圖。PDMS-金膜的SEM圖(圖A) ；PDMS-金膜在
0.5 M H2SO4溶液中的循環(huán)伏安行為(圖B);微流控芯片電化學(xué)傳感器在鐵氰化鉀混合溶液中不同掃速下的循環(huán)伏安行為(圖C);掃速與氧化還原峰電流的相互關(guān)系(圖D)，其中a，b分別為陽極峰電流和陰極峰電流變化與掃速的關(guān)系。圖3為本發(fā)明對細胞增殖過程中細胞行為電化學(xué)和光學(xué)監(jiān)測。圖3A-C分別為PDMS-金膜電極表面細胞在培養(yǎng)6，12，24小時過程中的形態(tài)，圖3D為在細胞增殖各時間點細胞的電化學(xué)響應(yīng)。圖4為本發(fā)明對細胞凋亡過程中細胞行為電化學(xué)和光學(xué)監(jiān)測。細胞在凋亡過程中的電化學(xué)信號變化(圖4A和B)，細胞在凋亡過程中的形態(tài)變化(圖4C-F)。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖所示實施例進一步說明本發(fā)明的具體內(nèi)容:
實施例1.微流控芯片制備
本微流控芯片平臺由三層PDMS組成，包括集成有微流管道和細胞培養(yǎng)微腔的PDMS中間層，具有金膜工作電極的PDMS底層和具有金膜輔助電極和銀參比電極的PDMS上層。集成有微流管道和細胞培養(yǎng)微腔的PDMS中間層是一片厚I ±0.1mm的PDMS薄片，其上有一條長15±0.2mm,寬0.3±0.05mm的液體引入流路凹槽1，在液體引入流路凹槽I的上游端有一個穿透PDMS薄片的、由硅橡膠材料制作的、與液體弓I入流路凹槽連通的內(nèi)徑為2 ±0.1mm的圓形小管2，圓形小管用于試劑或細胞的輸入，在液體引入流路凹槽I的下游末端連接一個直徑為3±0.5mm的圓形細胞培養(yǎng)微腔凹槽3，細胞培養(yǎng)微腔凹槽3的下游連接一條液體導(dǎo)出流路凹槽4，在液體導(dǎo)出流路凹槽4的上游端距細胞培養(yǎng)微腔凹槽3邊緣1±0.5mm處有一個直徑為3±0.5mm的圓形通孔5，圓形通孔用于芯片內(nèi)流體與上層的輔助電極和參比電極接觸，液體導(dǎo)出流路凹槽4的下游端連接圓形通孔液體出口 6 ;具有金膜工作電極的PDMS底層是一片鍍有一條長20±2mm,寬4±0.5 mm金膜7的PDMS薄片，金膜的長度方向垂直于液體引入流路凹槽I的長度方向，PDMS中間層的集成有微流管道和細胞培養(yǎng)微腔的一面向下，與PDMS底層鍍有金膜7的一面封合，如此構(gòu)成液體引入流路、細胞培養(yǎng)微腔和液體導(dǎo)出流路；具有金膜輔助電極和銀參比電極的PDMS上層是一片鍍有長20±2mm、寬2±0.2mm金膜輔助電極8和長20 ± 2mm、寬2 ± 0.2mm銀參比電極9的PDMS薄片，金膜輔助電極8與銀參比電極9平行且相距0.5±0.03mm,以保證兩者之間電絕緣又能同時與圓形通孔5下的芯片內(nèi)流體接觸，金膜輔助電極8與銀參比電極9的長度方向垂直于液體引入流路凹槽I的長度方向，三層PDMS薄片封合構(gòu)成集成軟彈性細胞電化學(xué)傳感器的微流控芯片。上述的PDMS-金膜的制備方法如下:將PDMS單體與固化劑以1: 0.1的比列混合在90°C條件下固化20分鐘即可得基片與蓋片?；瘜W(xué)鍍金溶液:0.01 g ml/1 HAuCl4, 200 gL-1KHCO3, and 2% (w/v)葡萄糖(v/v，2:1:1)。另外準備兩塊PDMS作為框架，其中一塊其上有4±0.5 * 20±2 mm2的面積為空洞，另一塊其上有2 ±2* 20±2 mm2的面積為空洞，這兩塊框架被兩片相同的PDMS膜夾心在中間，其內(nèi)充滿鍍金溶液。將該三明治結(jié)構(gòu)放入370C的恒溫箱中3小時使金被充分還原。所有制得的PDMS-金膜條帶分別用于制備金膜工作電極和金膜輔助電極，金膜厚度300±20 nm。在距該金膜輔助電極邊界0.5±0.03mm處，均勻涂一層寬2±0.2mm，長20 ± 2mm銀膠作為參比電極。微流控芯片的封合:
首先將具有金膜工作電極的PDMS底層和集成有微流管道和細胞培養(yǎng)微腔的PDMS中間層通過氧等離子體清洗器處理I min后將兩芯片不可逆封合，細胞培養(yǎng)微腔處于金膜工作電極正上方。然后通過超薄防水雙面膠將具有金膜輔助電極和銀參比電極的PDMS上層與集成有微流管道和細胞培養(yǎng)微腔的PDMS中間層封合，上層PDMS芯片上的金膜和銀工作電極與中間層小孔正對。實施例3.集成軟彈性電化學(xué)細胞傳感器的微流控芯片的表征
對所形成的PDMS-金膜進行掃描電化學(xué)顯微鏡表征,表明PDMS-金膜表面由金顆粒致密地排布而成，均勻的膜表面為的電化學(xué)分析提供了良好的電極表面環(huán)境(見圖2 A)。將
0.5 M H2SO4引入微流控芯片中，進行循環(huán)伏安掃描，結(jié)果表明該電化學(xué)傳感器件具有和傳統(tǒng)金電極體系一致的電化學(xué)行為特 征(見圖2B)。將鐵氰化鉀混合溶液引入芯片體系，在不同掃速下記錄該體系循環(huán)伏安行為(見圖2C)并通過圖2C得到掃速與氧化還原峰電流的相互關(guān)系(見圖2D)。結(jié)果表明，在該體系內(nèi)的電子傳遞過程是受擴散控制的過程，與傳統(tǒng)三電極體系一致。實施例4.細胞增殖過程動態(tài)監(jiān)測表征
將I X IO5 X IO6 cells mL—1細胞懸液通過重力作用引入細胞培養(yǎng)腔，通過平衡出入口液面高度，使液流靜止，將芯片放入37 °C,5 % CO2孵育箱中，使細胞在金膜表明貼壁生長。在電化學(xué)監(jiān)測時，將0.01 M，pH 7.4的PBS (用氮氣除氧30 min)引入培養(yǎng)微腔對細胞進行沖洗后，在該PBS溶液中進行細胞增殖電化學(xué)測試，并通過光學(xué)顯微鏡對細胞形態(tài)進行觀察并用CCD拍攝。在不同細胞培養(yǎng)時間點(6 24 h)，對細胞增殖行為過程進行電化學(xué)監(jiān)測和光學(xué)拍攝。細胞在芯片上孵育6，12，24 h時的電化學(xué)行為和形態(tài)變化表征結(jié)果見圖3。實施例5.細胞凋亡過程動態(tài)監(jiān)測表征
在對細胞增殖過程進行監(jiān)測后，將含有5(Γ150 μΜ抗腫瘤藥物依托泊苷的培養(yǎng)基引入細胞培養(yǎng)微腔誘導(dǎo)細胞凋亡。在誘導(dǎo)不同細胞培養(yǎng)時間點(Γ36 h)對細胞凋亡行為過程進行電化學(xué)監(jiān)測和光學(xué)拍攝，測定條件同實施例4.表征結(jié)果見圖4。
權(quán)利要求
1.一種集成軟彈性細胞電化學(xué)傳感器的微流控芯片，其特征是:它由三層PDMS薄片組成:具有集成有微流管道和細胞培養(yǎng)微腔的PDMS中間層；具有金膜工作電極的PDMS底層和具有金膜輔助電極和銀參比電極的PDMS上層，集成有微流管道和細胞培養(yǎng)微腔的PDMS中間層有如下結(jié)構(gòu):它是一片厚1±0.1mm的PDMS薄片，PDMS薄片上有一條液體引入流路凹槽(I)，在液體弓I入流路凹槽的上游端有一個穿透PDMS薄片的、由硅橡膠材料制作的、與液體引入流路凹槽連通的圓形小管(2)，在液體引入流路凹槽(I)的下游末端連接一個圓形細胞培養(yǎng)微腔凹槽(3 )，細胞培養(yǎng)微腔凹槽(3 )的下游連接一條液體導(dǎo)出流路凹槽(4 )，在液體導(dǎo)出流路凹槽(4)的上游端距細胞培養(yǎng)微腔凹槽(3)邊緣1±0.5mm處有一個圓形通孔(5)，圓形通孔(5)用于芯片內(nèi)流體與上層的輔助電極和參比電極接觸，液體導(dǎo)出流路凹槽(4)的下游端連接圓形通孔液體出口 6 ;具有金膜工作電極的PDMS底層是一片鍍有一條金膜(7 )的PDMS薄片，金膜(7 )的寬度大于圓形細胞培養(yǎng)微腔凹槽(3 )的直徑，金膜的長度方向垂直于液體引入流路凹槽(I)的長度方向，PDMS中間層的集成有微流管道和細胞培養(yǎng)微腔的一面向下，與PDMS底層鍍有金膜(7)的一面封合，如此構(gòu)成液體引入流路、細胞培養(yǎng)微腔和液體導(dǎo)出流路；具有金膜輔助電極和銀參比電極的PDMS上層是一片鍍有金膜輔助電極(8)和銀膜參比電極(9)的PDMS薄片，金膜輔助電極(8)與銀參比電極(9)平行且相距0.5±0.03mm,以保證兩者之間電絕緣又能同時與圓形通孔(5)下的芯片內(nèi)流體接觸，金膜輔助電極(8)與銀參比電極(9)的長度方向垂直于液體引入流路凹槽(I)的長度方向，三層PDMS薄片封合構(gòu)成集成軟彈性細胞電化學(xué)傳感器的微流控芯片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征是:所述的液體引入流路凹槽(I)是長15±0.2臟、寬0.3±0.05臟和深60±5μπι的凹槽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征是:所述的圓形細胞培養(yǎng)微腔凹槽(3)是直徑為3±0.5mm和深60±5μπι的凹槽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征是:所述的液體導(dǎo)出流路凹槽(4)是長10±0.2臟，寬0.15±0.05臟和 深60±5μπι的凹槽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征是:所述的圓形通孔(5)是直徑為3±0.5mm的圓形小孔。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征是:所述的金膜工作電極(7)是長20±2_、寬4±0.5mm的金膜；金膜輔助電極(8)是長20±2_、寬2±0.2mm的金膜；銀膜參比電極(9)是長20±2mm、寬2±0.2mm的銀膜。
7.一種制備權(quán)利要求所述的集成軟彈性細胞電化學(xué)傳感器的微流控芯片的方法，其特征是包括下列步驟: 步驟1.在一片厚1±0.1mm的PDMS薄片上制作一條液體引入流路凹槽(I )、圓形細胞培養(yǎng)微腔凹槽(3 )、液體導(dǎo)出流路凹槽(4)和圓形通孔液體出口( 6 )，在液體導(dǎo)出流路凹槽(4)的上游端距細胞培養(yǎng)微腔凹槽(3)邊緣1±0.5mm處開一個圓形通孔(5)，在液體導(dǎo)出流路凹槽(4)上游頂端插入連接一圓形小管(2)，圓形小管(2)與液體導(dǎo)出流路凹槽(4)連通，制得集成有微流管道和細胞培養(yǎng)微腔的PDMS中間層，備用； 步驟2.在一片PDMS薄片上通過化學(xué)沉積方法制作一條金膜條帶為金膜工作電極(7)，金膜的寬度不小于圓形細胞培養(yǎng)微腔凹槽(3)的直徑，金膜工作電極(7)的長度方向垂直于PDMS薄片的長度方向，制得具有金膜工作電極的PDMS底層，備用；步驟3.在一片PDMS薄片上通過化學(xué)沉積方法制作一條金膜條帶為金膜輔助電極(8)和用銀膠制作一條銀膜條帶為銀膜參比電極(9)，金膜輔助電極(8)和銀膜參比電極(9)互相平行，相距0.5±0.03mm,以保證兩者之間電絕緣又能同時兩電極部分被圓形通孔5覆蓋，制得具有金膜輔助電極和銀參比電極的PDMS上層，備用； 步驟4.首先將步驟2制得的具有金膜工作電極的PDMS底層和步驟I制得的具有集成有微流管道和細胞培養(yǎng)微腔的PDMS中間層通過氧等離子體清洗器處理I min后將兩芯片不可逆封合，封合時將細胞培養(yǎng)微腔凹槽(3)處于金膜工作電極(7)的正上方，并形成液體引入流路、細胞培養(yǎng)微腔和液體導(dǎo)出流路，然后通過超薄防水雙面膠將步驟3制得的具有金膜輔助電極和銀參比電極的PDMS上層與集成有微流管道和細胞培養(yǎng)微腔的PDMS中間層封合，PDMS上層的金膜輔助電極(8)和銀膜參比電極(9)與PDMS中間層的圓形通孔(5)對正，使圓形通孔(5)部分覆蓋金膜輔助電極(8)和銀膜參比電極(9)，即制得所述的集成軟彈性細胞電化學(xué)傳感器的微流控芯片。
8.權(quán)利要求1所述的微流控芯片在對受測細胞通過電化學(xué)信號和光學(xué)觀察，監(jiān)測其增殖和凋亡過程中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述的微流控芯片對受測細胞通過電化學(xué)信號和光學(xué)觀察對細胞增殖和凋亡過程進行監(jiān)測的的方法，其特征是包括如下步驟: 步驟1.將I X IO5 X IO6 cells mr1細胞懸液通過集成軟彈性細胞電化學(xué)傳感器的輸入試劑或細胞的圓形小管2利用重力作用引入到細胞培養(yǎng)微腔內(nèi)； 步驟2.通過平衡出入口液面高度使液流保持靜止6 h，讓細胞貼壁生長； 步驟3.將0.01 Μ,ρΗ 7.4的PBS (用氮氣除氧`30min)引入培養(yǎng)微腔對細胞進行沖洗后，在形同PBS溶液中進行細胞增殖電化學(xué)測試，并通過光學(xué)顯微鏡對細胞形態(tài)進行觀察并用CCD拍攝； 步驟4.電化學(xué)測試完成后，將培養(yǎng)基引入細胞培養(yǎng)微腔，在不同細胞培養(yǎng)時間點(6 48 h)按步驟3對細胞增殖行為過程進行電化學(xué)監(jiān)測和光學(xué)拍攝； 步驟5.在步驟4完成細胞增殖檢測后，將含有5(Γ150 μΜ抗腫瘤藥物依托泊苷的培養(yǎng)基引入細胞培養(yǎng)微腔，在不同細胞培養(yǎng)時間點(4 48 h)按步驟3對細胞凋亡行為過程進行電化學(xué)監(jiān)測和光學(xué)拍攝。
全文摘要
一種集成軟彈性細胞電化學(xué)傳感器的微流控芯片，它由三層PDMS薄片組成具有集成有微流管道和細胞培養(yǎng)微腔的PDMS中間層；具有金膜工作電極的PDMS底層和具有金膜輔助電極和銀參比電極的PDMS上層，PDMS中間層上有液體引入流路凹槽1，在液體引入流路凹槽1的末端連接一個圓形細胞培養(yǎng)微腔凹槽3，微腔凹槽3的下游有液體導(dǎo)出流路凹槽4，在導(dǎo)出流路凹槽4的上游端靠近微腔凹槽3邊緣有圓形通孔5，圓形通孔用于芯片內(nèi)流體與上層的輔助電極和參比電極接觸，PDMS中間層與PDMS底層鍍有金膜7的一面封合，如此構(gòu)成液體引入流路、細胞培養(yǎng)微腔和液體導(dǎo)出流路，三層PDMS封合構(gòu)成集成軟彈性細胞電化學(xué)傳感器的微流控芯片。本發(fā)明公開了其制法。
文檔編號G01N27/26GK103084230SQ20131006050
公開日2013年5月8日 申請日期2013年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月26日
發(fā)明者朱俊杰, 曹俊濤, 冉那 申請人:南京大學(xué)