專利名稱：尿液中八種一羥基多環(huán)芳烴的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于多環(huán)芳烴在尿液中的生物標志物理化檢驗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及尿液中八種一羥基多環(huán)芳烴的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法。
背景技術(shù)：
多環(huán)芳烴是一類廣泛分布于空氣、食品和水甚至某些生物體等環(huán)境介質(zhì)的可致癌化合物，因此各種特定環(huán)境中的多環(huán)芳烴含量一直受到政府的重視。在日常生活中，人們通過呼吸、飲食、飲水和吸煙甚至皮膚暴露均有可能不同程度地接觸多環(huán)芳烴，由于人是不斷在各種特定環(huán)境之間移動的，因此很難用特定環(huán)境中多環(huán)芳烴暴露量加和的方法來評估人體對多環(huán)芳烴的暴露情況，所以近年來人體對多環(huán)芳烴暴露的生物標志物研究一直是國內(nèi)外的研究熱點。例如我國在1996就頒布了高效液相色譜法測定生物尿中1-羥基芘的國家標準，目前國內(nèi)所報道的多環(huán)芳烴暴露的生物標志物檢測方法主要包括高效液相色譜一熒光檢測器法、同步熒光檢測法、酶聯(lián)免疫吸收法和高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法等，檢測的生物標志物主要是尿液中的1-羥基芘，由于尿液中各種化合物多基質(zhì)比較復(fù)雜，所以使用各種前處理技術(shù)與高效液相色譜法聯(lián)用進行檢測時，不可避免的受到明顯的基質(zhì)效應(yīng)。因為人體各種代謝酶的多樣性以及個人飲食的差異性等，有時這種基質(zhì)效應(yīng)表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應(yīng)，有時表現(xiàn)為基質(zhì)減衰效應(yīng)，因而造成檢測結(jié)果的偏差，同時這些檢測方法在檢測低暴露或非職業(yè)暴露人群時，由于尿液基質(zhì)干擾大，檢測限過高，常常出現(xiàn)測定結(jié)果不理想的情況。另外，高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法等由于所涉及儀器昂貴，檢測成本高。PAHs是一類2個或2個以上苯環(huán)連接的碳氫化合物的總稱，其具體組成非常復(fù)雜。大量研究證明，雖然在許多情況下尿樣中的化合物與DNA不會有關(guān)聯(lián)，但許多代謝產(chǎn)物確實能夠反映個體內(nèi)致癌物的活性程度和人體的解毒能力情況。由于尿樣易獲得，可以有效反映PAHs多途徑的暴露情況，一直成為研究熱點。PAHs暴露在人體尿液中的代謝物狀態(tài)、濃度與細胞和組織代謝過程相關(guān)，反映了單個或多個器官系統(tǒng)的代謝情況，因此PAHs暴露生物標志物是評估多環(huán)芳烴影響人體健康的重要依據(jù)，深入研究PAHs暴露生物標志物有助于我們更好的了解人體對PAHs的暴露濃度和代謝情況，促進人們更具體的了解個體對多環(huán)芳烴暴露情況與健康的關(guān)系。大量研究證明，多環(huán)芳烴的代謝途徑主要包括I相代謝和II相代謝，在I相代謝中多環(huán)芳烴被細胞微粒體中的P450混合功能氧化組酶氧化為活性的環(huán)氧化物中間體，然后被水解衍生化為一羥基多環(huán)芳烴，一羥基多環(huán)芳烴可以再次被P450組酶環(huán)氧化然后水解生成更多結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的一羥基多環(huán)芳烴，在II相代謝中，一羥基多環(huán)芳烴被葡糖苷酸酶和磺基轉(zhuǎn)移酶分別轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的葡糖苷酸和磺酸酯，然后排出體外。目前，測定尿液中一羥基多環(huán)芳烴的檢測方法中應(yīng)用最多的是高效液相色譜一熒光檢測器法，其中主要是對尿液中的1-羥基芘進行檢測，一般是用β —葡糖苷酸酶、芳基磺酸酯酶、酸性水溶液、堿堿性水溶液等中的一種或兩種對尿液中1-羥基芘葡糖苷酸和1-羥基芘磺酸酯進行酶解或水解后，用反相預(yù)柱富集，再用高效液相色譜一熒光檢測器檢測。雖然使用反相預(yù)柱可以對1-羥基芘等進行富集，但由于這一前處理方法固有的一些特點決定了一些極性與甲醇相近的物質(zhì)與待測組分同時被洗脫，而1-羥基芘的極性比較小，所以也富集了相當一部分檢測不需要且極性較大的物質(zhì)，造成比較嚴重的基質(zhì)效應(yīng)。因而各種前處理技術(shù)與高效液相色譜聯(lián)用的檢測方法的檢測限比較高，對部分低含量樣本無法定性或定量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有方法存在的樣品前處理繁瑣、檢測限較高、靈敏度較低、檢測成本較高等技術(shù)的不足，提供一種尿液中多環(huán)芳烴暴露的生物標志物氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，為評估個體對多環(huán)芳烴暴露情況提供一種科學的判定方法，該方法具有檢測限低、穩(wěn)定性好、前處理簡單、快速準確等優(yōu)點，適用于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測尿液中多環(huán)芳烴暴露的生物標志物。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)。一種煙草料液中4-甲基咪唑的分析檢測方法，包括以下步驟:①配制8種一羥基多環(huán)芳烴標準品單標溶液，再配制含有一羥基多環(huán)芳烴和氘代一羥基多環(huán)芳烴的8個混合標準溶液，然后通過三甲硅基衍生化反應(yīng)，將混合標準溶液中的一羥基多環(huán)芳烴和氘代一羥基多環(huán)芳烴分別轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的三甲硅氧基多環(huán)芳烴，立即對8個衍生化以后的混合標準溶液進行GC-MS分析，分別建立對應(yīng)三甲硅氧基菲的標準溶液工作曲線、1-三甲硅氧基芘的標準溶液工作曲線和對應(yīng)三甲硅氧基苯并[a]芘的標準溶液工作曲線；②將在室溫下解凍后的尿液樣品搖勻，準確移取尿樣于試管中，并分別加入2-羥基菲-d9、1-羥基芘-d9和3-羥基苯并[a]芘-dll三個氘代化合物溶液，再加入醋酸鈉緩沖液和β -葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶原酶，充分混勻后置入微波輔助萃取儀37°C恒溫酶解。用正己烷對酶解后的尿樣進行萃取，合并有機相，加入沸點較高的正十二烷，無水干燥后過濾，在氮氣氛圍中濃縮至近干，加入30 μ L甲苯并震蕩，用微量注射器轉(zhuǎn)移至氣相色譜瓶中，加入N，O-雙三甲硅基乙酰胺溶液，搖勻，靜置，上GC-MS檢測。所述的尿液中八種一羥基多環(huán)芳烴的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，其中分析檢測尿樣中1-羥基菲，2-羥基菲，3-羥基菲，4-羥基菲，9-羥基菲，1-羥基花，3-羥基苯并[a]芘和7-羥基苯并[a]芘時進行三甲硅基衍生化，并使用2-羥基菲-d9、1-羥基芘_d9和3-羥基苯并[a]芘-dll三個氘代化合物作為內(nèi)標。所述的尿液中八種一羥基多環(huán)芳烴的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，其中使用微波輔助萃取儀在37°C對尿樣進行恒溫酶解。
具體實施例方式以下結(jié)合應(yīng)用實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不限定本發(fā)明的保護范圍。除非另有說明，本發(fā)明中所采用的百分數(shù)均為重量百分數(shù)。實施例1:
一種尿液中一羥基多環(huán)芳烴的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，包括以下步驟:1、化學試劑1-羥基菲，2-羥基菲，3-羥基菲，4-羥基菲，9-羥基菲，1-羥基芘，3_羥基苯并[a]芘，7-羥基苯并[a]芘，2-羥基菲-d9，1-羥基芘-d9，3-羥基苯并[a]芘_dll，含量25%的N, O-雙三甲硅基乙酰胺的乙腈溶液。2、標準曲線建立8種一羥基多環(huán)芳烴標準溶液:以乙腈為溶劑，分別配制濃度為Iyg / mL的1-羥基菲、2-羥基菲、3-羥基菲、4-羥基菲、9-羥基菲、1-羥基芘、3-羥基苯并[a]芘和7-羥基苯并[a]芘共8種一羥基多環(huán)芳烴標準品單標溶液，保留四位有效數(shù)字；以同樣方式以乙腈為溶劑分別配制濃度為lug / mL的2-羥基菲-d9、l-羥基芘-d9和3-羥基苯并[a]芘-dll共3種氘代一羥基多環(huán)芳烴的單標溶液；以乙腈為溶劑，按表I配制含有一羥基多環(huán)芳烴和氘代一羥基多環(huán)芳烴的8個混合標準溶液；分別取0.5mL 8個混合標準溶液于8個GC-MS色譜瓶中，按照表2分別加入25%的N，O-雙三甲硅基乙酰胺溶液，搖勻，50°C靜置20分鐘待其進行三甲硅基衍生化反應(yīng)；然后立即對8個衍生化以后的混合標準溶液進行GC-MS分析，分別以1-三甲硅氧基菲、2-三甲硅氧基菲、3-三甲硅氧基菲、4-三甲硅氧基菲、9_ 二甲娃氧基菲對2_ 二甲娃氧基菲-d9的濃度之比為橫坐標，以1- 二甲娃氧基菲、
2-二甲娃氧基菲、3- 二甲娃氧基菲、4- 二甲娃氧基菲、9- 二甲娃氧基菲對2- 二甲娃氧基菲-d9的對應(yīng)定量離子對峰面積之比為縱坐標，建立對應(yīng)三甲硅氧基菲的標準溶液工作曲線；以1-三甲硅氧基芘對1-三甲硅氧基芘-d9的濃度之比為橫坐標，以1-三甲硅氧基芘對1-三甲硅氧基芘-d9的對應(yīng)定量離子對峰面積之比為縱坐標，建立1-三甲硅氧基芘的標準溶液工作曲線；分別以3-三甲硅氧基苯并[a]芘和7-三甲硅氧基苯并[a]芘對3_三甲硅氧基苯并[a]芘-dll的濃度之比為橫坐標，以3-三甲硅氧基苯并[a]芘和7_三甲硅氧基苯并[a]芘對3-三甲硅氧基苯并[a]芘-dll的對應(yīng)定量離子對峰面積之比建立對應(yīng)三甲硅氧基苯并[a]芘的標準溶液工作曲線。表I 一羥基多環(huán)芳烴和氘代一羥基多環(huán)芳烴的混合標準溶液
權(quán)利要求
1.一種煙草料液中4-甲基咪唑的分析檢測方法，其特征在于該方法包括以下的步驟: ①配制8種一羥基多環(huán)芳烴標準品單標溶液，再配制含有一羥基多環(huán)芳烴和氘代一羥基多環(huán)芳烴的8個混合標準溶液，然后通過三甲硅基衍生化反應(yīng)，將混合標準溶液中的一羥基多環(huán)芳烴和氘代一羥基多環(huán)芳烴分別轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的三甲硅氧基多環(huán)芳烴，立即對8個衍生化以后的混合標準溶液進行GC-MS分析，分別建立對應(yīng)三甲硅氧基菲的標準溶液工作曲線、1-三甲硅氧基芘的標準溶液工作曲線和對應(yīng)三甲硅氧基苯并[a]芘的標準溶液工作曲線； ②將在室溫下解凍后的尿液樣品搖勻，準確移取尿樣于試管中，并分別加入2-羥基菲-d9、l-羥基芘-d9和3-羥基苯并[a]芘-dll三個氘代化合物溶液，再加入醋酸鈉緩沖液和β -葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶原酶，充分混勻后置入微波輔助萃取儀37°C恒溫酶解。用正己烷對酶解后的尿樣進行萃取，合并有機相，加入沸點較高的正十二烷，無水干燥后過濾，在氮氣氛圍中濃縮至近干，加入30 μ L甲苯并震蕩，用微量注射器轉(zhuǎn)移至氣相色譜瓶中，加入N，O-雙三甲硅基乙酰胺溶液，搖勻，靜置，上GC-MS檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿液中八種一羥基多環(huán)芳烴的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，其特征在于分析檢測尿樣中1-羥基菲，2-羥基菲，3-羥基菲，4-羥基菲，9-羥基菲，1-羥基芘，3-羥基苯并[a]芘和7-羥基苯并[a]芘時進行三甲硅基衍生化，并使用2_羥基菲-d9、l-羥基芘-d9和3-羥基苯并[a]芘-dll三個氘代化合物作為內(nèi)標。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿液中八種一羥基多環(huán)芳烴的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，其特征在于使用微波輔助萃取儀在37°C對尿樣進行恒溫酶解。
全文摘要
尿液中八種一羥基多環(huán)芳烴的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，包括(1)將混合標準溶液中的一羥基多環(huán)芳烴和氘代一羥基多環(huán)芳烴分別轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的三甲硅氧基多環(huán)芳烴，對8個衍生化以后的混合標準溶液進行GC-MS分析；(2)將在室溫下解凍后的尿液樣品搖勻、前處理、衍生化，進而檢測出尿樣中八種一羥基多環(huán)芳烴的含量。本發(fā)明適用于各種常見樣本的尿液中多環(huán)芳烴暴露的生物標志物檢測研究，可以同時檢測尿液中8種一羥基多環(huán)芳烴，具有檢測限低、穩(wěn)定性好、前處理簡單、快速準確的優(yōu)點。
文檔編號G01N30/02GK103175920SQ20131006617
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月1日
發(fā)明者蔣舉興, 段焰青, 夏建軍, 王文元, 楊麗萍, 劉亞 申請人:紅云紅河煙草(集團)有限責任公司