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      用于制備識(shí)別變性Bt蛋白的抗體的免疫原及其制備的抗體和應(yīng)用的制作方法

      文檔序號(hào):6203776閱讀:238來(lái)源:國(guó)知局
      專利名稱:用于制備識(shí)別變性Bt蛋白的抗體的免疫原及其制備的抗體和應(yīng)用的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一種用于制備識(shí)別變性Bt蛋白的抗體的免疫原及其制備的抗體和應(yīng)用。
      背景技術(shù)
      蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的殺蟲(chóng)晶體蛋白(又稱Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白或Bt蛋白)具有抗蟲(chóng)作用,因此其編碼基因(Bt基因)在轉(zhuǎn)基因棉花等作物上應(yīng)用廣泛。根據(jù)編碼基因序列的同源性和編碼蛋白的殺蟲(chóng)譜,Bt蛋白分為cry族和cryt族,每一族下又分為數(shù)量不等的亞類。目前在植物中表達(dá)的Bt基因有CrylAa基因、CrylAb基因、CrylAc基因、Cry2Aa基因、Cry3Bb基因和Cry9c等基因。中國(guó)市場(chǎng)上商業(yè)化的轉(zhuǎn)Bt基因作物中主要轉(zhuǎn)入了針對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)有毒性的CrylAc基因。用轉(zhuǎn)基因棉花籽粒生產(chǎn)棉籽油后,可以得到副產(chǎn)物棉籽餅,棉籽餅通常用作家禽或家畜的飼料。棉籽餅中,常常殘留有變性Bt蛋白,對(duì)家禽或家畜具有潛在的危害,從而可能對(duì)食用家禽或家畜的人類造成潛在的危害。應(yīng)用目前國(guó)內(nèi)外商業(yè)化的免疫檢測(cè)試劑盒或試紙條,基本檢測(cè)不到棉籽餅中的變性Bt蛋白,迫切需要能夠識(shí)別變性Bt蛋白的抗體以及方法。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的目的是提供一種用于制備識(shí)別變性Bt蛋白的抗體的免疫原及其制備的抗體和應(yīng)用。本發(fā)明提供了用于制備識(shí)別變性Bt蛋白的抗體的免疫原,是將含有變性Bt蛋白的溶液和佐劑混合并乳化得到的產(chǎn)物。所述含有變性Bt蛋白的溶液的制備方法可如下:用蛋白變性劑處理含有Bt蛋白的溶液,得到含有變性Bt蛋白的溶液。所述變性劑可為β-巰基乙醇和/或SDS (十二烷基橫酸納)。所述含有變性Bt蛋白的溶液的制備方法可如下:將含有Bt蛋白的溶液和溶液丙混合后進(jìn)行變性處理,得到含有變性Bt蛋白的溶液;所述含有Bt蛋白的溶液和所述溶液丙的體積配比為1:(1-10);所述溶液丙由溶質(zhì)和溶劑組成,所述溶劑為水,所述溶質(zhì)及其濃度如下:體積比為0.1-2%的β -巰基乙醇和0.1-10.0mg/1OOmL的SDS。所述變性處理可為在40-100°C水中水浴。所述變性處理可為在100°C沸水中水浴3-5分鐘。所述變性處理可為在-20°C冰箱反復(fù)凍融3次以上。所述變性處理可為調(diào)pH至3以下或調(diào)pH至10以上。所述調(diào)PH至3以下具體是通過(guò)加入硫酸水溶液的形式實(shí)現(xiàn)的。所述硫酸水溶液具體可為IM硫酸水溶液。所述調(diào)pH至10以上具體是通過(guò)加入氫氧化鈉水溶液的形式實(shí)現(xiàn)的。所述氫氧化鈉水溶液具體可為IM氫氧化鈉水溶液。
      所述含有變性Bt蛋白的溶液的制備方法可如下:將含有Bt蛋白的溶液進(jìn)行變性處理,得到含有變性Bt蛋白的溶液。所述變性處理可為在40-100°C沸水中水浴。所述變性處理可為在100°C沸水中水浴3-5分鐘。所述變性處理可為在-20°C冰箱反復(fù)凍融3次以上。所述變性處理可為調(diào)PH至3以下或調(diào)pH至10以上。所述調(diào)pH至3以下具體是通過(guò)加入硫酸水溶液的形式實(shí)現(xiàn)的。所述硫酸水溶液具體可為IM硫酸水溶液。所述調(diào)pH至10以上具體是通過(guò)加入氫氧化鈉水溶液的形式實(shí)現(xiàn)的。所述氫氧化鈉水溶液具體可為IM氫氧化鈉水溶液。所述Bt蛋白可以為蘇云金芽孢桿菌的伴孢晶體、原核表達(dá)的Bt蛋白、轉(zhuǎn)基因作物中提取純化的Bt蛋白或者商購(gòu)的Bt蛋白。以上任一所述含有Bt蛋白的溶液具體可為蛋白濃度為0.1-lmg/mL的Bt蛋白溶液??捎忙薛?.5、0.lmol/L的PB緩沖液調(diào)整蛋白濃度。所述Bt蛋白具體可采用如下方法制備:(I)將抗蟲(chóng)棉種 子去殼后進(jìn)行可溶性總蛋白的提取,得到溶液甲;(2)將所述溶液甲進(jìn)行60%飽和度的硫酸銨沉淀,離心收集沉淀;(3)溶解步驟(2)得到的沉淀并進(jìn)行透析,得到溶液乙;(4)將所述溶液乙進(jìn)行免疫親和層析,收集與抗Bt CrylAb/Ac蛋白的單克隆抗體特異結(jié)合的蛋白組分,即為Bt毒蛋白;所述抗Bt CrylAb/Ac蛋白的單克隆抗體為是由雜交瘤Bt2F9CGMCC N0.5162分泌產(chǎn)生的單克隆抗體。雜交瘤Bt2F9為穩(wěn)定分泌抗轉(zhuǎn)基因植物中Bt CrylAb/Ac蛋白抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株,已于2011年8月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào),中國(guó)科學(xué)院微生物研究所,郵編100101),保藏號(hào)為 CGMCC N0.5162。所述步驟(I)中,可采用ρΗΙΟ.5、0.0lM的CAPS緩沖液提取所述可溶性總蛋白。所述步驟(I)中,所述溶液甲的制備方法具體如下:將所述抗蟲(chóng)棉種子去殼并研磨成粉,然后用PH10.5、0.0lM的CAPS緩沖液提取(提取溫度具體可為4°C,提取時(shí)間具體可為4小時(shí);提取過(guò)程中可用磁力攪拌器攪拌,以增加提取效率),離心(離心條件具體可為:40C UOOOOrpm離心20分鐘)后避開(kāi)表層油脂取上部液體,即為所述溶液甲。所述步驟(2)中,所述“進(jìn)行60%飽和度的硫酸銨沉淀”的實(shí)現(xiàn)方法如下:在所述溶液甲中加入硫酸銨并使其達(dá)到60%飽和度,然后冰浴放置。所述冰浴放置的時(shí)間具體可為40分鐘。所述冰浴放置過(guò)程中可用磁力攪拌器攪拌。所述離心的參數(shù)具體可為:4°C、7000rpm離心20分鐘。所述步驟(3)中,可用去離子水溶解所述沉淀并用Tris水溶液調(diào)pH至10.5。所述Tris水溶液具體可為IM Tris水溶液。所述透析具體在PBS緩沖液中進(jìn)行。所述透析的條件具體可為:用PBS緩沖液4°C透析6小時(shí)(每?jī)蓚€(gè)小時(shí)更換新的PBS緩沖液)。所述步驟(4)中,所述免疫親和層析的步驟可如下:①將所述溶液乙上樣于連接有所述抗Bt CrylAb/Ac蛋白的單克隆抗體的免疫層析柱;②用清洗液清洗柱子,去除雜蛋白用洗脫液進(jìn)行洗脫,收集過(guò)柱后洗脫液,即為含有目的蛋白的溶液。所述免疫親和層析的填充料可為CNBr-activated Sepharose4B。所述清洗液具體可為pH2.5、0.0lM的Gly-HCl緩沖液。所述洗脫液具體可為含體積比為50%的乙二醇的pH2.5,0.0lM的Gly-HCl緩沖液。所述免疫親和層析過(guò)程中,具體可采用4轉(zhuǎn)/分的上樣流速、清洗流速和洗脫流速。所述步驟②中具體可用2倍上樣體積的清洗液清洗柱子。所述步驟③中具體可用3倍體積的洗脫液進(jìn)行洗脫。所述步驟③中具體可按Iml每管收集過(guò)柱后的洗脫液。所述方法中還可包括將所述過(guò)柱后洗脫液用Tris水溶液調(diào)pH至7.5的步驟。所述Tris水溶液具體可為IM Tris水溶液。所述方法中還可包括將所述過(guò)柱后洗脫液用Tris水溶液調(diào)pH至7.5然后進(jìn)行透析的步驟。所述Tris水溶液具體可為IM Tris水溶液。所述透析具體在PBS緩沖液中進(jìn)行。所述透析的條件具體可為:用PBS緩沖液4°C透析6小時(shí)(每?jī)蓚€(gè)小時(shí)更換新的PBS緩沖液)。 所述方法中還可包括 將所述過(guò)柱后洗脫液用Tris水溶液調(diào)pH至7.5,然后檢測(cè)其中是否含有Bt毒蛋白,最后將含有Bt毒蛋白的溶液進(jìn)行透析的步驟。所述Tris水溶液具體可為IM Tris水溶液。所述透析具體在PBS緩沖液中進(jìn)行。所述透析的條件具體可為:用PBS緩沖液4°C透析6小時(shí)(每?jī)蓚€(gè)小時(shí)更換新的PBS緩沖液)。所述“檢測(cè)其中是否含有Bt毒蛋白”的具體方法如下:( i )用抗Bt CrylAc蛋白的兔多克隆包被酶標(biāo)板;(幻在步驟(i)的酶標(biāo)板中加入調(diào)pH至7.5后的過(guò)柱后洗脫液,37°C溫育30min ;(iii)在步驟(ii)的酶標(biāo)板中加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗Bt CrylAc蛋白單克隆抗體,37°C溫育30min ;(iv)向步驟(iii)的酶標(biāo)板中加入底物緩沖液,室溫反應(yīng)15min后終止反應(yīng);(V)在 492nm 下測(cè)定 OD 值;(vi)將對(duì)照棉花品種的葉片于研缽中研磨,用PBS緩沖液于4°C提取12小時(shí),8000r/min4°C離心取上清,然后將上清進(jìn)行上述步驟(i )至(V );(Vii)如果步驟(V )得到的OD值是步驟(vi)得到的OD值的三倍以上,結(jié)果為陽(yáng)性。所述“檢測(cè)其中是否含有Bt毒蛋白”的具體方法如下:( i )將lmg/mL抗Bt CrylAc蛋白的兔多克隆抗體用500倍體積的包被緩沖液進(jìn)打稀釋后加入到酶標(biāo)板中,每孔100 μ L, 37 C溫育3小時(shí);(ii)在步驟(i )的酶標(biāo)板中加入調(diào)pH至7.5后的過(guò)柱后洗脫液,每孔100 μ L,37°C 溫育 30min ;(iii)將lmg/mL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗Bt CrylAc蛋白單克隆抗體用1000倍體積的PBS緩沖液進(jìn)行稀釋后加入步驟(ii )的酶標(biāo)板中,每孔100 μ L, 37°C溫育30min ;(iv)向步驟(iii)的酶標(biāo)板中加入底物緩沖液,每孔100 μ L,室溫反應(yīng)15min后每孔中加入50 μ L2.0M硫酸水溶液終止反應(yīng);(V )在 492nm 下測(cè)定 OD 值;(vi)將對(duì)照棉花品種的葉片于研缽中研磨,用PBS緩沖液于4°C提取12小時(shí),8000r/min4°C離心取上清,然后將上清進(jìn)行上述步驟(i )至(V );(Vii)如果步驟(V )得到的OD值是步驟(vi)得到的OD值的三倍以上,結(jié)果為陽(yáng)性。
      所述對(duì)照棉花品種為不含有Bt CrylAc蛋白的編碼基因的棉花品種,具體可為棉花品種石遠(yuǎn)321。所述抗蟲(chóng)棉可為轉(zhuǎn)Bt CrylAc蛋白的編碼基因的棉花,具體可為國(guó)欣棉6號(hào)。以上任一所述的Bt蛋白具體可為Bt CrylAc蛋白。以上任一所述的Bt CrylAc蛋白可為如下(a)或(b):(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì);(b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與就有殺蟲(chóng)晶體蛋白活性的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。以上任一所述Bt CrylAc蛋白的編碼基因可為如下I)或2)或3)的DNA分子:I)編碼區(qū)如序列表中序列2所示的DNA分子;2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼殺蟲(chóng)晶體蛋白的DNA分子;3)與I)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼殺蟲(chóng)晶體蛋白的DNA分子。所述佐劑可為弗氏佐劑,具體可為弗氏完全佐劑或弗式不完全佐劑。所述佐劑可為水性佐劑。所述含有變性Bt蛋白的溶液和所述佐劑具體可等體積混合。以上任一所述免疫原免疫動(dòng)物得到的多克隆抗體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述動(dòng)物為哺乳動(dòng)物,如兔子或小鼠。所述多克隆抗體可用作包被抗原和/或檢測(cè)用一抗,從而用于檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有變性Bt蛋白。所述待測(cè)樣本可為煮熟的轉(zhuǎn)基因作物,轉(zhuǎn)基因作物加工得到的食品或飼料等。本發(fā)明對(duì)轉(zhuǎn)基因糧食作物的生物安全性評(píng)價(jià)具有實(shí)用價(jià)值,潛在社會(huì)效益巨大。


      圖1為實(shí)施例1的純化過(guò)程中的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖2為實(shí)施例5的步驟2的照片。圖3為實(shí)施例5的步驟3和步驟4的照片。
      具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明,但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法,如無(wú)特殊說(shuō)明,均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料,如無(wú)特殊說(shuō)明,均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn),均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果取平均值。羊抗小鼠IgG-HRP:購(gòu)自Jackson公司,商品目錄號(hào)為79556)。弗氏完全佐劑:購(gòu)自Sigma公司,商品目錄號(hào)為F5881。弗氏不完全佐劑:購(gòu)自Sigma公司,商品目錄號(hào)為F5506。β-巰基乙醇:購(gòu)自Sigma公司,商品目錄號(hào)為Μ6250。十二烷基磺酸鈉(SDS)和鄰苯二胺(OPD)等其余常規(guī)試劑均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。
      雜交瘤Bt2F9為穩(wěn)定分泌抗轉(zhuǎn)基因植物中Bt CrylAb/Ac蛋白抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株,已于2011年8月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào),中國(guó)科學(xué)院微生物研究所,郵編100101),保藏號(hào)為 CGMCC N0.5162??笲t CrylAb/Ac蛋白的單克隆抗體的制備方法:將雜交瘤Bt2F9CGMCC N0.5162置于細(xì)胞培養(yǎng)基中,37°C培養(yǎng)2天,用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行純化,得到抗Bt CrylAb/Ac蛋白的單克隆抗體溶液,凍干_20°C保存。細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法:向DMEM培養(yǎng)基中添加小牛血清(購(gòu)自GIBC0BRL,產(chǎn)品目錄號(hào)為26170-043)和碳酸氫鈉,小牛血清的終濃度為20% (質(zhì)量百分含量),碳酸氫鈉的終濃度為0.2% (質(zhì)量百分含量),pH為7.4。商購(gòu)的Bt CrylAc蛋白:上海佑隆生物科技有限公司,產(chǎn)品目錄編號(hào)為C010301。棉花品種石遠(yuǎn)321:河北神農(nóng)高科技股份有限公司。國(guó)欣棉6號(hào)(轉(zhuǎn)Bt CrylAc蛋白的編碼基因的抗蟲(chóng)品種)的種子,購(gòu)自河北省河間市國(guó)欣農(nóng)研會(huì)。如無(wú)特殊說(shuō)明本實(shí)施例中所用的PBS緩沖均如下:PBS緩沖液的配方(pH7.5):溶劑為水,含有 0.02M Na2HP04、0.0015M KH2PO4 和 0.14M NaCl。實(shí)施例l、Bt CrylAc蛋白的制備1、可溶性總蛋白的提取將國(guó)欣棉6號(hào)的種子去殼并研磨成細(xì)粉,取IOg細(xì)粉,加入IOOml ρΗΙΟ.5、0.0IMCAPS緩沖液,使用磁力攪拌器4°C攪拌提取4小時(shí),然后4°C、IOOOOrpm離心20分鐘,避開(kāi)表層油脂取上部液體,該液體即為可溶性總蛋白提取液。2、硫酸銨沉淀向步驟I得到的可溶性總蛋白提取液中加入硫酸銨粉末,使其在提取液中的飽和度達(dá)到60%,在冰浴中使用磁力攪拌器攪拌40分鐘。3、沉淀的復(fù)溶和透析將完成步驟2的提取液4°C、7000rpm離心20分鐘,收集沉淀;向沉淀中加入2ml去離子水,用IM Tris水溶液調(diào)pH至10.5,小心地溶解沉淀,然后轉(zhuǎn)移至透析袋中,用2000mlPBS緩沖液4°C透析6小時(shí)(每?jī)蓚€(gè)小時(shí)更換新的PBS緩沖液)。4、免疫親和層析填料:CNBr-activatedSepharose4B (購(gòu)自 GE 公司,商品型號(hào)為 I7-(M3C)-OlX用于免疫親和層析的抗體:抗Bt CrylAb/Ac蛋白的單克隆抗體。平衡緩沖液:PBS緩沖液。清洗液:ρΗ2.5、0.0lM 的 Gly-HCl 緩沖液。洗脫液:含體積比為50%的乙二醇的pH2.5,0.0lM的Gly-HCl緩沖液。流速:平衡流速為20轉(zhuǎn)/分,上樣流速、清洗流速和洗脫流速均為4轉(zhuǎn)/分。免疫親和層析過(guò)程:(I)將填料和用于免疫親和層析的抗體按照填料附帶的使用說(shuō)明書(shū)制備好免疫親和層析柱,柱床體積為3.5ml ; (2)用5倍柱床體積的平衡緩沖液平衡柱子;(3)上樣步驟3得到的溶液;(4)用2倍上樣體積的清洗液洗滌柱子,以去除雜蛋白;
      (5)用3倍上樣體積的洗脫液進(jìn)行洗脫,按Iml每管收集過(guò)柱后的洗脫液。5、將每管過(guò)柱后洗脫液立即用IM Tris水溶液調(diào)pH至7.5。

      6、采用申請(qǐng)?zhí)枮椤?01210012498.4”的專利申請(qǐng)的實(shí)施例2的步驟一制備的試劑盒檢測(cè)每管步驟5得到的溶液,方法如下:(I)多克隆抗體的包被:將lmg/mL抗Bt CrylAc蛋白的兔多克隆抗體用包被緩沖液進(jìn)行稀釋,按照抗Bt CrylAc蛋白的兔多克隆抗體與包被緩沖液的體積比為1:500的比例稀釋后加入到酶標(biāo)板中,每孔ΙΟΟμ L,37°C溫育3小時(shí);倒去酶標(biāo)板中的溶液,用PBS緩沖液洗板4次,甩干。(2)在步驟(I)的酶標(biāo)板中加入步驟5得到的溶液,每孔100 μ L,對(duì)照孔加入100 μ L PBS緩沖液;37°C溫育30min ;倒掉酶標(biāo)板中的溶液,用PBS緩沖液洗板4次,甩干。(3)將lmg/mL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗Bt CrylAc蛋白單克隆抗體(即酶標(biāo)記抗體)用PBS緩沖液進(jìn)行稀釋,按照酶標(biāo)記抗體與PBS緩沖液的體積比為1:1000稀釋后,分別向上述步驟(2)的酶標(biāo)板中加入ΙΟΟμ L稀釋后的酶標(biāo)記抗體;37°C溫育30min ;倒掉酶標(biāo)板中的溶液,用PBS緩沖液洗板4次,甩干。(4)向步驟(3)的酶標(biāo)板中分別加入100 μ L底物緩沖液,室溫反應(yīng)15min后,再向每孔中加入50 μ L2.0M的硫酸水溶液終止反應(yīng)。(5)在 492nm 下測(cè)定 OD 值。(6)將棉花品種石遠(yuǎn)321的葉片于研缽中研磨,用PBS緩沖液于4°C提取12小時(shí),8000r/min4°C離心取上清,然后將上清進(jìn)行上述步驟(I)至(5)。(7)如果步驟(5)得到的OD值是步驟(6)得到的OD值的三倍以上,結(jié)果為陽(yáng)性。7、將步驟6中檢測(cè)為陽(yáng)性的管中的溶液合并,轉(zhuǎn)移至透析袋中,用2000ml PBS緩沖液4°C透析6小時(shí)(每?jī)蓚€(gè)小時(shí)更換新的PBS緩沖液)。純化過(guò)程中的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖見(jiàn)圖1。圖1中,泳道I對(duì)應(yīng)的樣本為溶液甲,泳道2對(duì)應(yīng)的樣本為步驟3中溶解沉淀得到的溶液,泳道3對(duì)應(yīng)的樣本為步驟7得到溶液,泳道4對(duì)應(yīng)的樣本為蛋白質(zhì)marker,泳道5對(duì)應(yīng)的為原核表達(dá)的Bt CrylAc蛋白。商購(gòu)的Bt CrylAc蛋白與泳道3的結(jié)果一致。

      回收泳道3中的目的條帶并進(jìn)行N端15個(gè)氨基酸殘基的測(cè)序,結(jié)果表明,該目的條帶確實(shí)為Bt CrylAb/Ac蛋白。實(shí)施例2、免疫原的制備一、免疫原的制備1、用pH7.5,0.lmol/L的PB緩沖液將實(shí)施例1制備的Bt CrylAc蛋白配制成蛋白濃度為lmg/mL的溶液A。ρΗ7.5、0.lmol/L 的 PB 緩沖液的制備方法:將 0.2g KH2PO4 和 2.96g Na2HPO4.12H20溶于蒸餾水中,用蒸餾水定容到1L。2、將溶液A和溶液B等體積混合,得到溶液C。溶液B的由溶質(zhì)和溶劑組成,溶劑為水,溶質(zhì)及其濃度為:2% (體積比)β -巰基乙醇和 10g/100mLSDS。3、將溶液C在100°C沸水中水浴3-5分鐘(使蛋白充分變性),冷卻至室溫后和弗氏完全佐劑等體積混合并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?直到滴入水中不擴(kuò)散),得到用于制備變性Bt CrylAc蛋白的抗體的基礎(chǔ)免疫原,簡(jiǎn)稱基礎(chǔ)免疫原I。4、將溶液C在100°C沸水中水浴3-5分鐘(使蛋白充分變性),冷卻至室溫后和弗氏不完全佐劑等體積混合并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?直到滴入水中不擴(kuò)散),得到用于制備變性Bt CrylAc蛋白的抗體的加強(qiáng)免疫原,簡(jiǎn)稱加強(qiáng)免疫原I。二、免疫原的制備1、用pH7.5,0.lmol/L的PB緩沖液將實(shí)施例1制備的Bt CrylAc蛋白配制成蛋白濃度為0.lmg/mL的溶液D。2、將溶液D和溶液B等體積混合,得到溶液E。3、將溶液E在100°C沸水中水浴3-5分鐘(使蛋白充分變性),冷卻至室溫后和弗氏完全佐劑等體積混合并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?直到滴入水中不擴(kuò)散),得到用于制備變性Bt CrylAc蛋白的抗體的基礎(chǔ)免疫原,簡(jiǎn)稱基礎(chǔ)免疫原II。4、將溶液E在100°C沸水中水浴3-5分鐘(使蛋白充分變性),冷卻至室溫后和弗氏不完全佐劑等體積混合并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?直到滴入水中不擴(kuò)散),得到用于制備變性Bt CrylAc蛋白的抗體的加強(qiáng)免疫原,簡(jiǎn)稱加強(qiáng)免疫原II。三、免疫原的制備1、將I體積份步驟一的I制備的溶液A和10體積份溶液F混合,得到溶液G。溶液F的由溶質(zhì)和溶劑組成,溶劑為水,溶質(zhì)及其濃度為:0.1% (體積比)β -巰基乙醇和 0.1g/1OOmL SDSo2、將溶液G在100°C沸水中水浴3-5分鐘(使蛋白充分變性),冷卻至室溫后和弗氏完全佐劑等體積混合并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?直到滴入水中不擴(kuò)散),得到用于制備變性Bt CrylAc蛋白的抗體的基礎(chǔ)免疫原,簡(jiǎn)稱基礎(chǔ)免疫原III。3、將溶液G在100°C沸水中水浴3-5分鐘(使蛋白充分變性),冷卻至室溫后和弗氏不完全佐劑等體積混合并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?直到滴入水中不擴(kuò)散),得到用于制備變性Bt CrylAc蛋白的抗體的加強(qiáng)免疫原,簡(jiǎn)稱加強(qiáng)免疫原III。四、免疫原的制備

      1、將I體積份步驟二的I制備的溶液D和10體積份溶液F混合,得到溶液H。2、將溶液H在100°C沸水中水浴3-5分鐘(使蛋白充分變性),冷卻至室溫后和弗氏完全佐劑等體積混合并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?直到滴入水中不擴(kuò)散),得到用于制備變性Bt CrylAc蛋白的抗體的基礎(chǔ)免疫原,簡(jiǎn)稱基礎(chǔ)免疫原IV。3、將溶液H在100°C沸水中水浴3-5分鐘(使蛋白充分變性),冷卻至室溫后和弗氏不完全佐劑等體積混合并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?直到滴入水中不擴(kuò)散),得到用于制備變性Bt CrylAc蛋白的抗體的加強(qiáng)免疫原,簡(jiǎn)稱加強(qiáng)免疫原IV。五、免疫原的制備1、用pH7.5、0.lmol/L的PB緩沖液將商購(gòu)的Bt CrylAc蛋白配制成蛋白濃度為lmg/mL的溶液。2、將步驟I得到的溶液在100°C沸水中水浴3-5分鐘(使蛋白充分變性),冷卻至室溫后和弗氏完全佐劑等體積混合并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?直到滴入水中不擴(kuò)散),得到用于制備變性Bt CrylAc蛋白的抗體的基礎(chǔ)免疫原,簡(jiǎn)稱基礎(chǔ)免疫原V。3、將步驟I得到的溶液在100°C沸水中水浴3-5分鐘(使蛋白充分變性),冷卻至室溫后和弗氏不完全佐劑等體積混合并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?直到滴入水中不擴(kuò)散),得到用于制備變性Bt CrylAc蛋白的抗體的加強(qiáng)免疫原,簡(jiǎn)稱加強(qiáng)免疫原V。六、免疫原的制備1、用pH7.5、0.lmol/L的PB緩沖液將商購(gòu)的Bt CrylAc蛋白配制成蛋白濃度為
      0.lmg/mL的溶液。2、將步驟I得到的溶液在100°C沸水中水浴3-5分鐘(使蛋白充分變性),冷卻至室溫后和弗氏完全佐劑等體積混合并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?直到滴入水中不擴(kuò)散),得到用于制備變性Bt CrylAc蛋白的抗體的基礎(chǔ)免疫原,簡(jiǎn)稱基礎(chǔ)免疫原VI。3、將步驟I得到的溶液在100°C沸水中水浴3-5分鐘(使蛋白充分變性),冷卻至室溫后和弗氏不完全佐劑等體積混合并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?直到滴入水中不擴(kuò)散),得到用于制備變性Bt CrylAc蛋白的抗體的加強(qiáng)免疫原,簡(jiǎn)稱加強(qiáng)免疫原VI。七、免疫原的制備1、將步驟五的I得到的溶液在-20°C冰箱中反復(fù)凍融3次(使蛋白充分變性),冷卻至室溫后和弗氏完全佐劑等體積混合并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?直到滴入水中不擴(kuò)散),得到用于制備變性Bt CrylAc蛋白的抗體的基礎(chǔ)免疫原,簡(jiǎn)稱基礎(chǔ)免疫原VII。2、將步驟五的I得到的溶液在_20°C冰箱中反復(fù)凍融3次(使蛋白充分變性),冷卻至室溫后和弗氏不完全佐劑等體積混合并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?直到滴入水中不擴(kuò)散),得到用于制備變性Bt CrylAc蛋白的抗體的加強(qiáng)免疫原,簡(jiǎn)稱加強(qiáng)免疫原VII。八、免疫原的制備1、將步驟六的I得到的溶液在_20°C冰箱中反復(fù)凍融3次(使蛋白充分變性),冷卻至室溫后和弗氏完全佐劑等體積混合并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?直到滴入水中不擴(kuò)散),得到用于制備變性Bt CrylAc蛋白的抗體的基礎(chǔ)免疫原,簡(jiǎn)稱基礎(chǔ)免疫原珊。2、將步驟六的I得到的溶液在_20°C冰箱中反復(fù)凍融3次(使蛋白充分變性),冷卻至室溫后和弗氏不完全佐劑等體積混合并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?直到滴入水中不擴(kuò)散),得到用于制備變性Bt CrylAc蛋白的抗體的加強(qiáng)免疫原,簡(jiǎn)稱加強(qiáng)免疫原珊。九、免疫原的制備1、將步驟五的I得到的溶液用IM硫酸水溶液調(diào)pH值至3 (使蛋白充分變性),冷卻至室溫后和弗氏完全佐劑等體積混合并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?直到滴入水中不擴(kuò)散),得到用于制備變性Bt CrylAc蛋白的抗體的基礎(chǔ)免疫原,簡(jiǎn)稱基礎(chǔ)免疫原IX。2、將步驟五的I得到的溶液用IM硫酸水溶液調(diào)pH值至3 (使蛋白充分變性),冷卻至室溫后和弗氏不完全佐劑等體積混合并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?直到滴入水中不擴(kuò)散),得到用于制備變性Bt CrylAc蛋白的抗體的加強(qiáng)免疫原,簡(jiǎn)稱加強(qiáng)免疫原IX。十、免疫原的制備1、將步驟六的I得到的溶液用IM硫酸水溶液調(diào)pH值至3 (使蛋白充分變性),冷卻至室溫后和弗氏完全佐劑等體積混合并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?直到滴入水中不擴(kuò)散),得到用于制備變性Bt CrylAc蛋白的抗體的基礎(chǔ)免疫原,簡(jiǎn)稱基礎(chǔ)免疫原X。2、將步驟六的I得到的溶液用IM硫酸水溶液調(diào)pH值至3 (使蛋白充分變性),冷卻至室溫后和弗氏不完全佐劑等體積混合并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?直到滴入水中不擴(kuò)散),得到用于制備變性Bt CrylAc蛋白的抗體的加強(qiáng)免疫原,簡(jiǎn)稱加強(qiáng)免疫原X。i^一、免疫原的制備1、將步驟五的I得到的溶液用IM氫氧化鈉水溶液調(diào)pH值至10 (使蛋白充分變性),冷卻至室溫后和弗氏完全佐劑等體積混合并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?直到滴入水中不擴(kuò)散),得到用于制 備變性Bt CrylAc蛋白的抗體的基礎(chǔ)免疫原,簡(jiǎn)稱基礎(chǔ)免疫原XI。2、將步驟五的I得到的溶液用IM氫氧化鈉水溶液調(diào)pH值至10 (使蛋白充分變性),冷卻至室溫后和弗氏不完全佐劑等體積混合并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?直到滴入水中不擴(kuò)散),得到用于制備變性Bt CrylAc蛋白的抗體的加強(qiáng)免疫原,簡(jiǎn)稱加強(qiáng)免疫原XI。十二、免疫原的制備1、將步驟六的I得到的溶液用IM氫氧化鈉水溶液調(diào)pH值至10 (使蛋白充分變性),冷卻至室溫后和弗氏完全佐劑等體積混合并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?直到滴入水中不擴(kuò)散),得到用于制備變性Bt CrylAc蛋白的抗體的基礎(chǔ)免疫原,簡(jiǎn)稱基礎(chǔ)免疫原ΧΠ。2、將步驟六的I得到的溶液用IM氫氧化鈉水溶液調(diào)pH值至10 (使蛋白充分變性),冷卻至室溫后和弗氏不完全佐劑等體積混合并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?直到滴入水中不擴(kuò)散),得到用于制備變性Bt CrylAc蛋白的抗體的加強(qiáng)免疫原,簡(jiǎn)稱加強(qiáng)免疫原ΧΠ。實(shí)施例3、變性Bt CrylAc蛋白的抗體的制備一、兔多克隆抗體的制備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為3月兔齡的新西蘭大耳白兔(購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),體重2kg以上。1、基礎(chǔ)免疫將基礎(chǔ)免疫原I采用后腳趾間隙注射實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,以Bt CrylAc蛋白計(jì),注射劑量為Img/ 只。2、加強(qiáng)免疫基礎(chǔ)免疫4周后,將加強(qiáng)免疫原I采用后腿股淋巴結(jié)、背部、頸部皮下多點(diǎn)注射實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,以Bt CrylAc蛋白計(jì),注射劑量為Img/只;之后每隔20天按照相同的方法進(jìn)行加強(qiáng)免疫一次;第五次加強(qiáng)免疫后第7天,頸動(dòng)脈采全血,分離血清,采用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行純化,得到兔多克隆抗體,-20°C保存。二、鼠多克隆抗體的制備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為8-10周齡的Bal b/C小白鼠(購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。1、基礎(chǔ)免疫將基礎(chǔ)免疫原II采用腹腔、背部皮下多點(diǎn)注射實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,以Bt CrylAc蛋白計(jì),注射劑量為0.1mg/只。2、加強(qiáng)免疫基礎(chǔ)免疫2周后,將加強(qiáng)免疫原II采用腹腔、背部皮下多點(diǎn)注射實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,以BtCrylAc蛋白計(jì),注射劑量為0.1mg/只;之后每隔10天按照相同的方法進(jìn)行加強(qiáng)免疫一次;從第三次加強(qiáng)免疫開(kāi)始,免疫后的第7天眼眶采血,測(cè)定抗體效價(jià),效價(jià)的定義為OD45tol值為I時(shí)的血清稀釋倍數(shù),待效價(jià)大于1:8000后,摘取眼球取血,分離血清,采用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行純化,得到鼠多克隆抗體,-20°C保存。實(shí)施例4、應(yīng)用多克隆抗體檢測(cè)變性Bt蛋白一、蛋白樣本的制備1、稱量Ig國(guó)欣6號(hào)棉花品種制備的棉籽餅,用研缽磨碎,加入蛋白提取液2mL,4°C、300rpm室溫振蕩提取I小時(shí),然后4°C靜置I小時(shí),取上清液,即為樣本-1。蛋白提取液由NaCl、KH2PO4, Na2HPO4.12H20、Tween-20 和水組成,NaCl 的濃度為8.0g/L, KH2PO4 的濃 度為 0.2g/L,Na2HPO4.12Η20 的濃度為 2.96g/L, Tween-20 的濃度為 0.1%(體積比)。2、用pH7.5,0.lmol/L的PB緩沖液、將實(shí)施例1制備的Bt CrylAc蛋白配制成蛋白濃度為lmg/mL的溶液,即為樣本-1I (陽(yáng)性對(duì)照)。3、將樣本-1I在100°C沸水中水浴3-5分鐘,即為樣本-1IK陽(yáng)性對(duì)照)。4、用pH7.5,0.lmol/L的PBS緩沖液將牛血清蛋白(購(gòu)置于Merck-Calbiochem,貨號(hào)12659)配制成蛋白濃度為lmg/mL的溶液,即為樣本_ IV (陰性對(duì)照)。5、pH7.5、0.lmol/L的PBS緩沖液,即為樣本_ V (空白對(duì)照)。二、各種緩沖液的配方包被緩沖液:ρΗ9.6、0.05Μ的碳酸鹽緩沖液。封閉液:將2mg市售脫脂奶粉溶于IOOmL pH7.5,0.1M的PBS緩沖液,得到封閉液。樣品稀釋液:將0.5ml吐溫20、0.5g明膠和500ml pH9.6、0.1M的PBS緩沖液混
      合,得到樣品稀釋液。檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH5.5):由檸檬酸三鈉、Na2HPO4和水組成,檸檬酸三鈉的濃度為0.01M, Na2HPO4的濃度為0.03M。底物顯色液:商購(gòu)Sigma TMB顯色液,貨號(hào)T0440-1L。終止液:1.0M的鹽酸水溶液。洗滌液:由NaCl、KH2P04、Na2HP04.WH2OJweenjO 和水組成,NaCl 的濃度為 8.0g/L,KH2PO4 的濃度為 0.2g/L, Na2HPO4.Iffi2O 的濃度為 2.96g/L,Tween-20 的濃度為 0.1% (體積比)。三、應(yīng)用多克隆抗體檢測(cè)變性Bt蛋白1、包被在96孔酶標(biāo)板中每孔加入100 μ L兔多克隆抗體(取實(shí)施例2制備的兔多克隆抗體,用包被緩沖液調(diào)整蛋白濃度為100ng/mL),37°C孵育3小時(shí),然后用洗滌液洗滌4次。2、封閉每孔加入150 μ L封閉液,在37°C濕盒中封閉lh,棄封閉液,然后用洗滌液洗滌4次。3、加樣每孔加入ΙΟΟμ L待測(cè)樣品(樣本-V、樣本-1V、樣本-1I1、樣本-1I或樣本-1),置濕盒中37°C條件下溫育30min,然后用洗滌液洗滌4次。4、加鼠多抗每孔加入100μ L鼠多克隆抗體(取實(shí)施例3制備的鼠多克隆抗體,用樣品稀釋液調(diào)整蛋白濃度為1000ng/mL),置濕盒中37°C條件下溫育30min,然后用洗滌液洗滌4次。5、加酶標(biāo)二抗每孔加100μ L酶標(biāo)二抗(取羊抗小鼠IgG-HRP,用樣品稀釋液稀釋1000倍),置濕盒中37 °C條件下溫育30min,然后用洗滌液洗滌4次。6、顯色每孔加入100μ L底物顯色液,避光放置15min。7、終止每孔加入100 μ L終止液,用酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定OD值。每個(gè)待測(cè)樣本設(shè)置三個(gè)復(fù)孔,取平均OD值。樣本-V (空白對(duì)照)的平均OD值為0.084。樣本-1V (陰性對(duì)照)的平均OD值為0.169。樣本-1II (陽(yáng)性對(duì)照)的平均OD值為2.178。樣本-1I (陽(yáng)性對(duì)照)的平均OD值為3.036。樣本-1的平均OD值為1.876。如果待測(cè)樣本的平均OD值高于陰性對(duì)照的平均OD值0.2以上,則說(shuō)明待測(cè)樣品中含有變性的Bt CrylAc蛋白。四、應(yīng)用現(xiàn)有試劑盒檢測(cè)米用ENVIR0L0GIX 公司的 QualiPlate Kit for CrylAc/CrylAc 試劑盒(目錄號(hào):AP003CRBS,Kit Lot:043230)并按說(shuō)明書(shū)對(duì)待測(cè)樣品(樣本-V、樣本-1V、樣本-1I1、樣本-1I或樣本-1)進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)待測(cè)樣本設(shè)置三個(gè)復(fù)孔,取平均OD值。樣本-V (空白對(duì)照)的平均OD值為0.059。樣本-1V (陰性對(duì)照)的平均OD值為
      0.060。樣本-1II的平均OD值為0.070。樣本-1I (陽(yáng)性對(duì)照)的平均OD值為3.274。樣本-1的平均OD值為0.178。

      實(shí)施例5、應(yīng)用多克隆抗體檢測(cè)變性Bt蛋白1、用pH7.5,0.lmol/L的PB緩沖液、將商購(gòu)的Bt CrylAc蛋白配制成蛋白濃度為lmg/mL的溶液,在100°C沸水中水浴3-5分鐘,即為樣本液VI。2、將樣本液用用pH7.5,0.lmol/L的PB緩沖液梯度稀釋,得到各個(gè)樣本稀釋液。采用實(shí)施例4的步驟三的方法檢測(cè)各個(gè)樣本稀釋液中的變性Bt蛋白,照片見(jiàn)圖2。3、將實(shí)施例4中的樣本-1V (陰性對(duì)照)、樣本-V (空白對(duì)照)、樣本液VK變性抗體),分別采用實(shí)施例4的步驟三的方法檢測(cè)變性Bt蛋白,照片見(jiàn)圖3。4、用國(guó)外市售抗體(國(guó)外抗體)代替實(shí)施例4的步驟三的方法中的鼠多克隆抗體,對(duì)樣本液VI進(jìn)行檢測(cè),照片見(jiàn)圖3。
      權(quán)利要求
      1.用于制備識(shí)別變性Bt蛋白的抗體的免疫原,是將含有變性Bt蛋白的溶液和佐劑混合并乳化得到的產(chǎn)物。
      2.如權(quán)利要求1所述的免疫原,其特征在于:所述含有變性Bt蛋白的溶液的制備方法如下:將含有Bt蛋白的溶液和溶液丙混合后進(jìn)行變性處理,得到含有變性Bt蛋白的溶液;所述含有Bt蛋白的溶液和所述溶液丙的體積配比為1:(1-10);所述溶液丙由溶質(zhì)和溶劑組成,所述溶劑為水,所述溶質(zhì)及其濃度如下:體積比為0.1-2%的β-巰基乙醇和0.1-10.0mg/1OOmL 的 SDS。
      3.如權(quán)利要求2所述的免疫原,其特征在于:所述變性處理為在100°C沸水中水浴3-5分鐘。
      4.如權(quán)利要求2所述的免疫原,其特征在于:所述變性處理為在-20°C冰箱反復(fù)凍融3次以上。
      5.如權(quán)利要求2所述的免疫原,其特征在于:所述變性處理為調(diào)pH至3以下或調(diào)pH至10以上。
      6.如權(quán)利要求1所述的免疫原,其特征在于:所述含有變性Bt蛋白的溶液的制備方法如下:將含有Bt蛋白的溶液進(jìn)行變性處理,得到含有變性Bt蛋白的溶液。
      7.如權(quán)利要求6所述的免疫原,其特征在于:所述變性處理為在100°C沸水中水浴3-5分鐘。
      8.如權(quán)利要求6所述的免疫原,其特征在于:所述變性處理為在-20°C冰箱反復(fù)凍融3次以上。
      9.如權(quán)利要求1至8中任一所 述的方法,其特征在于:所述佐劑為弗氏佐劑,具體可為弗氏完全佐劑或弗式不完全佐劑。
      10.將權(quán)利要求1至8中任一所述的免疫原免疫動(dòng)物得到的多克隆抗體。
      全文摘要
      本發(fā)明公開(kāi)了一種用于制備識(shí)別變性Bt蛋白的抗體的免疫原及其制備的抗體和應(yīng)用。本發(fā)明提供了用于制備識(shí)別變性Bt蛋白的抗體的免疫原,是將含有變性Bt蛋白的溶液和佐劑混合并乳化得到的產(chǎn)物。所述免疫原免疫動(dòng)物得到的多克隆抗體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述多克隆抗體可用作包被抗原和/或檢測(cè)用一抗,從而用于檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有變性Bt蛋白。所述待測(cè)樣本可為煮熟的轉(zhuǎn)基因作物,轉(zhuǎn)基因作物加工得到的食品或飼料等。本發(fā)明對(duì)轉(zhuǎn)基因糧食作物的生物安全性評(píng)價(jià)具有實(shí)用價(jià)值,潛在社會(huì)效益巨大。
      文檔編號(hào)G01N33/68GK103193873SQ20131007051
      公開(kāi)日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月6日
      發(fā)明者王保民, 曹振, 張亮, 張威, 張瑞, 譚桂玉, 南鐵貴, 崔永亮, 郭素琴 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
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