專利名稱：一種γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶抑制劑的篩選方法
一種Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶抑制劑的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于藥物分析領(lǐng)域，具體涉及一種Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶抑制劑的篩選方法。
背景技術(shù)：
y -氨基丁酸(GABA)是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的主要抑制性遞質(zhì)，約50%的中樞突觸部位以其作為遞質(zhì)，主要通過與GABA-A、GABA-B, GABA-C受體結(jié)合發(fā)揮重要的生理活性。GABA的降解主要由GABA轉(zhuǎn)氨酶催化，脫氨基生成琥珀酸半醛，再經(jīng)琥珀酸半醛脫氫酶催化生成琥珀酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)。增加腦內(nèi)GABA濃度可以提高GABA能系統(tǒng)的神經(jīng)抑制作用，進(jìn)而用于治療如癲癇、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥、Alzheimer病等。Y -氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶是催化GABA分解代謝的關(guān)鍵酶。因此Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶已經(jīng)被確認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的靶點(diǎn)，而受到廣泛的關(guān)注。
迄今為止，Y -氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶抑制劑類藥物絕大多數(shù)是合成的藥物，雖然有一定效果，但是存在活性弱，選擇性低、副作用較大的缺點(diǎn)。如1989年在英國上市的Vigabatrin，雖然臨床上取得突破性的療效，但其引起的視網(wǎng)膜不可逆性脫落也不容忽視。植物中的天然酶抑制劑能夠彌補(bǔ)以上缺點(diǎn)，國內(nèi)外在此領(lǐng)域的研究已有一定進(jìn)展，但由于方法的限制，目前植物中Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶抑制劑的開發(fā)只能限于個(gè)別中藥品種的研究。這也促使我們嘗試著尋求新型技術(shù)對篩選過程加以完善。
Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶活性測定是基于酶聯(lián)反應(yīng)原理，GABA經(jīng)Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶作用生成琥珀酸半醛，琥珀酸半醛經(jīng)琥珀酸半醛脫氫酶脫氫生成琥珀酸，脫下的氫將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)還原為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。此酶聯(lián)反應(yīng)中琥珀酸半醛脫氫酶活力很高，Y -氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶是此酶聯(lián)反應(yīng)的限速酶，故以NADH的生成速度反映Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶的活力。傳統(tǒng)的Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶活性測定方法主要有放射性標(biāo)記法、熒光法、紫外-可見分光光度法。這些方法由于背景干擾嚴(yán)重，操作繁瑣等問題，限制了其在復(fù)雜體系(中藥)篩選中的應(yīng)用。
毛細(xì)管電泳技術(shù)(Capillary Electrophoresis, CE),作為高效、快速、低耗的分離技術(shù)，可以高效地將基質(zhì)中相似的化合物實(shí)現(xiàn)快速分離；因此，該技術(shù)在化學(xué)、生命科學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域均有較為廣泛的應(yīng)用。在酶抑制動力學(xué)關(guān)系研究方面，尤其在成分復(fù)雜的中草藥有效成分的抑制作用研究中，以其良好的分離效果、快速、簡便、柱不易受污染的特點(diǎn)，加之易與各種檢測方法聯(lián)用而迅速發(fā)展起來，被廣泛用于酶抑制劑篩選抑制活性評估及抑制類型判斷等方面，CE技術(shù)已成為研究酶反應(yīng)、酶動力學(xué)，以及發(fā)現(xiàn)潛在酶抑制劑的有效手段。在藥物篩選領(lǐng)域，此技術(shù)也發(fā)揮過不可替代的作用。本發(fā)明也基于這些理論與成果，繼續(xù)探索毛細(xì)管電泳技術(shù)在高通量藥物篩選中的應(yīng)用。發(fā)明內(nèi)容
為了解決Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶抑制劑篩選技術(shù)中的，光譜法容易受干擾的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶抑制劑篩選方法，應(yīng)用本發(fā)明篩選Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶的抑制劑精確度高，專屬性強(qiáng)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:
(I)建立毛細(xì)管電泳方法測定NADH
采用區(qū)帶電泳方式實(shí)現(xiàn)對酶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物NADH的檢測及定量分析。本發(fā)明采用內(nèi)標(biāo)法對NADH定量分析，并采用布洛芬對照品溶液為內(nèi)標(biāo)。本發(fā)明中采用的毛細(xì)管電泳方法的條件:未涂層毛細(xì)管柱長度為25-50cm，有效長度為16.7-41.7 cm，運(yùn)行緩沖液為磷酸緩沖鹽PH6-10，分離電壓為25-30 KV，DAD檢測器的檢測波長為200nm，毛細(xì)管溫度為18 °C-25 °C，壓力進(jìn)樣方式。(2)基于毛細(xì)管電泳法對NADH的定量分析，測定以NADH為酶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物的γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶的活性。(3)將所建立的方法應(yīng)用于Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶抑制劑的篩選，對備檢樣品的抑制活性進(jìn)行測定和計(jì)算。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施案例中選擇石菖蒲為篩選對象，以毛細(xì)管電泳為工具，測定了Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶活性以對各藥材水提取物進(jìn)行篩選:所述的中藥材石菖蒲已運(yùn)用在抗癲癇復(fù)方中，藥理證實(shí)其具有定志寧神、益智健腦的功效。本發(fā)明方法的特點(diǎn)是摒棄了傳統(tǒng)的光譜法測定Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶活性時(shí)背景干擾嚴(yán)重的缺陷，采用高效 毛細(xì)管電泳方法分離測定NADH，進(jìn)而測定以NADH為酶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物的Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶的活性。本發(fā)明篩選Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶抑制劑，樣品檢測準(zhǔn)確、快速，避免了利用光譜法篩選Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶抑制劑時(shí)的假陽性和假陰性結(jié)果的問題。實(shí)施案例中的篩選結(jié)果顯示，本發(fā)明方法操作簡單，自動化程度高，經(jīng)濟(jì)有效，適合中藥材中具Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶抑制作用的活性組分篩選。本發(fā)明中經(jīng)優(yōu)化的毛細(xì)管電泳各參數(shù)對于利用毛細(xì)管電泳技術(shù)測定其他類似性質(zhì)的生物分子具有重要的參考價(jià)值。


圖1為本發(fā)明的NADH色譜圖，
其中A:空白，B:空白樣品加入內(nèi)標(biāo)與NADH, C:實(shí)際酶鮮育樣品；
峰I為內(nèi)標(biāo)色譜峰，峰2為NADH色譜峰。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供的Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶抑制劑篩選方法，包括以下步驟:
1.毛細(xì)管電泳法測定NADH
毛細(xì)管電泳條件:未涂層毛細(xì)管柱長度為25-50cm，有效長度為16.7-41.7 cm，運(yùn)行緩沖液為磷酸緩沖鹽PH6-10，分離電壓為25-30 KV，DAD檢測器的檢測波長為200nm，毛細(xì)管溫度為18 0C-25 °C，壓力進(jìn)樣方式；未涂層毛細(xì)管柱長度優(yōu)選32-40cm，更優(yōu)選32 cm；有效長度優(yōu)選23.7-31.7 cm,更優(yōu)選23.7 ;運(yùn)行緩沖液為磷酸緩沖鹽優(yōu)選PH6-8，更優(yōu)選為
7.5 ;分離電壓優(yōu)選28 KV，溫度優(yōu)選20 °C。
采用內(nèi)標(biāo)法對NADH定量分析，并采用布洛芬對照品溶液為內(nèi)標(biāo)。
2.基于毛細(xì)管電泳法對NADH的定量分析，測定大鼠腦組織中Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶的活性 將大鼠斷頭處死，迅速取出大腦，稱重，按1:10 (r/K)加入預(yù)冷的0.32mM蔗糖溶液，冰浴中進(jìn)行勻漿，將勻漿液7000r/min，4°C離心15min，收集上清。取勻漿上清加入2倍體積冰冷的Triton介質(zhì)，混勻后靜置Ih作為備用樣品，待測酶活性。
反應(yīng)總體積200 μ ，含有 50 mM Tris-HCl(pH 8.5)、2.0 mM a -KGU.0 mM NAD+、15 μ 的備用樣品.各反應(yīng)管37°C溫育IOmin后，測定管加入終濃度3.0 mM GABA，空白管加入相同體積的50mM Tris-HCl (pH 8.5)，繼續(xù)溫育30min，冰浴終止反應(yīng)。取孵育后樣品50μ1,加入內(nèi)標(biāo)10μ1,混勻，直接進(jìn)樣分析。
酶活力計(jì)算:GABA-T的活力以每小時(shí)每克濕重腦組織催化生成NADH的μ mol數(shù)表示，單位為ymol/g.]!—1。
3.中藥材水提取物中Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶抑制活性組分的篩選取受試藥材適量，10倍量重蒸水超聲提取30min，過濾后再次10倍量重蒸水超聲提取30min,合并兩次續(xù)慮液,加重蒸水稀釋成10mg/ml的備檢樣品。
反應(yīng)總體積200 μ ，含有 50 mM Tris-HCl (pH 8.5),2.0 mM a -KGU.0 mM NAD+,15μ 的酶制備樣品以及20μ1備檢樣品，各反應(yīng)管37°C溫育IOmin后，測定管加入終濃度3.0mM GABA，空白管加入相同體積的50mM Tris-HCl (pH 8.5)，繼續(xù)溫育30min，冰浴終止反應(yīng)。取孵育后樣品50μ1,加入內(nèi)標(biāo)10μ1,混勻，直接進(jìn)樣分析。以不加備檢樣品時(shí)的NADH產(chǎn)生量為對照(Ctl),計(jì)算備檢樣品對Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶的抑制率:1(%) = (0τ C1)/Ctl, C1為加入備檢樣品時(shí)的NADH產(chǎn)生量。
為使本領(lǐng)域技術(shù)人員 更好的理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
實(shí)施例1 1.毛細(xì)管電泳法測定NADH 毛細(xì)管電泳條件:未涂層毛細(xì)管柱長度為25cm。毛細(xì)管有效長度為16.7cm。運(yùn)行緩沖液為磷酸緩沖鹽PH10。分離電壓為30 KV。DAD檢測器的檢測波長為200nm。毛細(xì)管溫度為25°C。壓力進(jìn)樣方式，進(jìn)樣壓力50mbar進(jìn)樣時(shí)間15s。
2.基于毛細(xì)管電泳法對NADH的定量分析，測定大鼠腦組織中Y -氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶的活性 將大鼠斷頭處死，迅速取出大腦，稱重，按1:10 (r/K)加入預(yù)冷的0.32mM蔗糖溶液，冰浴中進(jìn)行勻漿，將勻漿液7000r/min，4°C離心15min，收集上清。取勻漿上清加入2倍體積冰冷的Triton介質(zhì)，混勻后靜置Ih作為備用樣品，待測酶活性。
反應(yīng)總體積200 μ ，含有 50 mM Tris-HCl(pH 8.5)、2.0 mM a -KGU.0 mM NAD+、15 μ 的備用樣品.各反應(yīng)管37°C溫育IOmin后，測定管加入終濃度3.0 mM GABA，空白管加入相同體積的50mM Tris-HCl (pH8.5)，繼續(xù)溫育30min，冰浴終止反應(yīng)。取孵育后樣品50μ1,加入內(nèi)標(biāo)10μ1,混勻，直接進(jìn)樣分析。
3.取藥材適量，10倍量重蒸水超聲提取30min,過濾后再次10倍量重蒸水超聲提取30min,合并兩次續(xù)慮液,加重蒸水稀釋成10mg/ml的備檢樣品。
反應(yīng)總體積200 μ ，含有 50 mM Tris-HCl (pH 8.5)、2.0 mM a -KGU.0 mM NAD+、15 μ 的酶制備樣品以及20μ1備檢樣品，各反應(yīng)管37°C溫育IOmin后，測定管加入終濃度3.0 mM GABA，空白管加入相同體積的50mM Tris-HCl (pH 8.5)，繼續(xù)溫育30min，冰浴終止反應(yīng)。取孵育后樣品50μ1，加入200 μg -πιΓ1布洛芬對照品溶液10μ1，混勻，直接進(jìn)樣分析。以不加備檢樣品時(shí)的NADH產(chǎn)生量為對照(Ctl),計(jì)算備檢樣品對Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶的抑制率:1(%) = (0τ C1)/C0, C1為加入備檢樣品時(shí)的NADH產(chǎn)生量，結(jié)果如下:
權(quán)利要求
1.一種Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶抑制劑的篩選方法，其特征在于利用毛細(xì)管電泳技術(shù)，對Y -氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶的酶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物NADH定量分析，篩選出中藥中具Y -氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶抑制作用的活性組分，其步驟包括: (1)建立毛細(xì)管電泳方法測定NADH， 采用區(qū)帶電泳方式實(shí)現(xiàn)對酶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物NADH的檢測及定量分析； (2)基于毛細(xì)管電泳法對NADH的定量分析，測定以NADH為酶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物的Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶的活性； (3)將所建立的方法應(yīng)用于Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶抑制劑的篩選，對備檢樣品的抑制活性進(jìn)行測定和計(jì)算。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，對極性分子NADH的最低定量限為 2.5MmoI.L'
3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，采用布洛芬對照品溶液為內(nèi)標(biāo)。
4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，毛細(xì)管電泳條件為:未涂層毛細(xì)管柱長度為25-50cm，有效長度為16.7-41.7 cm，運(yùn)行緩沖液為磷酸緩沖鹽PH6-10，分離電壓為25-30 KV，DAD檢測器的檢測波長為200nm，毛細(xì)管溫度為18 °C-25 °C，壓力進(jìn)樣方式。
5.按權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，未涂層毛細(xì)管柱長度為32-40cm，優(yōu)選32cm。
6.按權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，有效長度為23.7-31.7 cm，優(yōu)選23.7 cm。
7.按權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，運(yùn)行緩沖液為磷酸緩沖鹽PH6-8，優(yōu)選PH7.5。
8.按權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，分離電壓為28KV。
9.按權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，毛細(xì)管溫度為20°C。
10.權(quán)利要求1所述的一種Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶抑制劑的篩選方法中藥提取液中Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶抑制劑篩選中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥物分析領(lǐng)域，具體涉及一種γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶抑制劑的篩選方法。其步驟包括(1)建立毛細(xì)管電泳方法測定NADH；采用區(qū)帶電泳方式實(shí)現(xiàn)對酶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物NADH的檢測及定量分析。(2)基于毛細(xì)管電泳法對NADH的定量分析，測定以NADH為酶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物的γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶的活性。(3)將所建立的方法應(yīng)用于γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶抑制劑的篩選，對備檢樣品的抑制活性進(jìn)行測定和計(jì)算。本發(fā)明方法的特點(diǎn)是摒棄了傳統(tǒng)的光譜法測定γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶活性時(shí)背景干擾嚴(yán)重的缺陷，且樣品檢測準(zhǔn)確、快速，避免了利用光譜法篩選γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶抑制劑時(shí)的假陽性和假陰性結(jié)果的問題。
文檔編號G01N27/447GK103149264SQ201310073528
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月8日
發(fā)明者邸欣, 陳亮, 劉有平, 王鑫 申請人:沈陽藥科大學(xué)