專利名稱：基于納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及基于納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極及其制備方法，還涉及以修飾的電極作為工作電極組建的電化學(xué)生物傳感器及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin, EP0)是一種糖蛋白激素，在人體內(nèi)主要是由腎臟生成的一種造血生長(zhǎng)因子，其生理功能是促進(jìn)骨髓紅細(xì)胞的生成和釋放。1985年人類首次利用基因工程技術(shù)合成了重組人促紅細(xì)胞生成素(Recombinant humanerythropoietin, rhEPO),由于其具有分裂原和分化原的雙重功能,能在不輸血的情況下產(chǎn)生輸血效應(yīng)，使病人避免病毒感染和輸血過(guò)量的危險(xiǎn)，已在腎性貧血的治療方面發(fā)揮出重要作用。同時(shí)，因其具有提高機(jī)體攜氧能力、增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)耐力的特性，rhEPO在體育運(yùn)動(dòng)中成為新的興奮劑。2005年起，國(guó)際奧 委會(huì)和世界反興奮劑機(jī)構(gòu)的禁用清單中，rhEPO被列為體育競(jìng)技中禁用的首個(gè)肽類物質(zhì)。由于rhEPO和EPO結(jié)構(gòu)相似，功能一致，從而很難精確區(qū)分EPO與rhEPO，造成rhEPO在體育競(jìng)賽中的濫用。rhEPO和EPO唯一差別僅在于等電點(diǎn)不同，EPO的等電點(diǎn)為
3.7^4.7，rhEPO的等電點(diǎn)為4.4^5.1?，F(xiàn)有檢測(cè)方法如等電聚焦、凝膠電泳等方法存在實(shí)驗(yàn)分離時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)效率低、特異性差等缺點(diǎn)，不能滿足快速、精確檢測(cè)的要求。公開號(hào)為CN10285423IA的中國(guó)專利公開了將促紅細(xì)胞生成素受體通過(guò)ZnO溶膠-凝膠過(guò)固定在電極表面，然后將該電極能夠組建成精確檢測(cè)EPO和rhEPO的電化學(xué)生物傳感器。但是制備的生物傳感器在檢測(cè)低濃度樣品時(shí)，由于循環(huán)伏安曲線的峰電流值變化較小，檢測(cè)的靈敏度較低。因此，急需研究一種能進(jìn)一步提高檢測(cè)EPO和rhEPO的靈敏度的方法及檢測(cè)工具，對(duì)遏制rhEPO在體育競(jìng)賽中的濫用具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供基于納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極；本發(fā)明的目的之二在于提供基于納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極的制備方法；本發(fā)明的目的之三在于提供以修飾的電極作為工作電極組建的電化學(xué)生物傳感器；本發(fā)明的目的之四在于提供利用電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)促紅細(xì)胞生成素和/或重組人促紅細(xì)胞生成素的方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
1.基于納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極，所述電極是在沉積納米金的電極表面通過(guò)ZnO溶膠-凝膠固定促紅細(xì)胞生成素受體作為識(shí)別元件，再在電極表面沉積納米金的玻碳電極。2.所述基于納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極的制備方法，包括如下步驟:
a.將玻碳電極表面打磨，拋光，清潔，干燥，得預(yù)處理玻碳電極，備用；
b.將步驟a所得預(yù)處理玻碳電極浸入HAuCl4溶液中，電沉積，清洗，得沉積納米金的玻碳電極，備用；
c.將乙酸鋅溶于無(wú)水乙醇中，再在超聲波作用下加入氫氧化鋰，得ZnO溶膠-凝膠溶液，備用；
d.將步驟c所得ZnO溶膠-凝膠溶液與促紅細(xì)胞生成素受體溶液混勻，滴加至步驟b所得沉積納米金的玻碳電極表面，干燥成膜，洗滌，即制得促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極；
e.將步驟d所得促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極再次浸入HAuCl4溶液中，電沉積，清洗，最后浸入BSA溶液中封閉非特異性位點(diǎn)，得納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極。優(yōu)選的，所述步驟a是用均相砂紙打磨玻碳電極，然后依次用加有0.3 ii m和
0.05um三氧化二鋁的濕潤(rùn)拋光紙拋光，每次拋光后用水洗凈，再依次于硝酸、丙酮和水中超聲洗滌，干燥備用。優(yōu)選的,所述步驟b是將步驟a所得預(yù)處理玻碳電極浸入濃度為1-20 mmol/L的HAuCl4溶液中，電沉積20-100秒，然后用水清洗，備用。更優(yōu)選的，所述步驟b是將步驟a所得預(yù)處理玻碳電極浸入濃度為10 mmol/L的HAuCl4溶液中，電沉積60秒,然后用水清洗,備用。為了使電沉積效果更佳,使用恒電位進(jìn)行電沉積，恒電位優(yōu)選為0.6V。優(yōu)選的，所述步驟c是將乙酸鋅溶于無(wú)水乙醇中制成濃度為0.lmol/L的溶液，再在超聲波作用下加入氫氧化鋰至終濃度為0.067mol/L,制得ZnO溶膠-凝膠貯備液，臨用前用無(wú)水乙醇按體積比為2: f 1:3進(jìn)行稀釋，制得ZnO溶膠-凝膠溶液。更優(yōu)選的，臨用前用無(wú)水乙醇按體積比為1:2進(jìn)行稀釋，制得ZnO溶膠-凝膠溶液。優(yōu)選的，所述步驟d是將步驟c所得的ZnO溶膠-凝膠溶液與濃度為IOng/L^lOO u g/L的促紅細(xì)胞生成素受體溶液按照體積比為4:廣1:1.15混合均勻，再將混合液滴加在步驟b所得沉積納米金的玻碳電極表面，空氣中干燥，用磷酸鹽緩沖液充分洗滌，制得促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極。更優(yōu)選的，所述步驟d是將步驟c所得的ZnO溶膠-凝膠溶液與濃度為I U g/L的促紅細(xì)胞生成素受體溶液按照體積比為1:1混合均勻，再將混合液滴加在步驟b所得沉積納米金的玻碳電極表面，空氣中干燥，用磷酸鹽緩沖液充分洗滌，制得促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極。優(yōu)選的，所述步驟e是將步驟d所得促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極再次浸入濃度為l-20mmol/L的HAuCl4溶液中，電沉積10-50秒，清洗，最后浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的BSA溶液中I小時(shí)，封閉非特異性位點(diǎn)，得納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極。更優(yōu)選的，所述步驟e是將步驟d所得促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極再次浸入濃度為lOmmol/L的HAuCl4溶液中，電沉積30秒，清洗，最后浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的BSA溶液中I小時(shí)，封閉非特異性位點(diǎn)，得納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極。3.促紅細(xì)胞生成素和重組人促紅細(xì)胞生成素電化學(xué) 生物傳感器，包括工作電極、對(duì)電極、參比電極和測(cè)試底液；所述工作電極為所述的納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極，對(duì)電極為鉬電極，參比電極為飽和甘汞電極；所述測(cè)試底液為含有2mmol/LK3[Fe (CN)6]和 2mmol/L K4 [Fe (CN)6]且 pH 為 6.2 9.0 的磷酸鹽緩沖液。4.利用所述的電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)促紅細(xì)胞生成素和/或重組人促紅細(xì)胞生成素的方法，將納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極與樣品溶液共孵育20分鐘以上，然后以納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極為工作電極、鉬電極為對(duì)電極、飽和甘汞電極為參比電極、含有 2mmol/L K3[Fe (CN)6]和 2mmol/L K4[Fe (CN)6]且 pH 為 6.2 9.0 的磷酸鹽緩沖液為測(cè)試底液構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器，采用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描測(cè)定，電位掃描范圍為-0.3疒0.7V，電位掃描速率為10mv/s 100mv/s，根據(jù)電位0.14疒0.17V處的峰電流和促紅細(xì)胞生成素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中促紅細(xì)胞生成素的濃度，和/或根據(jù)電位
0.06疒0.09V處的峰電流和重組人促紅細(xì)胞生成素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中重組人促紅細(xì)胞生成素的濃度。本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明公開了基于納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極，通過(guò)在玻碳電極表面沉積納米金，由于ZnO溶膠-凝膠和納米金之間具有很高的親和性，為ZnO溶膠-凝膠固定EPOR提供了良好的生物學(xué)環(huán)境，而ZnO溶膠-凝膠具有很大的比表面積，為納米金的第二次電沉積提供良好的生物兼容界面，最終使電極表面的EPOR的固載量成倍增加，能夠提高EPOR-EPO/rhEPO復(fù)合物的數(shù)量，增加其峰電流值，從而提高檢測(cè)極低濃度促紅細(xì)胞生成素和/或重組人促紅細(xì)胞生成素的靈敏度，對(duì)EP0/rhEP0的檢出限均為0.lpg/Lo以制得基于納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極創(chuàng)建rhEP0/EP0電化學(xué)生物傳感器，能夠成倍放大檢測(cè)信號(hào)，與未經(jīng)納米金修飾電極構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器相比，檢測(cè)信號(hào)能放大約三倍，因此能夠用于實(shí)現(xiàn)極低濃度rhEP0/EP0的靈敏檢測(cè)。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說(shuō)明:
圖1為第一次納米金電沉積時(shí)間對(duì)玻碳電極峰電流的影響。圖2為第二次納米金電沉積時(shí)間對(duì)玻碳電極峰電流的影響。圖3為HAuCl4濃度對(duì)玻碳電極峰電流的影響。圖4為ZnO溶膠-凝膠貯備液與無(wú)水乙醇的稀釋比對(duì)納米金和EPOR修飾電極電流響應(yīng)的影響。圖5為ZnO溶膠-凝膠溶液與EPOR溶液的體積比對(duì)納米金和EPOR修飾電極電流響應(yīng)的影響。圖6為EPOR溶液濃度對(duì)納米金和EPOR修飾電極電流響應(yīng)的影響。圖7為納米金和EPOR修飾的電極制備過(guò)程用循環(huán)伏安法(Cyclic Voltammetry,CV)表征的CV曲線圖。圖8為EPOR修飾的電極(未經(jīng)納米金修飾)檢測(cè)rhEP0/EP0的CV曲線圖。圖9為納米金和EPOR修飾電極與未經(jīng)納米金修飾的電極(EP0R修飾電極)檢測(cè)rhEP0/EP0峰電流差值結(jié)果比較圖(1:納米金和EPOR修飾電極檢測(cè)EPO ；2 =EPOR修飾電極檢測(cè)EPO ；3:納米金和EPOR修飾電極檢測(cè)rhEPO ；4 =EPOR修飾電極檢測(cè)rhEPO)。
圖10為測(cè)試底液的pH值對(duì)EPO和rhEPO納米金電化學(xué)生物傳感器電流響應(yīng)的影響。圖11為工作電極在樣品溶液中的孵育時(shí)間對(duì)EPO和rhEPO納米金電化學(xué)生物傳感器電流響應(yīng)的影響。圖12為循環(huán)伏安法掃描電位對(duì)rhEPO/EPO納米金電化學(xué)生物傳感器電流響應(yīng)的影響。圖13為納米金 和EPOR修飾電極在最佳條件下檢測(cè)rhEPO/EPO獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(A:檢測(cè)rhEPO獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線；B:檢測(cè)EPO獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線)。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中使用的主要儀器與試劑來(lái)源如下:CHI760D型電化學(xué)工作站購(gòu)自上海辰華儀器有限公司；KQ-5200B型超聲器清洗器購(gòu)自江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；ZD-2自動(dòng)電位滴定儀購(gòu)自上海精科雷磁有限公司；一水氫氧化鋰(LiOH H20)、二水乙酸鋅(Zn(Ac)2CH2O)購(gòu)自上海生物生工有限公司；無(wú)水乙醇、硝酸、丙酮購(gòu)自重慶川東集團(tuán)有限公司化學(xué)試劑廠；鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀購(gòu)自重慶東方試劑廠，玻碳電極、飽和甘汞電極、鉬電極和0.3 ii m、0.05 ii m Al2O3粉末購(gòu)自天津艾達(dá)恒昊科技發(fā)展有限公司；PBS粉末購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；EP0和EPOR購(gòu)自美國(guó)Novus Biologicals公司；rhEPO標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Abnova公司；氯金酸(HAuCl4)購(gòu)自百靈威公司；牛血清白蛋白購(gòu)自Sigma公司。一、納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極的制備方法及參數(shù)優(yōu)化 納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極的制備方法，包括如下步驟:
a.用潤(rùn)濕的均相砂紙打磨玻碳電極，然后依次用加有0.3 ii m和0.05 ii m Al2O3的潤(rùn)濕拋光紙拋光打磨，每次打磨后用超純水洗凈，再依次于硝酸、丙酮和超純水中超聲洗滌5分鐘，得預(yù)處理玻碳電極，干燥備用；
b.將步驟a所得預(yù)處理玻碳電極浸入濃度為lOmmol/L的HAuCl4溶液中，在恒電位
0.6V條件下電沉積60秒，然后用超純水清洗后，得沉積納米金的玻碳電極，保存?zhèn)溆茫?br> c.將Zn(Ac)2CH2O 2.20g (0.0lmol)溶于IOOmL無(wú)水乙醇中，再在超聲波作用下緩慢加入LiOH H2O 0.28g (6.7mmol),制得ZnO溶膠-凝膠貯備液，4°C保存?zhèn)溆?，使用時(shí)按照Z(yǔ)nO溶膠-凝膠貯備液與無(wú)水乙醇的體積比為1:2加入無(wú)水乙醇稀釋，制得ZnO溶膠-凝膠溶液；
d.將濃度為IU g/L的EPOR溶液與步驟c制備的ZnO溶膠-凝膠溶液按體積比為1:1混合，然后取20 y L含EPOR的ZnO溶膠-凝膠溶液加到步驟b所得沉積納米金的玻碳電極表面，再在4°C冰箱中放置10小時(shí)，取出用超純水清洗后，得促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極；
e.將步驟d所得促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極再次浸入濃度為10mmol/L的HAuCl4溶液中，在恒電位0.6V條件下電沉積30秒，然后用超純水清洗，最后將電極在4°C條件下浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5% BSA溶液中I小時(shí)，封閉非特異性位點(diǎn)，得納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極，將修飾好的電極懸置于PBS溶液(pH7.4，0.05mol/L)中，4 °C下儲(chǔ)存，備用。
本發(fā)明在研究過(guò)程中對(duì)影響納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極電流響應(yīng)的主要參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。以不同參數(shù)制備的納米金修飾促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極為工作電極、飽和甘汞電極作為參比電極、鉬電極作為對(duì)電極組建電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)系統(tǒng)，以含有2mmol/L K3[Fe (CN)6]-K4 [Fe (CN)6]的 PBS 溶液(pH7.4,0.05mol/L)作為測(cè)試底液，在室溫下采用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描測(cè)定，電位掃描范圍為-0.3V、.7V，電位掃描速率為50mv/s。在電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)過(guò)程中，以納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極測(cè)定的初始峰電流記為10 ;當(dāng)EP0R-rhEP0/EP0雜交反應(yīng)完成后，其檢測(cè)峰電流記為I;則峰電流變化Δ/= 1 — 1,。本文以此為依據(jù)對(duì)待測(cè)樣本中的rhEPO和EPO進(jìn)行檢測(cè)，其中Λ J值越大，表明EPOR與rhEPO或EPO結(jié)合的量越多。1、第一次納米金電沉積時(shí)間的優(yōu)化
將玻碳電極置于濃度為10 mmol/L的HAuCl4溶液中，在恒電位0.6V條件下分別電沉積20秒、40秒、60秒、80秒、100秒，之后清洗電極并將電極分別置于含有2mmol/LK3[Fe (CN) J-K4[Fe (CN)6]的 PBS 溶液(ρΗ7.4，0.05mol/L)中檢測(cè)各自的 CV 曲線(圖1)。結(jié)果顯示，在電沉積20-100秒時(shí)傳感器的峰電流值較大，但在60秒條件下峰電流值最大。并且電沉積時(shí)間從20秒增加到60秒時(shí)，隨著電沉積時(shí)間的增大，傳感器的峰電流值也逐漸增大，而電沉積時(shí)間從60秒增加到100秒時(shí)，隨著電沉積時(shí)間增大，傳感器的峰電流值卻逐漸減小。其原因是HAuCl4沉積時(shí)間是影響納米金厚度與數(shù)量的重要因素，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，電沉積時(shí)間越長(zhǎng)，HAuCl4還原生成的納米金越多，電極表面沉積的納米金越厚,峰電流值越大，放大效率越高。然而如果電沉積時(shí)間太長(zhǎng)，則會(huì)阻礙電子傳遞。因此，第一次納米金電沉積時(shí)間優(yōu)選為20-100秒，更優(yōu)選為60秒。2、第二次納米金電沉積時(shí)間的優(yōu)化
將EPOR修飾電極置于10 mmol/L濃度的HAuCl4溶液中，在恒電位0.6V條件下分別電沉積10秒、20秒、30秒、40秒、50秒,然后清洗電極并將電極分別置于含有2mmol/LK3[Fe (CN) J-K4 [Fe (CN)6]的 PBS 溶液(ρΗ7.4，0.05mol/L)中檢測(cè)各自的 CV 曲線(圖 2)。結(jié)果顯示，電沉積時(shí)間從10秒增加到30秒，傳感器的峰電流值也隨之逐漸增大；當(dāng)電沉積時(shí)間從30秒增加到50秒，傳感器峰電流值逐步下降，因此電沉積時(shí)間為30秒時(shí)其峰電流值最大。其原因是第二次電沉積HAuCl4后，電極表面所形成的是“三明治”式修飾層，納米金的厚度對(duì)受體與待測(cè)樣品的反應(yīng)起著至關(guān)重要的作用。如果沉積時(shí)間較短，所形成納米金層較薄，則不利于受體與待測(cè)樣品發(fā)生反應(yīng)；若電沉積時(shí)間較長(zhǎng)，所形成的納米金層較厚，則不利于電子傳遞。因此，第二次納米金電沉積時(shí)間優(yōu)選為10-50秒，最優(yōu)選為30秒。3、納米金濃度的優(yōu)化
將玻碳電極分別置于濃度為 lmmol/L、5 mmol /I,、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L 的HAuCl4溶液中，在恒電位0.6V條件下第一次電沉積60秒，第二次電沉積30秒，然后清洗電極并將電極分別置于含有 2mmol/L K3[Fe (CN) J-K4 [Fe (CN)6]的 PBS 溶液(pH7.4,0.05mol/L)中檢測(cè)各自的峰電流值(圖3)。結(jié)果顯示，隨著HAuCl4溶液濃度逐漸增大，傳感器的峰電流先增大后減小，其中在10 mmol/L濃度的HAuCl4溶液中沉積的傳感器峰電流最大，而其他濃度的HAuCl4溶液中沉積的傳感器峰電流值均較小。原因是電極表面的納米金厚度及數(shù)量與被還原的HAuCl4濃度有關(guān)，納米金可以有效增大電極比表面積和受體固定量，在一定濃度范圍內(nèi)，HAuCl4的濃度越大，所生成的納米金厚度越厚，數(shù)量越多，越有利于電子傳遞及放大生物反應(yīng)信號(hào)；但若超出這個(gè)濃度范圍，生成的納米金厚度增加而阻礙了電子傳遞，并且電極表面納米金太密集反而不利于受體的固定。因此，電沉積的納米金優(yōu)選HAuCl4濃度為l_20mmol/L,更優(yōu)選的，HAuCl4的濃度為10 mmol/L。 同時(shí)ZnO溶膠-凝膠貯備液與無(wú)水乙醇的稀釋比、ZnO溶膠-凝膠溶液與EPOR溶液的體積比、EPOR溶液的濃度都會(huì)影響納米金和EPOR修飾電極的電流響應(yīng)。通過(guò)優(yōu)化可知，ZnO溶膠-凝膠貯備液與無(wú)水乙醇的稀釋比優(yōu)選為2:廣1:3，更優(yōu)選為1:2 (圖4);ZnO溶膠-凝膠溶液與EPOR溶液的體積比優(yōu)選為4:1 1: 1.15，更優(yōu)選為1:1 (圖5);EP0R溶液的濃度優(yōu)選為10ng/L 100 u g/L,更優(yōu)選為I y g/L (圖6)。二、納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極制備過(guò)程中峰電流的變化
本發(fā)明研究了制備過(guò)程中電極的峰電流變化，用循環(huán)伏安法測(cè)定的CV曲線表征。按上述條件用循環(huán)伏安法分別測(cè)定玻碳電極、沉積納米金的玻碳電極、促紅細(xì)胞生成素受體修飾沉積納米金的玻碳電極、第二次沉積納米金的玻碳電極、納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極、納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極雜交rhEPO/EPO后峰電流變化，并根據(jù)峰電流變化繪制CV曲線(圖7)。如圖7所示，與玻碳電極得到CV曲線相比，沉積納米金后，峰電流明顯增大，而EPOR修飾沉積納米金后，峰電流有所下降；第二次電沉積納米金后，峰電流大幅增加；但是將第二次電沉積的玻碳電極用BSA封閉后，峰電流值有所減小，最后用制備的納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極雜交rhEPO或EP0，其峰電流進(jìn)一步下降。產(chǎn)生上述現(xiàn)象的原因是當(dāng)玻碳電極第一次電沉積納米金后，納米金可以促進(jìn)電極表面的電子傳遞，因此傳感器的峰電流增大；在沉積納米金修飾電極上通過(guò)ZnO溶膠-凝膠固定EPOR后，由于電極表面形成的凝膠薄膜和EPOR在一定程度上阻礙了電極表面的電子傳輸，因此峰電流值減??；在電極表面第二次電沉積納米金后，由于更多的納米金進(jìn)一步增大了電極比表面積，更有利于電子傳遞，故檢測(cè)到傳感器峰電流值增加；第二次電沉積納米金電極用BSA封閉后，BSA蛋白封閉了非特異性吸附位點(diǎn)，同時(shí)又阻礙了電子的傳輸，因此傳感器的峰電流值有所減?。蛔詈?，用制得的納米金修飾促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極分別在含有rhEPO或EPO的待測(cè)樣品中孵育20分鐘后，由于電極表面生成的蛋白質(zhì)大分子EPOR-rhEPO/EPO復(fù)合物嚴(yán)重阻礙了電極表面的電子傳輸，因此傳感器的峰電流進(jìn)一步下降。同時(shí)用未經(jīng)納米金修飾的電極作為對(duì)照(即公告號(hào)為102854231A的中國(guó)專利制備促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極)，分別放入含有rhEPO或EPO的待測(cè)樣品中檢測(cè)，結(jié)果如圖8所示。結(jié)果顯示,促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極的電極峰電流值最大,而與rhEP0/EP0雜交后，峰電流值有所減小，可能是在電極表面形成的EP0R-rhEP0/EP0復(fù)合物在一定程度上阻礙了電極表面的電子傳輸。將本發(fā)明制備的納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極與未經(jīng)納米金修飾的電極檢測(cè)rhEPO和EP0，檢測(cè)結(jié)果顯示本發(fā)明制備的修飾電極的峰電流變化值放大了約3倍(圖9)。因此，經(jīng)納米金修飾后電極的靈敏度高于未經(jīng)納米金修飾的電極。三、rhEPO和/或EPO納米金電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建及參數(shù)優(yōu)化
將納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極與樣品溶液孵育20分鐘，然后以納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極為工作電極、飽和甘汞電極為參比電極、鉬電極為對(duì)電極構(gòu)建EPO和rhEPO電化學(xué)生物傳感器，以含有2mmol/L K3 [Fe (CN)6]-K4 [Fe (CN)6]的PBS溶液(pH7.4,0.05mol/L)為測(cè)試底液，在室溫下采用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描測(cè)定，電位掃描范圍為-0.3V、.7V，電位掃描速率為50mv/s。本發(fā)明在研究過(guò)程中對(duì)影響rhEPO和EPO納米金電化學(xué)生物傳感器電流響應(yīng)的主要參數(shù)也進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，測(cè)試底液的PH值為6.2^9.0時(shí)傳感器的峰電流較大，pH值為7.4時(shí)傳感器的峰電流最大(圖10)。因此，測(cè)試底液的pH值優(yōu)選為6.2、.0，更優(yōu)選為
7.4 ;納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極與500ng/L EPO或rhEPO標(biāo)準(zhǔn)品溶液的孵育時(shí)間從5分鐘增加至20分鐘，傳感器的峰電流逐漸降低并達(dá)到最小值，之后繼續(xù)增加孵育時(shí)間至40分鐘，峰電流基本保持不變，說(shuō)明20分鐘時(shí)納米金EPOR修飾電極上結(jié)合的EPO或rhEPO已達(dá)到飽和，因此納米金EPOR修飾電極與樣品溶液的孵育時(shí)間優(yōu)選為20分鐘以上，更優(yōu)選為20分鐘(圖11)。此外，掃描電位的變化對(duì)K3 [Fe (CN)6]-K4 [Fe (CN)6]氧化還原峰的峰電位的影響不大，但對(duì)納米金電化學(xué)傳感器的電流響應(yīng)的影響較為明顯，在-0.3疒0.7V之間有最好的電流響應(yīng)(圖12)。 電位掃描速率影響循環(huán)伏安曲線的形狀，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，電位掃描速率在lOmv/s 100 mv/s范圍內(nèi)都可行，當(dāng)其為50 mv/s時(shí)循環(huán)伏安曲線最光滑。四、rhEPO和EPO納米金電化學(xué)生物傳感器的檢測(cè)性能
在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，使用納米金修飾的電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)不同濃度的rhEPO和EPO0實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在雜交反應(yīng)初始階段，由于大分子EP0R-rhEP0/EP0復(fù)合物部分阻塞了電極表面的電子傳輸通道，與空白對(duì)照相比，其氧化還原峰電流值明顯降低。隨著rhEPO/EPO濃度的不斷增加，其峰電流變化(AJ)也隨之增大。從圖13A和圖13B可以看出，rhEPO/EPO濃度在0.5 pg/L~500 ng/L的范圍內(nèi)時(shí)，其濃度的對(duì)數(shù)值與峰電流呈良好的線性關(guān)系。其中rhEPO的線性回歸方程為:y = 3.7068x + 31.796，相關(guān)系數(shù)為0.9912 ；EP0的線性回歸方程為:y = 3.4389x + 29.685，相關(guān)系數(shù)0.9925，二者的檢測(cè)限均為0.1 pg/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明制備的納米金和EPOR修飾電極的電化學(xué)生物傳感器與未經(jīng)納米金修飾電極的電化學(xué)生物傳感器的檢測(cè)結(jié)果相比，具有更寬的線性范圍和更低的檢出限。最后說(shuō)明的是，以上 優(yōu)選實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.基于納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極，其特征在于:所述電極是在沉積納米金的電極表面通過(guò)ZnO溶膠-凝膠固定促紅細(xì)胞生成素受體作為識(shí)別元件，再在電極表面沉積納米金的玻碳電極。
2.權(quán)利要求1所述基于納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: a.將玻碳電極表面打磨，拋光，清潔，干燥，得預(yù)處理玻碳電極，備用； b.將步驟a所得預(yù)處理玻碳電極浸入HAuCl4溶液中，電沉積，清洗，得沉積納米金的玻碳電極，備用； c.將乙酸鋅溶于無(wú)水乙醇中，再在超聲波作用下加入氫氧化鋰，得ZnO溶膠-凝膠溶液，備用； d.將步驟c所得ZnO溶膠-凝膠溶液與促紅細(xì)胞生成素受體溶液混勻，滴加至步驟b所得沉積納米金的玻碳電 極表面，干燥成膜，洗滌，即制得促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極； e.將步驟d所得促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極再次浸入HAuCl4溶液中，電沉積，清洗，最后浸入BSA溶液中封閉非特異性位點(diǎn)，得納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述步驟a是用均相砂紙打磨玻碳電極，然后依次用加有0.3 μ m和0.05 μ m三氧化二招的濕潤(rùn)拋光紙拋光,每次拋光后用水洗凈，再依次于硝酸、丙酮和水中超聲洗滌，干燥備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述步驟b是將步驟a所得預(yù)處理玻碳電極浸入濃度為l-20mmol/L的HAuCl4溶液中，電沉積20-100秒，然后用水清洗，備用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于:所述步驟b是將步驟a所得預(yù)處理玻碳電極浸入濃度為lOmmol/L的HAuCl4溶液中，電沉積60秒，然后用水清洗，備用。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述步驟c是將乙酸鋅溶于無(wú)水乙醇中制成濃度為0.lmol/L的溶液，再在超聲波作用下加入氫氧化鋰至終濃度為0.067mol/L，制得ZnO溶膠-凝膠貯備液，臨用前用無(wú)水乙醇按體積比為2: f 1:3進(jìn)行稀釋，制得ZnO溶膠-凝膠溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述步驟d是將步驟c所得的ZnO溶膠-凝膠溶液與濃度為10ng/l7l00yg/L的促紅細(xì)胞生成素受體溶液按照體積比為4:Γ1:1.15混合均勻，再將混合液滴加在步驟b所得沉積納米金的玻碳電極表面，空氣中干燥，用磷酸鹽緩沖液充分洗滌，制得促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極。
8.根據(jù)權(quán)利要求2-7任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于:所述步驟e是將步驟d所得促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極再次浸入濃度為l-20mmol/L的HAuCl4溶液中，電沉積10-50秒，清洗，最后浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的BSA溶液中I小時(shí)，封閉非特異性位點(diǎn)，得納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極。
9.促紅細(xì)胞生成素和重組人促紅細(xì)胞生成素電化學(xué)生物傳感器，其特征在于:包括工作電極、對(duì)電極、參比電極和測(cè)試底液；所述工作電極為權(quán)利要求1所述的納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極，對(duì)電極為鉬電極，參比電極為飽和甘汞電極；所述測(cè)試底液為含有 2mmol/L K3 [Fe (CN)6]和 2mmol/L K4[Fe (CN)6]且 pH 為 6.2 9.0 的磷酸鹽緩沖液。
10.利用權(quán)利要求9所述的電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)促紅細(xì)胞生成素和/或重組人促紅細(xì)胞生成素的方法，其特征在于，將納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極與樣品溶液共孵育20分鐘以上，然后以納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極為工作電極、鉬電極為對(duì)電極、飽和甘汞電極為參比電極、含有2mmol/L K3[Fe (CN)6]和2mmol/L K4[Fe (CN)6]且pH為6.2^9.0的磷酸鹽緩沖液為測(cè)試底液構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器，采用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描測(cè)定，電位掃描范圍為-0.3V、.7V，電位掃描速率為10 mv/s lOOmv/s，根據(jù)電位.0.14V~0.17V處的峰電流和促紅細(xì)胞生成素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中促紅細(xì)胞生成素的濃度，和/或根據(jù)電位0.06V~0.09V處的峰電流和重組人促紅細(xì)胞生成素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中重組人促紅細(xì)胞生成素的濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開了基于納米金和促紅細(xì)胞生成素受體修飾的電極，具體是在沉積納米金的電極表面通過(guò)ZnO溶膠-凝膠固定促紅細(xì)胞生成素受體作為識(shí)別元件，再在電極表面沉積納米金的玻碳電極；該電極的制備方法簡(jiǎn)單、性能穩(wěn)定；以該電極為工作電極、鉑電極為對(duì)電極、飽和甘汞電極為參比電極、含有2mmol/LK3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6]的磷酸鹽緩沖液為測(cè)試底液組建電化學(xué)生物傳感器，可以快速、特異、靈敏地檢測(cè)促紅細(xì)胞生成素(EPO)和/或重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)，特別適用于極低濃度EPO或rhEPO的檢測(cè)，而且適用于體育競(jìng)技中對(duì)興奮劑rhEPO的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N27/48GK103175879SQ20131007843
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月12日
發(fā)明者張立群, 王云霞, 府偉靈 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院