專利名稱：一種抗IgA抗體檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)療器械領(lǐng)域，尤其涉及抗IgA抗體檢測(cè)技術(shù)，特別是一種針對(duì)IgA缺乏者、自身免疫性疾病患者篩查抗IgA試劑盒。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中，有采用放射免疫技術(shù)、凝膠卡技術(shù)來(lái)進(jìn)行抗IgA抗體檢測(cè)的方法，這些方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求高，有放射污染，操作復(fù)雜，需特殊配套儀器，成本昂貴，不適合針對(duì)獻(xiàn)血者、患者進(jìn)行篩查檢測(cè)，不利于推廣應(yīng)用?，F(xiàn)有技術(shù)中存在抗IgA抗體檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)室要求高、對(duì)檢測(cè)人員有危險(xiǎn)的技術(shù)問(wèn)題。IgA是一種免疫球蛋白，在血清總免疫球蛋白中含量為1(Γ15%。根據(jù)其α鏈的不同，可以分為IgAl和IgA2兩個(gè)亞類。IgA2亞類有兩種同種異型A2m (I)和A2m (2)，A2m (I)多見(jiàn)于白種人，A2m (2)多見(jiàn)于黑人和東方人種。目前由泛美免疫缺陷歐洲免疫缺陷協(xié)會(huì)(Pan-American Group for Immunodeficiencyand the European Society forImmunodeficiencies)定義4歲以上人群血清中免疫球蛋白IgG和IgM含量正常，免疫球蛋白IgA含量低于0.07g/L，為IgA缺乏癥(IgAD)。IgA缺乏是人類最常見(jiàn)的免疫缺陷。獻(xiàn)血者人群發(fā)生率因種族人群而異。在美國(guó)健康獻(xiàn)血者中比例約1/328，西班牙1/163，白種人一般為1/600，日本人約為1/18500，中國(guó)人約為1/2000左右。 自身免疫性疾病的患者IgA缺乏頻率更高。作為受血者，IgA缺乏癥者IgA含量低于0.07g/L,當(dāng)他們接觸了含有IgA的血液制品就有可能產(chǎn)生特異性抗IgA抗體，今后有過(guò)敏輸血反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。作為獻(xiàn)血者，他們可以成為稀有血型IgA缺乏者庫(kù)的獻(xiàn)血者，為同樣是IgA缺乏的患者提供不含有IgA的血液成分。IgA缺乏癥常被認(rèn)為是患者反復(fù)呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)感染的潛在風(fēng)險(xiǎn)，這種感染會(huì)更加劇患者惡化成吸收不良、過(guò)敏和自身免疫性疾病的傾向。IgA可引起輸血免疫反應(yīng)，25-30%的IgA缺乏癥患者受到免疫刺激后，可產(chǎn)生抗IgA抗體，可以和包括IgAl和IgA2的免疫球蛋白反應(yīng)。歐洲人IgA缺乏者中有高達(dá)42%有抗IgA抗體，種族地域差異較大。若輸入含有IgA的血液或血液制品，則會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫性輸血反應(yīng)，甚至威脅患者生命。還有部分IgA缺乏者產(chǎn)生的抗IgA抗體并不是輸血和懷孕等免疫刺激產(chǎn)生的，當(dāng)他們肌肉注射IgG后也會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重反應(yīng)，這是由于許多免疫球蛋白制備時(shí)超過(guò)95%是IgG，但還是會(huì)混有一定量的IgA。并非只有IgA缺乏的人會(huì)產(chǎn)生抗IgA抗體，有很少部分血清IgA含量正常的獻(xiàn)血者也會(huì)發(fā)現(xiàn)有特異性抗IgA抗體，這些抗體大多為抗IgAl和抗IgA2兩個(gè)亞類,或同種異型(抗IgA2m⑴或抗IgA2m(2))兩個(gè)亞類?？笽gA引起的輸血后過(guò)敏反應(yīng)輕重不一，重度可發(fā)生過(guò)敏性休克和死亡，嚴(yán)重威脅患者的生命。IgA輸血過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率大約為1:20，000-47，000，占輸血相關(guān)性死亡的3.1%。我國(guó)近年來(lái)已有多篇關(guān)于抗IgA輸血反應(yīng)的報(bào)道。但至今,抗IgA過(guò)敏性輸血反應(yīng)發(fā)生率還沒(méi)有可靠的評(píng)估，因?yàn)樵\斷未標(biāo)準(zhǔn)化，大多數(shù)嚴(yán)重過(guò)敏性輸血反應(yīng)患者缺乏實(shí)驗(yàn)室檢查與隨訪。我國(guó)缺乏對(duì)IgA缺乏患者的檢測(cè)、缺乏對(duì)IgA缺乏癥患者體內(nèi)是否含有抗IgA抗體的鑒定，更缺乏提供IgA陰性的血液或血液制品。所以目前我國(guó)IgA缺乏癥患者，特別是體內(nèi)含有抗IgA的患者輸血存在很大風(fēng)險(xiǎn)。基于抗IgA抗體引起輸血免疫反應(yīng)的嚴(yán)重性，對(duì)于有過(guò)敏性輸血反應(yīng)病史和實(shí)驗(yàn)室確診有抗IgA抗體的患者輸血必須慎重，必須輸注經(jīng)確認(rèn)的不含IgA抗原的血漿或血小板。若在緊急輸血且無(wú)IgA陰性的血液或血液制品時(shí),可考慮采用去除IgA (〈1.2Pg/ml)的靜脈免疫球蛋白，或采用經(jīng)多次洗滌后的紅細(xì)胞，以減低IgA過(guò)敏反應(yīng)再次發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN101661035A公開(kāi)了一種IgA缺乏者篩查試劑盒，由試劑和盒體構(gòu)成，所述的試劑由樣品稀釋液、抗體稀釋液、洗板液、封閉液、終止液、包被抗體、酶標(biāo)二抗、人IgA抗原標(biāo)準(zhǔn)品、TMB組成，該發(fā)明的IgA的檢測(cè)試劑盒可以應(yīng)用于臨床醫(yī)療單位及血站的常規(guī)血液檢測(cè)，為IgA缺乏癥患者減少輸血風(fēng)險(xiǎn)，提高了輸血的安全性。但是這一專利是用于檢測(cè)患者或獻(xiàn)血者血清中是否缺乏IgA抗原，而關(guān)于一種檢測(cè)患者或獻(xiàn)血者血清中是否含有抗IgA抗體的抗IgA抗體檢測(cè)試劑盒目前還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種抗IgA抗體檢測(cè)試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:一種抗IgA抗體檢測(cè)試劑盒，由試劑和盒體構(gòu)成，所述的試劑放置在盒體中，所述的試劑由樣品稀釋液、包被緩沖液、洗板液、封閉液、顯色液、終止液、包被抗原、酶標(biāo)二抗、抗IgA ( + )標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照組成；所述的樣品稀釋液是磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液的濃度在0.08 0.12 mol/L之間，磷酸鹽緩沖液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯，所述的聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯在磷酸鹽緩沖液中的重量百分比在0.04 0.06%之間；所述的包被緩沖液是碳酸鹽緩沖液，碳酸鹽緩沖液的濃度在0.04 0.06 mol/L之間；所述的洗板液是磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液的濃度在0.08 0.12 mol/L之間，磷酸鹽緩沖液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯，所述的聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯在磷酸鹽緩沖液中的重量百分比在0.04
0.06%之間；所述的封閉液是磷酸鹽緩沖液，所述的磷酸鹽緩沖液的濃度在0.08 0.12mol/L之間，磷酸鹽緩沖液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯和牛血清白蛋白，所述的聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯在磷酸鹽緩沖液中的重量百分比在0.04 0.06%之間，所述的牛血清白蛋白在磷酸鹽緩沖液的重量百分比在0.1 1.0%之間；所述的顯色液是磷酸酶底物緩沖液中，加入對(duì)硝基苯磷酸二鈉，所述的對(duì)硝基苯磷酸二鈉的濃度在0.5 2g/L之間；所述的終止液是氫氧化鈉，所述的氫氧化鈉的濃度在2 4mol/L之間；所述的包被抗原為定量人IgA,濃度為3-15mg/ml ;所述的酶標(biāo)二抗是磷酸酶標(biāo)記兔抗人抗體；所述的陰性對(duì)照為抗IgA抗體陰性血清，所述的陽(yáng)性對(duì)照為抗IgA抗體陽(yáng)性血清。所述的包被抗原，即IgA抗原標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法包括以下步驟:
(1)將正常人血清rpm20000-30000，l-2h，4°c離心，并用 0.01M-0.05M pH 7.2-PH7.4PBS稀釋1-2倍后通過(guò)protein G親和柱進(jìn)行親和層析；0.0IM-0.05M pH 7.2-PH7.4 PBS緩沖液平衡約5-10倍柱床體積，大部分IgG吸附于柱上；
(2)0.3ml-0.8ml/min流速緩慢上樣，收集穿過(guò)液,將其進(jìn)行protein A親和層析，0.01M-0.05M pH 7.2-PH7.4 PBS緩沖液平衡約5_10倍柱床體積；恒流泵控制洗脫流速，緩慢0.1M-0.5M pH 2.0-PH4.0甘氨酸-鹽酸緩沖液洗脫5_10倍柱床體積得到富含IgA的洗脫液；收集并用1- 1/10體積的1M-2M pH 8.0-PH10.0 Tris-HCl緩沖液中和；用
0.0IM-0.05M pH 7.2-PH7.4 PBS緩沖液平衡5-10倍柱床體積再生；
(3)將洗脫液通過(guò)superdex 200凝膠過(guò)濾，分部收集，測(cè)定OD28tl值選取峰值，即可除去雜質(zhì)，得到純化的IgA。所述的樣品稀釋液和洗板液的pH值在7-7.4之間。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于:
1、本發(fā)明的抗IgA抗體的檢測(cè)試劑盒可以用于臨床醫(yī)療單位及血液中心、中心血站的常規(guī)血液檢測(cè)，檢測(cè)血液樣品是否含有抗IgA抗體；
2、為患者提供輸血服務(wù)，若患者體內(nèi)含有抗IgA抗體，則提供臨床合適的血液制品(SPIgA缺乏的血液制品)進(jìn)行配合性輸注，提高輸血安全，減少輸血風(fēng)險(xiǎn)。


附圖1是96孔板反應(yīng)格局。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明是一種針對(duì)獻(xiàn)血者和患者檢測(cè)抗IgA抗體的檢測(cè)試劑盒，特別是IgA缺乏者和自身免疫性疾病患者。所述的試劑盒由試劑和盒體構(gòu)成，所述的試劑放置在盒體中。所述的試劑由樣品稀釋液、包被緩沖液、洗板液、封閉液、顯色液、終止液、包被抗原、酶標(biāo)二抗、抗IgA ( + )標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照組成。所述的樣品稀釋液是磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液的濃度在0.08 0.12 mol/L之間，磷酸鹽緩沖液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯，所述的聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯在磷酸鹽緩沖液中的重量百分比在0.04 0.06%之間；
所述的包被緩沖液是碳酸鹽緩沖液，碳酸鹽緩沖液的濃度在0.04 0.06 mol/L之
間；
所述的洗板液是磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液的濃度在0.08 0.12 mol/L之間，磷酸鹽緩沖液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯，所述的聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯在磷酸鹽緩沖液中的重量百分比在0.04 0.06%之間；
所述的封閉液是磷酸鹽緩沖液，所述的磷酸鹽緩沖液的濃度在0.08 0.12 mol/L之間，磷酸鹽緩沖液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯和牛血清白蛋白，所述的聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯在磷酸鹽緩沖液中的重量百分比在0.04 0.06%之間，所述的牛血清白蛋白在磷酸鹽緩沖液的重量百分比在0.1 1.0%之間；
所述的顯色液是磷酸酶底物緩沖液中，加入對(duì)硝基苯磷酸二鈉，所述的對(duì)硝基苯磷酸二鈉的濃度在0.5 2g/L之間；
所述的終止液是氫氧化鈉；
所述的氫氧化鈉的濃度在2 4mol/L之間；
所述的包被抗原為定量人IgA (3-15mg/ml)；所述的酶標(biāo)二抗是磷酸酶標(biāo)記兔抗人抗體。所述的陰性對(duì)照為抗IgA抗體陰性血清，所述的陽(yáng)性對(duì)照為抗IgA抗體陽(yáng)性血清。在本試劑盒中，樣品稀釋液的作用是將樣品血清1:100-1000稀釋。包被緩沖液的作用是讓包被抗原穩(wěn)定吸附于微量反應(yīng)板。洗板液的作用是將未結(jié)合的抗原、抗體及蛋白洗脫。封閉液的作用是封閉(blocking)固相上的空余間隙，防止結(jié)果假象的發(fā)生。包被抗原的作用是將抗原于微量反應(yīng)板上；顯色液的作用是使底物對(duì)硝基苯磷酸二鈉經(jīng)堿性磷酸酶催化后變色，使陽(yáng)性孔變色為黃色。終止液的作用是終止堿性磷酸酶與對(duì)硝基苯磷酸二鈉的催化作用，使反應(yīng)液變?yōu)辄S色。酶標(biāo)二抗的作用一是與固相于微量板上特異性的抗原抗體復(fù)合物Fe端結(jié)合，二是是標(biāo)記的堿性磷酸酶與底物催化反應(yīng)，反應(yīng)液變黃色?？笽gA(+ )標(biāo)準(zhǔn)品的作用是建立此實(shí)驗(yàn)的定量參比，所有樣品與之比對(duì)定量。陽(yáng)性對(duì)照的作用主要判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否有效、穩(wěn)定的依據(jù)。陰性對(duì)照的作用是不含有抗IgA的人血清，以指示待測(cè)樣品的基準(zhǔn)水平。本試劑盒的工作原理是:利用固定于酶標(biāo)板上的IgA抗原決定簇和酶標(biāo)二抗Fe端分別與樣品中被檢測(cè)抗體分子上Fe端結(jié)合，形成固相抗原-抗體-酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物。由于反應(yīng)系統(tǒng)中固相抗原和酶標(biāo)抗體的量相對(duì)于待測(cè)抗體是過(guò)量的，因此復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗體的含量成正比(在方法可檢測(cè)范圍內(nèi))。測(cè)定復(fù)合物中的酶作用與加入底物后生成的有色物質(zhì)量(0D值)，即可確定待測(cè)抗體含量。本發(fā)明解決的技術(shù)難題:
1.本發(fā)明利用酶標(biāo)記的抗抗體(抗人免疫球蛋白A抗體)以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體抗IgA。抗原的純度是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵步驟。本發(fā)明將抗原兩次純化，以提高試驗(yàn)的特異性。特別是除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì)。試驗(yàn)中發(fā)生的假陽(yáng)性反應(yīng)，本發(fā)明用高速離心法(rpm20000-30000，l-2h，4°C )，將沉降系數(shù)大的來(lái)自人血漿或人體組織的抗原Ig去除，抗原中若含有與酶標(biāo)抗人Ig反應(yīng)的物質(zhì)以及一些無(wú)關(guān)蛋白，也會(huì)因競(jìng)爭(zhēng)吸附而影響包被效果，需去除。然后進(jìn)行親和層析，使IgA抗原高度純化，徹底除去IgG、IgM的干擾，保證實(shí)驗(yàn)的特異性。2.患者或獻(xiàn)血者血清中受檢的特異性抗IgA只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強(qiáng)，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時(shí)也可吸附到包被抗原的表面。因此在抗原包被后本發(fā)明用封閉液(含無(wú)關(guān)蛋白質(zhì):牛血清白蛋白)再包被一次，以封閉(blocking)固相上的空余間隙，防止假陰性結(jié)果的發(fā)生。3.過(guò)高的陰性本底影響結(jié)果的判斷。本發(fā)明在檢測(cè)過(guò)程中對(duì)待檢樣本血清先行稀釋(1:40 1:200)，以避免本底的干擾。4.一些異種抗IgA抗體，像兔、山羊、綿羊、或小鼠來(lái)源的，鏈接堿性磷酸酶理論上都可以作為酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的二抗。本發(fā)明選用市售商用單克隆兔抗人IgA (重鏈特異性)，二抗的濃度也是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗抗體結(jié)合，固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢 抗體的量正相關(guān)。磷酸酶標(biāo)記的兔抗人IgA過(guò)多或過(guò)少都將干擾實(shí)驗(yàn)的正確判讀。本發(fā)明以不同梯度稀釋二抗，尋找最佳反應(yīng)濃度1:10(Γ1:1000，避免假陰性及假陽(yáng)性的結(jié)果產(chǎn)生。需要說(shuō)明的是，雖然中國(guó)專利文獻(xiàn)CN101661035A公開(kāi)了一種IgA缺乏者篩查試劑盒，可以應(yīng)用于臨床醫(yī)療單位及血站的常規(guī)血液檢測(cè)，為IgA缺乏癥患者減少輸血風(fēng)險(xiǎn)，提高了輸血的安全性。但是這一專利是用于檢測(cè)患者或獻(xiàn)血者血清中是否缺乏IgA抗原，若使用該篩查試劑盒檢測(cè)出患者或獻(xiàn)血員為IgA缺乏，則進(jìn)一步地使用本發(fā)明的抗IgA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)有否抗體的存在，將為這一部分稀有血型人群的輸血降低輸血反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)施例1 IgA抗原標(biāo)準(zhǔn)品(包被抗原)的制備方法
1.將正常人血清 rpm20000-30000, l_2h，4°C離心，并用 0.0IM-0.05M pH 7.2-PH7.4PBS稀釋1-2倍后通過(guò)protein G親和柱進(jìn)行親和層析。0.01M-0.05M pH 7.2-PH7.4 PBS緩沖液平衡約5-10倍柱床體積，大部分IgG吸附于柱上。2.0.3ml-0.8ml/min流速緩慢上樣,收集穿過(guò)液,將其進(jìn)行protein A親和層析，0.01M-0.05M pH 7.2-PH7.4 PBS緩沖液平衡約5_10倍柱床體積。恒流泵控制洗脫流速，緩慢0.1M-0.5M pH 2.0-PH4.0甘氨酸-鹽酸緩沖液洗脫5_10倍柱床體積得到富含IgA的洗脫液，其中可能還含有少量其他抗體成分(少量IgM和IgG等)。收集并用1- 1/10體積的 1M-2M pH 8.0-PH10.0 Tris-HCl 緩沖液中和。用 0.01M-0.05M pH 7.2-PH7.4 PBS 緩沖液平衡5-10倍柱床體積再生。3.將洗脫液通過(guò)superdex 200凝膠過(guò)濾,分部收集,測(cè)定OD28tl值選取峰值,即可除去雜質(zhì)，得到純化的IgA。IgA抗原標(biāo)準(zhǔn)品沒(méi)有現(xiàn)成的市售商品，卻是本實(shí)驗(yàn)的基本保障，是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵第一步。雖然血清純化有很多方法，親和層析是一種手段。本發(fā)明采用二次親和層析，先用protein G，再用protein A，純化的IgA不含IgM和IgG，絕對(duì)避免因免疫球蛋白G、M、A競(jìng)爭(zhēng)吸附而影響包被等檢測(cè)實(shí)驗(yàn)效果。實(shí)施例2 實(shí)驗(yàn)步驟:
1.使用包被緩沖液將IgA抗原標(biāo)準(zhǔn)品稀釋100-1000倍，每孔加入稀釋后IgA IOOul0
4°C孵育過(guò)夜。2.用洗板液洗板4次。扣干后加入封閉液200ul/孔。37°C水浴30min后,再洗板3次扣干，4°C低溫保存。平底板每孔加入經(jīng)稀釋的抗IgA ( + )標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和待測(cè)血清100ul，37°C水浴I小時(shí)。待測(cè)血清重復(fù)4孔復(fù)本，對(duì)照重復(fù)2孔復(fù)本。3.將孔內(nèi)液體甩干，使用洗板液洗板5次，扣干，每孔加入用稀釋液100-1000倍稀釋的酶標(biāo)二抗IOOu 1，37°C水浴I小時(shí)。4.將孔內(nèi)液體甩干，使用洗板液洗板5次，扣干，每孔加入顯色液lOOul，
暗室反應(yīng)15分鐘,后加入終止液終止反應(yīng)進(jìn)行。5.酶標(biāo)儀405nm讀取結(jié)果。6.反應(yīng)結(jié)果:96孔板反應(yīng)格局(附圖1)。樣品f 13分別是13個(gè)測(cè)試者的待測(cè)血清樣品。結(jié)果判讀:
OD值>100%標(biāo)準(zhǔn)OD值為強(qiáng)陽(yáng)性；
OD值在50 100%標(biāo)準(zhǔn)OD值之間為陽(yáng)性；
OD值在15 50%標(biāo)準(zhǔn)OD值之間為弱陽(yáng)性；
OD值〈15%標(biāo)準(zhǔn)OD值為陰性。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種抗IgA抗體檢測(cè)試劑盒，由試劑和盒體構(gòu)成，所述的試劑放置在盒體中，其特征在于，所述的試劑由樣品稀釋液、包被緩沖液、洗板液、封閉液、顯色液、終止液、包被抗原、酶標(biāo)二抗、抗IgA ( + )標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照組成；所述的樣品稀釋液是磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液的濃度在0.08 0.12 mol/L之間，磷酸鹽緩沖液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯，所述的聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯在磷酸鹽緩沖液中的重量百分比在0.04 0.06%之間；所述的包被緩沖液是碳酸鹽緩沖液，碳酸鹽緩沖液的濃度在0.04 0.06 mol/L之間；所述的洗板液是磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液的濃度在0.08 0.12mol/L之間，磷酸鹽緩沖液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯，所述的聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯在磷酸鹽緩沖液中的重量百分比在0.04 0.06%之間；所述的封閉液是磷酸鹽緩沖液，所述的磷酸鹽緩沖液的濃度在0.08 0.12 mol/L之間，磷酸鹽緩沖液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯和牛血清白蛋白，所述的聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯在磷酸鹽緩沖液中的重量百分比在0.04 0.06%之間，所述的牛血清白蛋白在磷酸鹽緩沖液的重量百分比在0.1 1.0%之間；所述的顯色液是磷酸酶底物緩沖液中，加入對(duì)硝基苯磷酸二鈉，所述的對(duì)硝基苯磷酸二鈉的濃度在0.5 2g/L之間；所述的終止液是氫氧化鈉，所述的氫氧化鈉的濃度在2 4mol/L之間；所述的包被抗原為定量人IgA，濃度為3_15mg/ml ；所述的酶標(biāo)二抗是磷酸酶標(biāo)記兔抗人抗體；所述的陰性對(duì)照為抗IgA抗體陰性血清，所述的陽(yáng)性對(duì)照為抗I gA抗體陽(yáng)性血清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的包被抗原，即IgA抗原標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法包括以下步驟: (1)將正常人血清rpm20000-30000，l-2h，4°C離心，并用 0.01M-0.05M pH 7.2-PH7.4PBS稀釋1-2倍后通過(guò)protein G親和柱進(jìn)行親和層析；0.0IM-0.05M pH 7.2-PH7.4 PBS緩沖液平衡約5-10倍柱床體積，大部分IgG吸附于柱上； (2)0.3ml-0.8ml/min流速緩慢上樣，收集穿過(guò)液,將其進(jìn)行protein A親和層析，0.01M-0.05M pH 7.2-PH7.4 PBS緩沖液平衡約5_10倍柱床體積；恒流泵控制洗脫流速，緩慢0.1M-0.5M pH 2.0-PH4.0甘氨酸-鹽酸緩沖液洗脫5_10倍柱床體積得到富含IgA的洗脫液；收集并用1-1/10體積的1M-2M pH 8.0-PH10.0 Tris-HCl緩沖液中和；用0.0IM-0.05M pH 7.2-PH7.4 PBS緩沖液平衡5-10倍柱床體積再生； (3)將洗脫液通過(guò)superdex200凝膠過(guò)濾，分部收集，測(cè)定OD28tl值選取峰值，即可除去雜質(zhì)，得到純化的IgA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的樣品稀釋液和洗板液的PH值在7-7.4之間。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗IgA抗體檢測(cè)試劑盒，由試劑和盒體構(gòu)成，所述的試劑放置在盒體中，所述的試劑由樣品稀釋液、包被緩沖液、洗板液、封閉液、顯色液、終止液、包被抗原、酶標(biāo)二抗、抗IgA(+)標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照組成。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明的抗IgA抗體的檢測(cè)試劑盒可以用于臨床醫(yī)療單位及血液中心、中心血站的常規(guī)血液檢測(cè)，檢測(cè)血液樣品是否含有抗IgA抗體；為患者提供輸血服務(wù)，提供合適的血液制品進(jìn)行配合性輸注，提高輸血安全，減少輸血風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/53GK103197053SQ20131008382
公開(kāi)日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月15日
發(fā)明者陸萍, 凌冰, 李睿書(shū), 劉達(dá)莊 申請(qǐng)人:上海市血液中心