專利名稱：一種高靈敏度葡萄糖生物傳感器及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及一種生物傳感器及其制備方法，屬于電分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
葡萄糖是有機(jī)體內(nèi)極為重要的一種物質(zhì)，近年來(lái)檢測(cè)葡萄糖含量的文獻(xiàn)已經(jīng)很多，但是他們很多檢測(cè)對(duì)象都是血清，組織液和細(xì)胞液等。廣泛應(yīng)用于檢測(cè)葡萄糖的方法很多，如分光光度法，熒光檢測(cè)，化學(xué)發(fā)光法，電化學(xué)分析法等，而且這些方法都已被成功用于毛細(xì)管電泳檢測(cè)葡萄糖。電化學(xué)分析方法靈敏度高，樣品用量少，儀器簡(jiǎn)單，價(jià)格相對(duì)便宜，因此得到了廣泛的應(yīng)用。近年來(lái)用電化學(xué)方法檢測(cè)葡萄糖的很多，電化學(xué)方法檢測(cè)葡萄糖通常是利用葡萄糖脫氫酶或者是葡萄糖氧化酶，制成酶生物傳感器。酶生物傳感器是將酶作為生物敏感基元，通過(guò)各種物理、化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換器捕捉目標(biāo)物與敏感基元之間的反應(yīng)所產(chǎn)生的與目標(biāo)物濃度成比例關(guān)系的可測(cè)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物定量測(cè)定的分析儀器。與其它分析方法相比，電化學(xué)生物傳感器具有便攜、成本低、靈敏度高、穩(wěn)定性良好等優(yōu)點(diǎn)，再加上CNTs本身的催化和增敏效應(yīng)，使得基于CNTs的酶生物傳感器具有廣闊的應(yīng)用前景?；瘜W(xué)修飾電極是目前最活躍的電化學(xué)和電分析化學(xué)的研究領(lǐng)域之一，賦予電極某種特定的性質(zhì)，可以高選擇性的進(jìn)行所期望的反應(yīng)，克服了未修飾電極測(cè)定時(shí)出現(xiàn)的過(guò)電位偏高，反應(yīng)速度慢等缺點(diǎn)，甚至可以用來(lái)檢測(cè)沒(méi)有電活性的物質(zhì)，在分析化學(xué)領(lǐng)域尤其是在生物傳感器的制備方面得到了廣泛的應(yīng)用。常用的化學(xué)修飾電極有Hg修飾微電極，化學(xué)修飾碳糊微電極，微金屬顆粒修飾微電極，表面分子膜修飾微電極，粉末微電極，酶電極等?，F(xiàn)有技術(shù)中有將Ti02-MWNTs_CS的混合物修飾在玻碳電極上，然后再將普魯士藍(lán)電沉積在修飾電極的表面，最后將葡萄糖氧化酶和金納米顆粒吸附在普魯士藍(lán)上制成的葡萄糖生物傳感器檢測(cè)葡萄糖的含量的(Zhang Μ.H., Yuan R.，Chai Y.Q.，LiW.J., Zhong H.A., Wang C.Glucose biosensor based on titanium dioxide-multiwallcarbon nanotubes-chitosan composite and functionalized gold nanoparticles[J].Bioprocess Biosyst.Eng.，2011，34:1143-1150.)。有將 Pt 和 Pd 納米顆粒通過(guò)電沉積的方法固定在MWCNTs制成葡萄糖生物傳感器檢測(cè)葡萄糖的，(Cui H.F, Ye J.S，Zhang W.D, LiC.Mj Luong J.H.T.，Sheu F.S.Selective and sensitive electrochemical detectionof glucose in neutral solution using platinum - lead alloy nanoparticle/carbonnanotube nanocomposites [J].Analytica Chimica Acta2007, 594:175-183.)。文獻(xiàn)(ReitzE，Jia Wj Gentile Mj Wang Yj Lei Y.CuO Nanospheres Based Nonenzymatic GlucoseSensor [J].Electroanalysis, 2008，20:2482.)中把CuO納米球固定在玻碳電極上，固定上Nafion膜制備成一個(gè)無(wú)酶生物傳感器。這些生物傳感器要么制備方法復(fù)雜，要么靈敏度、穩(wěn)定性不夠好
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)不足而提供一種高靈敏度葡萄糖生物傳感器及其制備方法，該方法簡(jiǎn)單易作，制得的傳感器靈敏度高，檢測(cè)限低，抗干擾能力強(qiáng)。本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:—種高靈敏度葡萄糖生物傳感器，包括鍍鈀鉬電極、分布在鍍鈀鉬電極表面并交成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的碳納米管、及電極與碳納米管所負(fù)載的葡萄糖氧化酶。一種高靈敏度葡萄糖生物傳感器的制備方法，包括步驟如下:(I)將打磨好的鉬電極置于K2PdCl4與硫酸的混合溶液中，電沉積電位設(shè)為-0.1到-0.5V (vs.SCE),電沉積10-15S,沖洗、晾干得鈕納米顆粒修飾的鉬電極；(2)配制酶溶液:將葡萄糖氧化酶和牛血清白蛋白溶于磷酸鹽緩沖溶液中，然后再加入戊二醛溶液和酸處理過(guò)的單壁碳納米管溶液，將此酶溶液混合均勻待用；葡萄糖氧化酶在酶溶液中的濃度908U/mL (根據(jù)葡萄糖氧化酶的活性為109U/mg，相當(dāng)于8.3mg/mL)，葡萄糖氧化酶和牛血清白蛋白的質(zhì)量比為1:1-10，戊二醛在酶溶液中的濃度為8-10mg/mL,磷酸鹽緩沖溶液pH6.0 8.0，酸處理過(guò)的單壁碳納米管溶液在酶溶液中的濃度為
0.2-1.0mg/mL ；(3)將鈀納米顆粒修飾的鉬電極在酶溶液中蘸取3-5次，每次蘸取時(shí)間為10 15s0步驟(I)所述的K2PdC14與硫酸的混合溶液中，K2PdC14濃度為lX10_3mol/L，H2SO4濃度為0.5mol/L。所述的電沉積優(yōu)選電位設(shè)為-0.2V (vs.SCE),電沉積15s。步驟(2)所述的酸處理過(guò)的單壁碳納米管溶液的制備方法將每克單壁碳納米管加入400mL6mol/L硝酸中加熱回流6_6.5h，冷卻后過(guò)濾，用二次蒸餾水洗至中性，放入烘箱中干燥，然后用二次蒸餾水將其配制成濃度為10mg/mL的水溶液.。磷酸鹽緩沖溶液是0.2754 2.1202g Na2HPO4.12H20 與 0.0517 0.8553gNaH2PO4.2H20配制在250mL的容量瓶中配成。本發(fā)明通過(guò)電化學(xué)沉積在鉬電極表面形成很規(guī)則有序的排列的鈀顆粒，鍍鈀的鉬電極表面有許多多孔結(jié)構(gòu)，這種多孔的結(jié)構(gòu)增大了電極的比表面積，增加了酶在電極表面的負(fù)載量，從而使催化活性點(diǎn)大量增加，促進(jìn)了電子的轉(zhuǎn)移速率，提高了電流響應(yīng)的靈敏度。電極的表面較為平整，傳感器表面的碳納米管交聯(lián)在一起，形成了一個(gè)巨大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)有利于電子的傳導(dǎo)，碳納米管大的比表面積也增大了酶在電極表面的負(fù)載量，對(duì)提高電流響應(yīng)靈敏度有一定的貢獻(xiàn)。傳感器表面的鈀納米顆粒和碳納米管有促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移的作用，增大電極的比表面積，增強(qiáng)催化活性，提高了檢測(cè)靈敏度。利用此生物傳感器中酶的高選擇性而避免了其它物質(zhì)的干擾實(shí)現(xiàn)了人體血液中葡萄糖的快速和準(zhǔn)確的檢測(cè)。同時(shí)本發(fā)明傳感器葡萄糖的檢測(cè)限為5X10_7mOl/L，檢測(cè)限低。本發(fā)明具有電極制作、修飾方法簡(jiǎn)單，靈敏度高，穩(wěn)定性好，比其它電化學(xué)檢測(cè)葡萄糖方法的檢測(cè)限低的特點(diǎn)。


圖1為本發(fā)明鍍鈀鉬電極的掃描電化學(xué)顯微鏡圖。圖2為本發(fā)明葡萄糖生物傳感器的掃描電化學(xué)顯微鏡圖。圖3為本發(fā)明毛細(xì)管電化學(xué)檢測(cè)葡萄糖的裝置圖。
圖4為本發(fā)明毛細(xì)管電化學(xué)檢測(cè)葡萄糖的檢測(cè)池。圖5為本發(fā)明干擾物質(zhì)混合樣的電泳譜圖，a_DA(0.2mM)，b_葡萄糖(0.6mM),c_半胱氨酸(0.5mM)，d-AA (0.5mM)，e_UA (0.8mM)。圖6為本發(fā)明標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定人血清中葡萄糖的電泳譜圖，a.0, b.0.6mmol/L葡萄糖，c.1.0mmol/L葡萄糖。其中，1、工作電極，2、參比電極，3、對(duì)電極，4、石英玻璃毛細(xì)管，5、參比池，6、檢測(cè)池，7連接管，8、高壓電源，9、進(jìn)樣系統(tǒng)，10、收集系統(tǒng)，11、檢測(cè)池，12、毛細(xì)管，13、負(fù)極，14、正極。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1為最佳實(shí)施例(I)鈀納米顆粒修飾的鉬電極的制備:將一直徑為200 μ m,長(zhǎng)度大約為5cm的鉬絲穿入一段約為3cm長(zhǎng)的石英毛細(xì)管(250 μ m 1.D., 375 μ m0.D.)中，使石英毛細(xì)管兩端同時(shí)露出鉬絲，將其一端涂滿環(huán)氧樹(shù)脂膠，從另外一端緩慢抽回，使鉬絲剛好露至毛細(xì)管端口，并使之充滿環(huán)氧樹(shù)脂膠，24h后，待膠固化。截取一段5cm的銅絲，在金相砂紙上打磨平滑，將露在外面的鉬絲纏繞到銅絲上，在纏繞處涂滿導(dǎo)電銀膠，放在烘箱中70°C下烘30min，最后再用一個(gè)約5cm長(zhǎng)的玻璃管(400 μ m 1.D., 700 μ m 0.D.)放在鉬絲和銅絲接口處，用環(huán)氧樹(shù)脂膠粘住玻璃管的兩端，晾24小時(shí)后即可使用。用細(xì)金相砂紙將電極打磨平滑，使得鉬絲截面與毛細(xì)管截面平齊，將打磨好的鉬電極分別在二次水、無(wú)水乙醇、二次水中各超聲5min，清洗好的鉬電極置于含IX 10_3mol/L K2PdCl4的0.5mol/L H2SO4的混合液中，電沉積電位設(shè)為-0.2V (vs.SCE),電沉積15s。電沉積完成后，用二次水將工作電極沖洗干凈，得到鈀納米顆粒修飾的微電極，室溫環(huán)境下自然晾干。(2)配制酶溶液:配制酶溶液:將葡萄糖氧化酶和牛血清白蛋白溶于磷酸鹽緩沖溶液中，然后再加入戊二醛溶液和酸處理過(guò)的單壁碳納米管溶液，將此酶溶液混合均勻待用；葡萄糖氧化酶和牛血清白蛋白的質(zhì)量比為1:5，葡萄糖氧化酶在酶溶液中的濃度為
8.3mg/mL,戊二醛在酶溶液中的濃度為9mg/mL，磷酸鹽緩沖溶液的濃度0.025mol/L, pH為
7.4，磷酸鹽緩沖溶液的是 1.8131g Na2HPO4.Iffi2O 與 0.1853g NaH2PO4.2H20 配制在 250mL的容量瓶中，酸處理過(guò)的單壁碳納米管溶液在酶溶液中的濃度為0.5mg/mL ；(3)將鈀納米顆粒修飾的鉬電極在酶溶液中蘸取3次，每次蘸取時(shí)間為10 15s。圖1和圖2分別為鍍鈀鉬電極和葡萄糖生物傳感器的掃描電鏡圖。從圖1中可以看出，電化學(xué)沉積在鉬電極表面的鈀納米顆粒很有序的排列在鉬電極表面，促進(jìn)了電子的轉(zhuǎn)移速率，提高了電流響應(yīng)的靈敏度。從圖2中可以看出，電極的表面較為平整，傳感器表面的碳納米管交聯(lián)在一起，形成了一個(gè)巨大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)有利于電子的傳導(dǎo)，碳納米管大的比表面積也增大了酶在電極表面的負(fù)載量，對(duì)提高電流響應(yīng)靈敏度有一定的貢獻(xiàn)。實(shí)施例2改變步驟(2)中葡萄糖氧化酶和牛血清白蛋白的質(zhì)量比分別為1:1，1:3，1:8，1:10，其他步驟同實(shí)施例1。
實(shí)施例3改變步驟(2)中酸處理過(guò)的單壁碳納米管溶液在酶溶液中的濃度分別為0.2mg/mL,0.8mg/mL, 1.0mg/mL,其他步驟同實(shí)施例1。實(shí)施例4改變步驟(2)中戍二醒在酶溶液中的濃度為4mg/mL, 13mg/mL, 17mg/mL,其他步驟同實(shí)施例1。毛細(xì)管電泳安培檢測(cè)葡萄糖( I)儀器自組裝毛細(xì)管電 泳系統(tǒng)，0_30kV高壓電源(山東師范大學(xué)儀器廠，濟(jì)南)；分離毛細(xì)管(25μ 1.D,375ym 0.D，長(zhǎng)度60cm，永年銳灃色譜器件有限公司)；CHI832b電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；過(guò)濾器(0.20μπι，頗爾公司)；三電極體系:飽和甘汞電極(參比電極)、鉬電極(對(duì)電極)、鈀納米顆粒修飾微電極作電極)金相砂紙(砂紙WA W5 (06)，上海砂輪廠，上海)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，江蘇)；石英亞沸高純水蒸餾器(金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠，江蘇)；高速離心機(jī)(金壇市醫(yī)療儀器廠，江蘇)。(2)檢測(cè)的方法步驟及最佳條件檢測(cè)方法步驟:使用實(shí)施例1的葡萄糖傳感器，用毛細(xì)管之前，分別用氫氧化鈉溶液、二次水、緩沖溶液清洗，然后利用三維操縱儀將處理好的毛細(xì)管與工作電極對(duì)齊，將高壓調(diào)到18kV，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，看基線電流是否平穩(wěn)，如果基線電流平穩(wěn)后，再將高壓調(diào)到5kV，把配置好的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣10s，調(diào)電壓為18kV，開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到電泳圖進(jìn)行分析。最佳檢測(cè)條件:分離電壓為18kV、檢測(cè)電壓-0.8V、緩沖溶液的濃度為0.025mol/L, pH 為 7.4。重現(xiàn)性和檢測(cè)限在上述檢測(cè)方法和最佳檢測(cè)條件下，對(duì)I X 10_3mol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)行10次平行測(cè)定，葡萄糖峰電流和遷移時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別是3.8%和1.4%。在此實(shí)驗(yàn)條件下，當(dāng)信噪比S/N=3時(shí)，葡萄糖的檢測(cè)限為5X 10_7mol/L。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)操作，電極制作，修飾方法簡(jiǎn)單，靈敏度高，穩(wěn)定性好，比其它電化學(xué)檢測(cè)葡萄糖方法的檢測(cè)限低。表I毛細(xì)管電泳電化學(xué)檢測(cè)葡萄糖所用工作電極、線性范圍、檢測(cè)限對(duì)比
權(quán)利要求
1.一種高靈敏度葡萄糖生物傳感器，其特征是，包括鍍鈀鉬電極、分布在鍍鈀鉬電極表面并交成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的碳納米管、及電極與碳納米管所負(fù)載的葡萄糖氧化酶。
2.一種高靈敏度葡萄糖生物傳感器的制備方法，其特征是，包括步驟如下: (O將打磨好的鉬電極置于K2PdCl4與硫酸的混合溶液中，電沉積電位設(shè)為-0.1到-0.5V,電沉積10-15S,沖洗、晾干得鈕納米顆粒修飾的鉬電極； (2)配制酶溶液:將葡萄糖氧化酶和牛血清白蛋白溶于磷酸鹽緩沖溶液中，然后再加入戊二醛溶液和酸處理過(guò)的單壁碳納米管溶液，將此酶溶液混合均勻待用；葡萄糖氧化酶和牛血清白蛋白的質(zhì)量比為1:1-10，葡萄糖氧化酶在酶溶液中的濃度8.3mg/mL,戊二醛在酶溶液中的濃度為8-10mg/mL，磷酸鹽緩沖溶液pH6.0 8.0，酸處理過(guò)的單壁碳納米管溶液在酶溶液中的濃度為0.2-1.0mg/mL ； (3)將鈀納米顆粒修飾的鉬電極在酶溶液中蘸取3-5次，每次蘸取時(shí)間為10 15s。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高靈敏度葡萄糖生物傳感器的制備方法，其特征是，步驟(I)所述的K2PdCl4與硫酸的混合溶液中，K2PdCl4濃度為I X 10^3mol/L, H2SO4濃度為0.5mol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高靈敏度葡萄糖生物傳感器的制備方法，其特征是，所述的電沉積選電位設(shè)為-0.2V,電沉積15s。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高靈敏度葡萄糖生物傳感器的制備方法，其特征是，步驟(2)所述的酸處理過(guò)的單壁碳納米管溶液的制備方法將每克單壁碳納米管加入400mL6mol/L硝酸中加熱回流6_6.5h,冷卻后過(guò)濾，用二次蒸餾水洗至中性，放入烘箱中干燥，然后用二次蒸餾水將其配制成濃度為10mg/mL的水溶液.。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高靈敏度葡萄糖生物傳感器的制備方法，其特征是，磷酸鹽緩沖溶液是每 0.2754 2.1202g Na2HPO4.Iffi2O 加 0.0517 0.8553g NaH2PO4.2H20在250mL的容量瓶中定容制得。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高靈敏度葡萄糖生物傳感器及其制備方法，將打磨好的鉑電極置于K2PdCl4與硫酸的混合溶液中電沉積得鈀納米顆粒修飾的鉑電極，將葡萄糖氧化酶和牛血清白蛋白溶于磷酸鹽緩沖溶液中，然后再加入戊二醛溶液和酸處理過(guò)的單壁碳納米管溶液混合得酶溶液，將鈀納米顆粒修飾的鉑電極在酶溶液中蘸取，得到葡萄糖生物傳感器。本發(fā)明具有電極制作、修飾方法簡(jiǎn)單，靈敏度高，穩(wěn)定性好，比其它電化學(xué)檢測(cè)葡萄糖方法的檢測(cè)限低的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N27/416GK103175884SQ20131008717
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月18日
發(fā)明者王曉蕾, 馬艷芳, 李玲君, 劉冬菊, 王軍 申請(qǐng)人:山東師范大學(xué)