專利名稱：肺癌的診斷分析法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過使用體液樣品來早期檢測出肺癌的分析法、方法和試劑盒。尤其是，本發(fā)明涉及通過評估例如自身抗體生物標(biāo)記的一個或一組標(biāo)記的存在而檢測肺癌。
背景技術(shù)：
對于美國和許多其它國家的男人和婦女，肺癌是癌癥死亡的主要原因。僅在美國，此病致死數(shù)量已經(jīng)在過去五年中每年遞增至接近164，000,其中大多死于非小細(xì)胞性肺癌(NSCLC)。這超過了乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸直腸癌的死亡量總和。許多專家相信，肺癌的早期檢出是提高存活率的關(guān)鍵。研究表明，當(dāng)在早期、非轉(zhuǎn)移期檢出此病，可用外科手術(shù)去除癌，五年存活率可達(dá)85%。但在癌已經(jīng)轉(zhuǎn)移到其它器官尤其是遠(yuǎn)端部位后，存活率急劇下降，只有2%的患者存活五年。不幸地是，肺癌是異質(zhì)性疾病并且通常是無癥狀的，直至達(dá)到晚期。因此，僅有15%的肺癌患者在早期、非轉(zhuǎn)移期被發(fā)現(xiàn)。于是，對于能幫助對無癥狀人員進(jìn)行篩選，進(jìn)而在最早期最能治療期檢測出肺癌的工具有強(qiáng)烈的需求。已經(jīng)研究，胸部X射線和計算機(jī)斷層掃描(CT)是檢測早期肺癌的潛在的篩選工具。不幸的是，高昂費用和高比例的假陽性使得這些放射成像工具的廣泛應(yīng)用是不切實際的。例如，美國國家癌癥研究所(U.S.National Cancer Institute)的一份近期研究作出結(jié)論，用胸部X射線篩選肺癌能檢測出早期肺癌，但是產(chǎn)生許多假陽性檢驗結(jié)果，導(dǎo)致不必要的繼續(xù)檢驗，Oken 等人 Journal of the National Cancer Institute, 97 (24) 1832-1839，2005。在參加該試驗接受X射線的67，000名患者中，將近6，000名(9%)的結(jié)果不正常，需要隨訪。在這些人中，僅 有126人(X射線結(jié)果不正常的6，000名患者的2% )在首次胸部X射線檢驗后12個月內(nèi)被診斷為肺癌。正在進(jìn)行的采用CT掃描的試驗遇到了類似的假陽性問題?；诓淮_定的射線成像結(jié)果的數(shù)量，計算出的CT篩選的特異性大約是65%。當(dāng)對每次進(jìn)行的CT篩選掃描所檢測出的癌癥患者的數(shù)量進(jìn)行評估時，專家非常關(guān)注單個人保健費用的節(jié)省，因為發(fā)生的保健費用中的一大部分可歸因于在普遍掃描中發(fā)現(xiàn)的需要進(jìn)一步研究的不確定的肺部結(jié)節(jié)的數(shù)量，其中許多最后發(fā)現(xiàn)是良性的。PET掃描是另一種可選擇的診斷方法，但是PET掃描價格昂貴，通常不適合用于篩選方案。目前，年齡和吸煙史是在大型篩選研究中已被用作選擇標(biāo)準(zhǔn)的僅有的兩個風(fēng)險因素。能檢測出射線照相學(xué)上明顯的癌癥患者(> 0.5cm)以及隱匿性的和癌變前的癌癥患者(射線照相檢測的極限值以下)的血液檢驗將鑒別個體，對于這些個體輻射學(xué)篩選是最可靠的并且事實上將減少需要進(jìn)一步研究的良性肺部發(fā)現(xiàn)的數(shù)量。因此很明顯，急需克服上述射線照相技術(shù)的局限性的改進(jìn)的肺癌篩選和檢測工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明可用于全面肺癌篩選策略，尤其是當(dāng)與射線照相成像和其它篩選形式一起使用時。本發(fā)明可用來富集群體，用于進(jìn)一步射線照相分析以排除可能存在的肺癌。簡言之，本發(fā)明涉及一種檢測出患者可能存在肺癌的方法，其中一個實施方案是通過提供患者的血液樣品，并分析該患者血液樣品存在一個或一組與肺癌相關(guān)的自身抗體。該小組是可鑒別的，例如通過評估與小組成員相關(guān)的癌癥的最大可能性。各種各樣的統(tǒng)計工具中的任何一個可用來估計多種變量對于結(jié)果的同時貢獻(xiàn)。

本發(fā)明的第一方面涉及一種用于選擇患者進(jìn)行肺癌放射照相檢驗的方法，其包括:(a)從所述患者提供液體樣品；(b)確定在所述樣品中與肺癌相關(guān)的標(biāo)記的存在；以及(C)選擇在所述樣品中具有所述標(biāo)記的放射照相檢驗患者。在一些實施方案中，所述標(biāo)記可以是自身抗體。在一些實施方案中，所述患者可以是無癥狀的。在一些實施方案中，所述患者可以是沒有放射照相可檢測的肺癌的高危患者。在一些實施方案中，所述標(biāo)記可在所述患者存在放射照相可檢測的肺癌前達(dá)五年就表達(dá)了。本發(fā)明的第二方面涉及一種包括肺癌標(biāo)記的組合物，其中所述標(biāo)記是一種分子的結(jié)合配偶體，在所述患者存在放射照相可檢測的肺癌前達(dá)五年所述分子就存在于患者的液體樣品中。在一些實施方案中，在所述樣品中的所述分子可以是自身抗體。在一些實施方案中，所述組合物可包括珠子。在一些實施方案中，所述組合物可包括膜。在一些實施方案中，所述組合物可包括平面。本發(fā)明的第三方面涉及一種分析設(shè)備，其包括根據(jù)本發(fā)明的第二方面所描述的組合物。在一些實施方案中，所述設(shè)備可包括微陣列。本發(fā)明的第四方面涉及一種檢測受試者中可能存在的肺癌的方法，其包括以下步驟:(I)從所述受試者提供樣品；并且(2)分析所述樣品對于至少兩個與肺癌相關(guān)的標(biāo)記的存在；其中(a)肺癌可能在所述受試者中存在，如果所述標(biāo)記的至少一半在所述樣品中存在；或者(b)肺癌可能在所述受試者中存在，只要(i)獲得與所述樣品中所述至少兩個標(biāo)記的每個標(biāo)記的存在相關(guān)的歸一化值，
(ii)合計所述歸一化值以得出總和；并且(iii)比較所述總和及參考值，所述參考值是所述至少兩個標(biāo)記的最大肺癌預(yù)測值，所述總和是所述參考值的至少30%。在一些實施方案中，所述至少兩個標(biāo)記可為自身抗體。在一些實施方案中，所述方法可包括至少三個標(biāo)記。在一些實施方案中，所述方法可包括至少四個標(biāo)記。在一些實施方案中，所述方法可包括至少五個標(biāo)記。 在一些實施方案中，所述方法可包括至少六個標(biāo)記。本發(fā)明的第五方面涉及一種診斷設(shè)備，其包括至少兩個肺癌標(biāo)記和固相。在一些實施方案中，所述標(biāo)記可以是自身抗體的表位。在一些實施方案中，所述固相可包括珠子。在一些實施方案中,所述固相可包括膜。在一些實施方案中，所述設(shè)備可包括陣列。本發(fā)明用來分析主要CT篩選試驗所獲得的樣品，把早期和晚期肺癌以及隱匿性疾病同風(fēng)險匹配(risk-matched)對照區(qū)別開。對肺癌存在的預(yù)測，本分析的準(zhǔn)確度為接近90%，并在射線照相檢出肺癌之前五年。本分析可作為篩選檢驗應(yīng)用于無癥狀患者或者高風(fēng)險組的患者，他們使用公認(rèn)的檢驗和方案尚未診斷出肺癌，也就是，例如他們沒有在射線照相上可檢測出的肺癌。相對于高昂費用和低特異性的現(xiàn)有的肺癌篩選方法，如胸部X射線或低劑量CT，本發(fā)明提供另一種可選擇的方法。本分析使癌癥檢出率最大化，同時限制檢測需要進(jìn)一步確診的良性肺部結(jié)節(jié)，因此本分析是有效的、價格可取的工具，可輕易地并入全面的早期檢測策略。有了下述說明和所附的權(quán)利要求，將更好理解這些及其它本發(fā)明的特點、方面和優(yōu)點。詳細(xì)描述病理狀態(tài)的早期診斷是有益的。然而不是所有的病理狀態(tài)都具有輕易可檢出的、單一標(biāo)志。其它病理狀態(tài)在病原學(xué)和表型上是異質(zhì)性的，或者貫穿其發(fā)育階段。在這樣的情形下，一種單一的、敏感的和特異性的診斷標(biāo)志或標(biāo)記不太可能存在。然而，現(xiàn)在有可能開發(fā)一種采用了多元(plurality)標(biāo)記的合適的診斷分析法，單獨的標(biāo)記可能不具有足夠的預(yù)測能力，但是在某種組合下，實際應(yīng)用中一組標(biāo)記具有足夠的特異性和敏感性。而且，多重技術(shù)和數(shù)據(jù)處理能力賦予了開發(fā)具有使用方便和對界定群體或普通群體更好的預(yù)測能力的、特殊化和個性化的診斷分析法的靈活性。本發(fā)明提供了一種新的檢測疾病如肺癌的分析法和方法，其比傳統(tǒng)方式更早更準(zhǔn)確。簡言之，獲取患者或研究對象的樣品如血液樣品，并分析是否存在一組抗體生物標(biāo)記。對于肺癌，采用一個或一組標(biāo)記，每個標(biāo)記在某種程度上與肺癌相關(guān)，當(dāng)使用一組標(biāo)記時，其中大多數(shù)產(chǎn)生在異質(zhì)性的群體中對肺癌可能性的可預(yù)測的測量。正如下面更詳細(xì)的闡述的，根據(jù)本發(fā)明的分析法和方法正確地鑒別了早期和晚期肺癌患者。鑒別早期肺癌患者是特別有價值的，因為目前的分析法和篩選模式在此方面以強(qiáng)有力和節(jié)省成本 的方式是能力有限的。與目前使用的分析法相比，本篩選分析法提供了更好的可預(yù)測性，產(chǎn)生更少的假陽性，目前使用的分析法通常也是昂貴的。本分析法也是多用途的，通過使用一種能同時測試大量樣品的分析格式，例如采用微陣列，與任一群體相關(guān)的對照樣品可并行地進(jìn)行以獲得高度可信的區(qū)別數(shù)據(jù)，其中多元對照與盡可能多的參數(shù)匹配來檢驗群體。這能校正可能產(chǎn)生的并會混淆結(jié)果的個體差異，例如種族、性別、年齡、多樣性等。定義此處使用的下述術(shù)語應(yīng)該具有下述意義?！胺伟笔侵阜蝺?nèi)的惡性過程、狀態(tài)和組織?！暗鞍踪|(zhì)”是肽、寡肽或多肽，該術(shù)語此處可互換使用，是一種氨基酸聚合物。在文庫方面，多肽不必編碼具有生物活性的分子。所關(guān)心的抗體結(jié)合表位或抗原決定簇。表位是完整功能分子的部分，在蛋白質(zhì)的方面，可包括少到大約三個至大約五個連續(xù)的氨基酸?！皹?biāo)準(zhǔn)化”涉及計量或測量的統(tǒng)計學(xué)處理，對觀察結(jié)果的背景和隨機(jī)干擾進(jìn)行校正或調(diào)整以確定該計量、統(tǒng)計或測量是否是真實的反映、響應(yīng)或反應(yīng)結(jié)果，還是不顯著的和隨機(jī)的。“非小細(xì)胞性肺癌”(NSCLC)是肺癌的一種亞型，其占全部肺癌的大約80%，與小細(xì)胞性癌癥相比，后者特點是小的、卵形細(xì)胞，也被稱作燕麥形細(xì)胞癌。包括在NSCLC亞型中的是鱗狀細(xì)胞癌、腺癌以及大細(xì)胞癌?！绑w液”是從人體獲得或源自人體的任何液體樣品，例如血液、唾液、精液、淚液、組織提取物、分泌物、體腔沖洗物、血清、血漿、組織液及類似物，可作檢驗的患者樣品。然而，優(yōu)選的可使用的液體是可在測試前經(jīng)過處理如凈化，例如通過離心分離。體液樣品是一種液體樣品?！把簶悠贰?一般指從個體`獲得的靜脈血的小量的等分部分。血液可經(jīng)過處理，例如采用肝素或EDTA使凝血因子失活，去除血紅細(xì)胞產(chǎn)生血漿樣品?？稍试S血液凝塊，固態(tài)和液相分離，產(chǎn)生血清。所有的這些“處理過的”血液樣品落入此處定義的“血液樣品”的范圍內(nèi)?！氨砦弧笔侵概c抗體結(jié)合的特殊的分子結(jié)構(gòu)。別稱是抗原決定簇。多肽表位可以是3至5個氨基酸那么小?！吧飿?biāo)記”是指因素、指示物、得分、計量、數(shù)學(xué)處理等類似被評價的，以及發(fā)現(xiàn)在結(jié)果的預(yù)測中有用，例如生物實體的當(dāng)前狀態(tài)或?qū)斫】禒顟B(tài)。生物標(biāo)記也稱作標(biāo)記?！靶〗M”是指一系列被編排的標(biāo)記，在分析中它們一起被測量。小組能由2個標(biāo)記、3個標(biāo)記、4個標(biāo)記、5個標(biāo)記、6個標(biāo)記、7個標(biāo)記、8個標(biāo)記、9個標(biāo)記、10個標(biāo)記、11個標(biāo)記、12個標(biāo)記或者更多標(biāo)記組成。在本申請中教導(dǎo)的統(tǒng)計學(xué)處理和分析方法以及其中能應(yīng)用在本發(fā)明的實踐中的提供了在所關(guān)心的分析中對一些有益標(biāo)記的任何標(biāo)記的使用?！敖Y(jié)果”是那些被預(yù)測的或檢測出的?！白陨砜贵w”是指針對包括于病理細(xì)胞如被感染的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的“自體”(自身)蛋白質(zhì)的免疫球蛋白或抗體(該術(shù)語此處可互換使用)。這種情況下對抗腫瘤的抗體來源于個體自身腫瘤，是他/她自身細(xì)胞的基因畸變?！凹訖?quán)和”是指來自單個標(biāo)記的得分的編輯，每個標(biāo)記具有預(yù)測值。具有更高預(yù)測值的標(biāo)記對和的貢獻(xiàn)越大。用于已知的統(tǒng)計范例例如對數(shù)回歸，單個標(biāo)記的相對值是統(tǒng)計衍生的以最大化多變量表式的值。能使用一些市場上可獲得的統(tǒng)計學(xué)軟件包。在更多的因子的公式中例如回歸方程，每個因子的系數(shù)提示那個因子(標(biāo)記)的“加權(quán)”?！敖y(tǒng)計學(xué)顯著性”是指區(qū)別不可能只是與機(jī)會相關(guān)?！皹?biāo)記”是在診斷中評價和使用的因素、指示物、計量、得分、數(shù)學(xué)處理等類似的。標(biāo)記能夠是例如多肽或抗原，或者是能夠結(jié)合抗原的抗體。標(biāo)記也能是結(jié)合配對或結(jié)合配偶體的任何一個，作為實體的結(jié)合配對或結(jié)合配偶體對另一個具有特異性，例如抗體和抗原、激素和受體、配體和配體所結(jié)合的形成復(fù)合物的分子、酶和輔酶、酶和底物等等?！邦A(yù)測標(biāo)記”是指在使用已知技術(shù)檢測到肺癌前已存在的標(biāo)記。因此，在患者以放射照相學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)的癌癥前本分析檢測肺癌特異性自身抗體，例如注意到放射照相學(xué)檢測的癌癥之前5年。這樣的自身抗體是預(yù)測標(biāo)記?！澳繕?biāo)群體”指任何以特殊的標(biāo)記、狀態(tài)、環(huán)境、疾病等為代表的亞系列群體。因此，目標(biāo)群體能是特殊的患者，例如具有特殊形式或階段的肺癌，或吸煙群體。目標(biāo)群體可包括具有一種或多種風(fēng)險因素的人。目標(biāo)群體可包括有可疑檢驗結(jié)果的人，例如肺中存在異常需要進(jìn)一步和更經(jīng)常地監(jiān)測?！胺派湔障嗟摹敝溉魏纬上穹椒?，例如CAT、PET、X射線等?！胺派湔障鄬W(xué)可檢測到的癌癥”指通過放射照相手段診斷或檢測的癌癥。癌癥的存在一般通過組織學(xué)確認(rèn)。“組織樣品”指來自特別組織的樣品。對于液體形式的組織樣品，樣品能是體液或來自液體組織例如血液，或處理過的血液等份。相也與獲得液體的實體組織相關(guān)，例如滲出液、用過的組織培養(yǎng)液、切碎的實體組織的沖洗液等。生物標(biāo)記的選擇

肺癌相關(guān)標(biāo)記能通過任何可以獲得的技術(shù)人員使用的手段來選擇和鑒別，肺癌相關(guān)標(biāo)記例如自身抗體、對其有特異性親和力的蛋白或和其結(jié)合的蛋白。在抗體生物標(biāo)記的情況中，能使用多種基于免疫學(xué)的方法中的任何方法。如本領(lǐng)域已知的，具有結(jié)合特異性的適體(aptamer)、鏡像異構(gòu)適體(spiegelmer)以及類似物也可以代替抗體使用。許多已知的依賴抗體-抗原反應(yīng)的高通量方法能夠在本發(fā)明中使用。來自目標(biāo)群體中個體的分子能與那些來自對照群體的相比以鑒別任何肺癌特異性的分子，例如使用減法挑選等。可選擇地，目標(biāo)群體和正常(對照)群體樣品能用于鑒別來自分子文庫的對目標(biāo)群體特異性的分子。能夠用文庫實行親和篩選形式，用抗體作為探針篩選文庫的候選分子。使用抗體來篩選候選分子也稱為“生物淘洗(biopanning)”。然后驗證目標(biāo)群體-特異性的分子及其使用，確定單個標(biāo)記作為目標(biāo)群體成員的預(yù)測指標(biāo)的能力。一種合適的手段是獲得對肺癌是或不是特異性的分子文庫以及篩選那些文庫尋找結(jié)合目標(biāo)群體成員抗體的分子。因為蛋白或多肽表位能夠是3個氨基酸，也能長度少于10個氨基酸、長度少于20個氨基酸等，文庫的單個成員的平均長度是設(shè)計的選擇。因此，文庫的較小成員能大約3-5個氨基酸以模擬單獨的抗原決定簇，而20個或更多氨基酸的成員可能模擬或包含2個或更多的抗原決定簇。文庫也不需要限制于多肽，因為其它分子例如糖類、脂類、核酸及其組合能是表位，并且因此用作或鑒別肺癌的標(biāo)記。因為生物標(biāo)記鑒別過程尋求鑒別表位而不是完整的蛋白或其它分子，被掃描的或被篩選的文庫不需要是肺癌特異性的，而且能從正常個體分子獲得，或能夠從隨機(jī)分子的群體獲得，雖然使用從肺癌患者得到的樣品能增加鑒別合適的肺癌生物標(biāo)記的可能性。盡管如此，不考慮包含表位的分子的功能，表位或交叉反應(yīng)分子在肺癌患者中存在并且是免疫原性的。那些方法的實例說明在使用T7的肺癌特異性cDNA噬菌體文庫和M13隨機(jī)肽文庫的實施例中描述。如本領(lǐng)域已知的，二者在噬菌體展示文庫中攜帶。一個T7噬菌體NSCLC的cDNA文庫是購買的(Novagen,Madison,WI,USA),第二個是通過腺癌細(xì)胞系NC1-1650構(gòu)建的(受贈于 H.0ie, NCI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)。因此，如本領(lǐng)域已知的建立噬菌體文庫。提取并挑選來自目標(biāo)組織或細(xì)胞的總RNA0進(jìn)行第一條鏈的cDNA的合成，確保對N-末端和C-末端的氨基酸序列都表現(xiàn)。該cDNA產(chǎn)物連接到相容的噬菌體載體以產(chǎn)生文庫。該文庫在合適的細(xì)菌宿主中擴(kuò)增，對于裂解性噬菌體如T7，裂解細(xì)胞得到 制備的噬菌體。在標(biāo)準(zhǔn)條件下滴定裂解液并提純后存貯。對于其它噬菌體，病毒可排出到培養(yǎng)液中如M13的情況，在該情形下收集上清液病毒并滴定。噬菌體文庫用組織樣品進(jìn)行生物淘洗(biopan)或篩選，組織樣品優(yōu)選地是液體樣品如來自肺癌患者的血漿或血清，以及類似的組織樣品，例如來自正常健康供體的血漿或血清，來鑒別被配體識別的潛在的展示分子例如肺癌患者體內(nèi)的循環(huán)抗體。在一種實施方案中，組織樣品是血液樣品如血漿或血清，目的是鑒別標(biāo)記，這些標(biāo)記是被目標(biāo)群體如非小細(xì)胞性肺癌患者的血漿或血清中的抗體所識別的。為了去除被來自該文庫的非目標(biāo)群體的抗體識別的噬菌體，例如將噬菌體顯示文庫暴露于正常血清或血清池。未反應(yīng)的噬菌體從那些與非目標(biāo)群體樣品進(jìn)行反應(yīng)的噬菌體中分離出。然后未反應(yīng)的噬菌體暴露于NSCLC血清來分離被NSCLC患者血清中的抗體識別的噬菌體。收集反應(yīng)的噬菌體，在合適的細(xì)菌宿主中擴(kuò)增，裂解液經(jīng)收集、存貯、確定為“樣品I”或是“生物淘洗I”。生物淘洗和擴(kuò)增過程可重復(fù)多次，通常采用相同的對照和目標(biāo)樣品來提高純化過程。來自生物淘洗的噬菌體代表一種富集群體，它們更可能含有被來自NSCLC患者樣品中的抗體特定識別的表達(dá)分子。由于許多噬菌體文庫表達(dá)多肽，所以選擇的噬菌體可被說成表達(dá)和表現(xiàn)NSCLC相關(guān)抗體的“捕獲肽”。為了進(jìn)一步選擇表達(dá)與NSCLC-特異性抗體結(jié)合的分子的噬菌體集落，生物淘洗中選出的單個曬菌體裂解液可被自動地點放到例如載玻片(Schleicher and SchuelI,Keene,NH)上，米用 Arrayer (Affymetrix, Santa Clara,CA)來制備帶有多個被 NSCLC 患者血清中的抗體結(jié)合的候選的噬菌體-表達(dá)分子的微陣列。為了鑒別哪種噬菌體展示分子可能是NSCLC-特異性捕獲分子(能結(jié)合NSCLC-特異性抗體)，例如將篩選載玻片與單個NSCLC患者血清樣品一起孵育，理想的不是那些在生物淘洗中所使用的，并使用標(biāo)準(zhǔn)免疫分析方法進(jìn)一步篩選。與噬菌體結(jié)合的抗體可被鑒定，如本領(lǐng)域已知，例如通過采用合適的免疫試劑的雙色標(biāo)記，其中噬菌體載體表達(dá)產(chǎn)物用第一種有色或可檢測的報告分子標(biāo)記，來對每個位點的表達(dá)產(chǎn)物計量，與噬菌體表達(dá)多肽結(jié)合的抗體用第二種顏色或區(qū)別于第一種報告分子的可檢測的報告分子標(biāo)記。一種解釋鑒別NSCLC樣品中的抗體結(jié)合的與NSCLC相關(guān)的或NSCLC特異性的捕獲分子的數(shù)據(jù)的實用方法，是通過多變量的計算機(jī)輔助回歸分析，這些多變量顯示載玻片上所有多肽的平均信號和標(biāo)準(zhǔn)偏差。對單個噬菌體進(jìn)行統(tǒng)計處理，來確定特異性，并且對多個噬菌體也進(jìn)行統(tǒng)計處理，來確定是否噬菌體子集對于確定樣品是否來自患有還是可能患有NSCLC的患者，能提供更好的預(yù)測能力。監(jiān)測多個樣品的統(tǒng)計處理能確定分析的差異性。隨著群體取樣增加，這種差異性可用于評價分析間的差異性并提供可靠的群體參數(shù)。因此，與載玻片、芯片等上的其它噬菌體相比，例如，當(dāng)信號是> 1、> 2、> 3或更高的標(biāo)準(zhǔn)差偏離正常值(芯片上的平均信號)時，那些與患者樣品中的抗體結(jié)合更好的噬菌體被考慮作候選噬菌體。在此處所述的一些試驗中，候選噬菌體代表用生物淘洗過四次的T7文庫構(gòu)建的篩選芯片上的噬菌體展示多肽的大1/100。候選的噬菌體集落編排在“診斷芯片”上并進(jìn)一步評價在分辨NSCLC患者的樣品與非NSCLC群體的樣品中獨立預(yù)測值。根據(jù)診斷標(biāo)記對受試者中存在或?qū)泶嬖诜派鋵W(xué)上可檢測的肺癌的預(yù)兆/檢測/鑒別的能力來選擇。由于一些病情有多種病因、多種細(xì)胞源等，以及呈現(xiàn)異質(zhì)背景的任何疾病，一組或多個標(biāo)記更可能預(yù)測或診斷那種特殊病情。肺癌即是一種這樣的病情。如在生物統(tǒng)計領(lǐng)域已知的，能應(yīng)用一些不同的統(tǒng)計方案來確定相關(guān)多重變量的共同預(yù)測能力，例如一組標(biāo)記或與一組標(biāo)記的反應(yīng)性。因此，例如能使用動態(tài)統(tǒng)計模型來解釋來自多個因素的數(shù)據(jù)，來開發(fā)依賴使用兩個或以上這樣因子的預(yù)后檢測。其它方法包括Bayesian模型，使用條件概率、最小二乘法分析、部分最小二乘法分析、對數(shù)多重回歸、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(neural networks)、辨別式分析、基于自由分配等級的分析、其組合、其變量等來選擇一組合適的標(biāo)記用于包括在診斷分析中。目的是處理多元變量，然后處理數(shù)據(jù)來最大化期望的計量，參見例子，例如Pepe&Thompson, Biostatistics 1,123-140, 2000 ；Mclntosh&Pepe, Biometrics 58,657-664, 2002 ；Baker, Biometrics 56,1082-1087,2000 ；DeLong 等人，Biometrics 44,837-845,1988 ；以及 Kendziorski 等人，Biometrics 62,19-27,2006。因此，在某些情況中，統(tǒng)計處理尋求最大化預(yù)測計量，例如接收器工作特性(ROC)曲線的曲線下面積(AUC)。處理得出公式`途徑或算法來最大化依賴于選擇的系列變量的結(jié)果，揭示任何一個或所有變量對最大化的結(jié)果的相對影響。標(biāo)記的相對影響能在描述系數(shù)與變量關(guān)系的衍生公式中看到。因此，從這樣的分析中選出例如在此后描述的實施研究中鑒定的五個標(biāo)記的兩組，通過包含五個標(biāo)記的公式來描述最大AUC、得分，用公式中的任何一個標(biāo)記的相對加權(quán)獲得用那個任何一個變量的系數(shù)來代表的最大預(yù)測能力。系數(shù)代表加權(quán)，衍生公式能看作得出加權(quán)和的被加權(quán)的變量的總和。目標(biāo)是在被選擇的和優(yōu)選地最小的多個變量(標(biāo)記)中找到最大化中的平衡點，例如特異性和敏感性、或陽性預(yù)測值，使得在那些參數(shù)的啟發(fā)下能進(jìn)行機(jī)械化診斷分析。為了最大化結(jié)果，變量的加權(quán)或影響是從目前確定和分析過的數(shù)據(jù)衍生的，并且隨被分析患者的增加重新計算。隨患者數(shù)量增加，代表關(guān)于平均值的可信界限值的群體平均值的計量的可信度也增加。如在此后的實施例中提到的，用實例說明的一組五個標(biāo)記包括具有單個特異性超過觀察到的CT掃描的特異性的標(biāo)記。任何特異性超過65%的任何一個標(biāo)記能有利地作為肺癌的診斷分析，因為本分析法和在肺癌診斷中目前的標(biāo)準(zhǔn)一樣有效，并且產(chǎn)生費用更低，且以一種非侵入的方式。也要注意，無論怎樣的計量，與任何一個標(biāo)記相比，五個標(biāo)記一起使用提供更高的預(yù)測能力。標(biāo)記可能在不同的亞群體中有預(yù)測性，或者兩個或更多標(biāo)記的表達(dá)可能是協(xié)同的，例如它們可能有共同的生物存在或功能?？偤项A(yù)測值不是必須可加的，并且標(biāo)記的不同組合為預(yù)測提供不同的準(zhǔn)確程度。使用最大化預(yù)測力和五個標(biāo)記的組合的統(tǒng)計處理是基于參照群體研究的結(jié)果。因此，原則上，因為兩個或更多標(biāo)記的協(xié)同存在以及基于多元標(biāo)記的診斷的計量，例如此后教導(dǎo)的一組五個標(biāo)記中的一個，患者樣品用五個標(biāo)記進(jìn)行檢驗和診斷，基于五個標(biāo)記進(jìn)行計算。如在此討論的，因為統(tǒng)計處理例如對數(shù)回歸，任何一個變量對多重計量的貢獻(xiàn)可能是對于最大化總和較大或較小的貢獻(xiàn)。如果患者得分、總分等是五個標(biāo)記的總合計量的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%或更多，甚至在患者可能是一個或更多標(biāo)記陰性的情況中，因為一些或更多重要的加權(quán)標(biāo)記是陽性的，則更可能認(rèn)為患者是肺癌陽性的。臨界得分、總分等這些可能是參考或標(biāo)準(zhǔn)值，其可以是群體平均值，患者/實驗樣品的相似度的可接受的水平到分?jǐn)?shù)、總分等得出陽性檢驗結(jié)果，提示肺癌存在的可能性，是設(shè)計的選擇，并且通過提供檢測陽性樣品的可信范圍或水平的統(tǒng)計分析來確定或冒假陽性的危險通過經(jīng)驗開發(fā)。如此前教導(dǎo)的，所述水平能是五個標(biāo)記的總合計量的或群體總和的、參考值等的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%或更多。臨界或“耐受值”即來自群體得分、 總分等的患者得分、總分等的可接受的相似度程度是能夠被增加的，即患者的得分必須十分接近群體得分來增加敏感性。雖然如本領(lǐng)域已知的知道ROC曲線的形狀是預(yù)測值等的相關(guān)考慮因素，但是標(biāo)記或一組標(biāo)記的預(yù)測能力能使用任何統(tǒng)計種類來測量例如特異性、敏感性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、診斷準(zhǔn)確性、例如ROC曲線的AUC，其中ROC曲線是特異性和敏感性間的相互關(guān)系。與單獨使用任何一個標(biāo)記相比，因為一起考慮的多個標(biāo)記的更大的總合預(yù)測能力，多重標(biāo)記的應(yīng)用使更強(qiáng)并且在更大的群體中更可能進(jìn)行診斷的診斷檢驗成為可能。如此后更詳細(xì)討論的，本發(fā)明仔細(xì)考慮了不同分析形式的使用。微陣列使同時檢驗多重樣品成為可能。因此，微陣列能包括一些對照樣品，陽性和陰性的。然后分析法能夠?qū)Χ鄠€樣品進(jìn)行同時處理，例如樣品是來自一個或多個已知感染患者的樣品、以及來自正常人的一個或多個樣品、和一個或多個待一起檢驗和比較的樣品、實驗、病人的樣品、待檢驗的樣品等?？紤]到分析中信號強(qiáng)度的歸一化、校準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)化，在分析中包括內(nèi)部對照。例如，能夠多份運行每個陽性對照、陰性對照和實驗，能系列稀釋多個樣品。對照和實驗點也能隨機(jī)安排在微陣列設(shè)備上以盡量減少由于樣品在檢驗設(shè)備上的位點引起的變化。因此，具有內(nèi)部對照的微陣列或芯片可以同時在微陣列和芯片上診斷實驗(患者)檢驗。以受控方式獲得的這些多元檢驗方法和數(shù)據(jù)使在分析設(shè)備內(nèi)進(jìn)行患者診斷成為可能，因為準(zhǔn)備了合適的對照，并且如果該組標(biāo)記是單個具有高可能預(yù)測能力的，例如ROC曲線的AUC >.85，并且五個標(biāo)記的AUC總和>.95，那么能夠獲得診斷結(jié)果。當(dāng)發(fā)現(xiàn)一組標(biāo)記的每個標(biāo)記都具有相對可比特征例如后面實施例的，則分析能以定性的形式操作。因此，肺癌病人樣品可能對五個標(biāo)記都是陽性，這樣的樣品是十分可能是肺癌陽性的。能通過確定幾率來驗證，基于5個標(biāo)記作為整體，如在此討論的，獲得患者五個標(biāo)記的計量和或得分，然后比較該數(shù)字和標(biāo)記的預(yù)測能力，使用以上討論的統(tǒng)計工具衍生。對四個標(biāo)記是陽性的患者，因為四個標(biāo)記的能力可能是事實的，也應(yīng)該考慮處于危險，能夠用肺癌來診斷和/或應(yīng)該進(jìn)行更細(xì)致的檢查。只對三個標(biāo)記是陽性的樣品可能需要再次檢驗，一個使用其它標(biāo)記的檢驗，放射照相的或其它檢驗，或在其它給定的時間范圍用本分析進(jìn)行另一次檢驗。因此，對于一組η標(biāo)記，衍生了預(yù)測能力公式，例如回歸公式，規(guī)定了解釋五個標(biāo)記對結(jié)果的關(guān)系的最大可能圖?；颊呖赡苌儆讦莻€標(biāo)記是陽性，當(dāng)多數(shù)例如50%或一半以上的標(biāo)記在患者中存在，為進(jìn)一步考慮，在該情況中可認(rèn)為是陽性的或可能是陽性的。病人也應(yīng)該表現(xiàn)肺部疾病潛在癥狀的明顯跡象，因為某些組標(biāo)記可能對特殊的疾病例如NSCLC是特異性的，可能患者需要進(jìn)一步的分析以排除其它肺部疾病。因此，在使用η個標(biāo)記的任何一個分析中，能獲得基于被檢驗的標(biāo)記的陽性信號總數(shù)的整個數(shù)目的首要的、定性的結(jié)果。合理的臨界可能是50%或更多的標(biāo)記陽性。因此，如果檢驗四個標(biāo)記，那么2、3或4個標(biāo)記陽性的樣品假定考慮是可能有肺癌的。如果檢驗五個標(biāo)記，那么3、4或5個標(biāo)記陽性的樣品假定考慮是陽性的。臨界值能根據(jù)設(shè)計選擇而變化?；跀?shù)據(jù)的采集和統(tǒng)計處理，從群體的觀點，優(yōu)選的標(biāo)記組可能是動態(tài)的并且可能隨時間變化，可能隨新的標(biāo)記的開發(fā)而變化，可能隨群體的變化、增長等而變化。同樣，當(dāng)被檢驗的群體大小增加時，標(biāo)記子集的可信度、加權(quán)的系數(shù)以及診斷準(zhǔn)確可能性可以變得更確切，如果標(biāo)記是生物或機(jī)制相聯(lián)系的、因而衍生的，可信區(qū)間或誤差區(qū)間會減小。因而，本發(fā)明也仔細(xì)考慮能在一般群體中使用的標(biāo)記子集的應(yīng)用?？蛇x擇地，關(guān)注的分析設(shè)備可包括僅僅一個標(biāo)記子集，例如在此后實施例中使用的5個標(biāo)記的組，其對某種群體是優(yōu)選的。能夠通過分析噬菌體集落插入片斷編碼的多肽來確定表達(dá)多肽的氨基酸順序。例如噬菌體插入片斷能用市場上可得到的噬菌體載體引物來PCR擴(kuò)增?；诖笮『蚉CR產(chǎn)物酶消化形式的不同來鑒別獨特的集落，并且獨特的PCR產(chǎn)物然后被純化和測序。通過與已知序列相比鑒別 編碼的多肽，已知序列例如使用BLAST搜索程序的GenBank數(shù)據(jù)庫。因此，例如以下的表I和2總結(jié)了在肺癌患者中結(jié)合自身抗體的肺癌cDNA的T7噬菌體集落。表I
噬菌體集落 # ID _基因符號肽序列
PC84*ZNF440^TLE RN HVN VN S VVN PLVILLPI EYl KELTLEKSLMNIRNVGKHFIVPDPIVD
MKGFTWEKRLINVRNVEKHSRVPV
jMFVYMKGPTLGKISMNVSSVGKHY I
權(quán)利要求
1.一種用于減少與針對肺癌的放射照相篩選有關(guān)的假陽性的數(shù)目的組，所述組包含: 至少三種癌癥自身抗原，其能夠測量液體樣品中的自身抗體生物標(biāo)記，所述自身抗體生物標(biāo)記被表明檢測到之前未被檢測到肺癌的異質(zhì)性患者群體的肺癌，其中所述生物標(biāo)記的組共同提供比所述組中的任何一種生物標(biāo)記更大的組合的敏感性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組，其中所述生物標(biāo)記單獨或組合地對肺癌有大于65%的特異性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組，其中所述生物標(biāo)記的組對肺癌有大于70%、大于80%或大于90%的特異性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組，其中所述生物標(biāo)記的組對肺癌有大于30%的敏感性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組，其中所述生物標(biāo)記的組對肺癌有大于40%、大于60%、大于70%、大于80%或大于90%的敏感性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組，其中所述放射照相檢驗是CT檢驗或X射線。
7.—組標(biāo)記在制備用于減少與針對肺癌的放射照相篩選有關(guān)的假陽性的數(shù)目的裝置中的用途，其中所述裝置: a)測量一組基于血液的生物標(biāo)記，其中所述生物標(biāo)記已被表明在患者群體中正確地預(yù)測放射照相手段是否將檢測到肺癌； b)預(yù)測放射照相手段將檢測到肺癌的可能性；并且， c)基于對所述生物標(biāo)記組的檢驗，為放射照相檢驗選擇被推斷為最可能患肺癌的那些患者。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中所述生物標(biāo)記的組對肺癌有超過所觀察到的CT掃描的特異性的特異性。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中所述生物標(biāo)記具有大于65%的特異性。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中所述生物標(biāo)記的組共同提供比所述組中的任何一種生物標(biāo)記更大的組合的敏感性。
11.一種用于早期檢測患者的肺癌的方法，包括: (a)提供一種篩選檢驗,所述檢驗包括: i)從所述患者獲得液體樣品； ii)測量所述樣品中的至少四種生物標(biāo)記，所述至少四種生物標(biāo)記被表明檢測到之前未被診斷為患肺癌的異質(zhì)性患者群體的肺癌，其中所述至少四種生物標(biāo)記作為一個組遍及所述異質(zhì)性群體對肺癌有大于65%的特異性；和 iii)確定所述樣品中至少兩種自身抗體生物標(biāo)記的存在，其中所測量的生物標(biāo)記的存在單獨或組合地對肺癌有大于65%的特異性； (b)為肺癌診斷檢驗選擇對所述至少兩種自身抗體生物標(biāo)記的存在為陽性的患者。
12.一種用于提高CT檢驗檢測肺癌的特異性的方法，包括: (a)提供一種檢驗以選擇用于CT檢驗的患者，其中所述檢驗包括: a.從所述患者獲得液體樣品； b.測量所述樣品中的至少四種癌癥特異性生物標(biāo)記，所述至少四種癌癥特異性生物標(biāo)記被表明檢測到 之前未被診斷為患肺癌的患者群體的肺癌，其中所述生物標(biāo)記對肺癌有大于65%的特異性；C.由所述至少四種所測量的生物標(biāo)記確定所述樣品中至少兩種癌癥特異性自身抗體的存在；和 d.為CT檢驗選擇對所述至少兩種自身 抗體的存在為陽性的患者；(b)對所選擇的患者進(jìn)行CT檢驗，其中對于檢測由通過步驟(a)的檢驗選擇的患者組成的組的肺癌，CT檢驗的特異性大于65%。
全文摘要
一種用于測定患者體內(nèi)存在肺癌的診斷分析法，其部分取決于確定與肺癌相關(guān)的抗體的存在。此分析法在放射照相可檢測到的癌組織的證據(jù)之前預(yù)測肺癌。
文檔編號G01N33/574GK103245784SQ20131009063
公開日2013年8月14日 申請日期2006年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月10日
發(fā)明者愛德華·A·希爾施科維奇, 鐘麗, 納達(dá)·H·卡塔, 阿諾德·J·斯托姆博格 申請人:肯塔基大學(xué)研究基金會