專利名稱:一種基于點擊化學的便攜式檢測銅離子濃度的方法
技術(shù)領域:
本發(fā)明涉及一種基于點擊化學的便攜式檢測銅離子濃度的方法,屬于分析化學領域。
背景技術(shù):
銅是動物體內(nèi)不可缺少的微量兀素(E.Merian, Metals and their compounds inthe environment, VCH, ffeinheim, 1991, p.893.), 1945 年Braude 提出飼料中添加 10 倍動物生理所需求劑量的銅具有促生長作用,能夠明顯改善動物的生長性能,因此銅成為了動物飼料必要添加劑之一。此外,銅還具有抑菌抗微生物的作用,增加飼料中的銅,可增強動物機體的免疫機能(周明榮,王金法,王宗元,邵科明,銅、鋅、錳、硒對肉雞生長性能和血液中某些生理生化指標等影響的研究,1993,24(5),412-422.),有利于抵抗微生物的侵襲。但是添加過量的銅又易引發(fā)一系列的中毒反應。如果人們食用了銅超標的肉類,會引起咳嗽,惡心,腹瀉,還可能造成嚴重腎損害和溶血,甚至會出現(xiàn)黃疸、貧血、肝大、血紅蛋白尿、急性腎功能衰竭等癥狀。
點擊化學(Kolb,H.C.; Finn, M.G.; Sharpless, K.B., Click Chemistry:Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.Angew.Chem 2001, 40,2004-2021.)是在2001年由諾貝爾化學獎獲得者美國化學家Sharpless首先提出的。點擊化學具有模塊化、可靠、高效率、高選擇性、反應條件溫和、產(chǎn)物收率高、副反應少、分離提純簡單等特點,被廣泛應用于環(huán)境、化學及生物醫(yī)學等眾多領域。
目前檢測銅的方法有原子吸收光譜法(Lemos, V.; Novaes, G.; de Carvalho,A.; Gama, E.; Santos, A., Determination of copper in biological samples by flameatomic absorption spectrometry after precipitation with Me-BTAP.EnvironmentalMonitoring and Assessment 2009, 148 (I), 245-253.; emberyova, M.; Bartekova,J.; Zavadska, M.; Sisolakova, M., Determination of bioavailable fractions ofZn, Cu, Ni, Pb and Cd in soils and sludges by atomic absorption spectrometry.Talanta 2007, 71 (4),1661-1668.;鄧世林,李新鳳,郭小林.肝豆狀核變性病人血清和尿中銅的測定及其臨床意義.光譜學與光譜分析,2003,23 (3) ,576-578.),X-射線突光光譜法(Gordeeva, V.P.; Statkus, M.A.; Tsysin, G.1.; Zolotov, Y.A., X-ray fluorescence determination of As, Bi, Co, Cu, Fe, Ni, Pb, Se, Vand Zn in natural water and soil extracts after preconcentration of theirpyrrolidinedithiocarbamates on cellulose filters.Talanta 2003, 61 (3),315-329.),電化學檢測(趙會欣,李毅,蔡巍,郭紅蓀,王平,水環(huán)境痕量重金屬檢測的電化學傳感器的研究.儀表技術(shù)和傳感器,2009(6),158-161.;曾立平,許賀,刑蘇潔,超聲-伏安法對飲用水中痕過量鉛和銅的檢測研究.化學學報,2009, 67 (3),225-230.)等。但是這些方法的一個普遍缺點是需要用到大型的儀器設備,這類儀器設備不但價格昂貴,操作復雜,而且不方便攜帶,無法實現(xiàn)現(xiàn)場檢測。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于點擊化學的便攜式檢測銅離子濃度的方法,該方法以血糖儀為平臺,能夠便攜的、快速、現(xiàn)場檢測銅離子濃度。
本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下: 一種基于點擊化學的便攜式檢測銅離子濃度的方法,按照以下步驟進行: (1)根據(jù)文獻Hermanson, G.T.Bioconjugate Techniques; Elsevier: London,2008中的方法制備濃度為0.3 μ M的修飾有炔基和蔗糖轉(zhuǎn)化酶的DNA化合物; (2)將修飾有鏈霉親和素的磁珠溶于由0.1M NaCU0.1M ρΗ=7.3的PBS、0.05%Tween-20組成的緩沖溶液中,加入0.3 μ M修飾有生物素的DNA,室溫振蕩30± I分鐘,制備修飾在磁珠上的DNA化合物; (3)將步驟(I)與(2)制備的修飾有炔基和蔗糖轉(zhuǎn)化酶的DNA化合物與修飾在磁珠上的DNA化合物以摩爾比1:1混合,加入待測樣品和抗壞血酸鈉,室溫培育1.5±0.5小時; (4 )用磁鐵分離步驟(3 )中的磁珠與混合溶液,用緩沖溶液洗滌磁珠三次,洗滌后的磁珠中加入10 μ L緩沖溶液,再加入20 μ L IM蔗糖溶液,于40°C反應15分鐘; (5)用血糖儀配合血糖儀試紙測定步驟(4)反應后的溶液,記錄數(shù)據(jù); (6)以已知銅離子濃度為橫坐標,其對應的血糖儀讀數(shù)為縱坐標,繪制曲線,得到銅離子濃度和血糖儀讀數(shù)的線性方程,然后根據(jù)待測樣品的血糖儀讀數(shù),計算對應的銅離子濃度。
所述銅離子濃度和血糖儀讀數(shù)的線性方程Y=0.86807+1.660281gX,其中Y為血糖儀讀數(shù),單位為mM ;X為其所對應的銅離子濃度,單位為PM。
步驟(I)中所述的修飾有炔基和蔗糖轉(zhuǎn)化酶的DNA化合物的序列為從左到右5’到3’:炔基-TGTCCGTAGCTAAAAAAAAAAAAA-轉(zhuǎn)化酶。
步驟(2)中所述的修飾有生物素的DNA的序列為從左到右5’到3’:生物素-AAAAAAAAAAAATCACAGATGAGTAGT-疊氮基。
步驟(3)中抗壞血酸鈉的加入量為0.6mM。
上述方法可應用于人體血清樣品中銅離子濃度的檢測。
本發(fā)明具有操作簡單、成本低、靈敏度高、特異性好等優(yōu)點。在I pM到316 pM的濃度范圍內(nèi)對銅離子的檢測呈現(xiàn)良好的線性響應,檢測限可達0.33 pM。
本發(fā)明的顯著優(yōu)點在于: (O 本發(fā)明的兩種修飾DNA合成方法簡單、快速、反應條件溫和、容易控制,得到的DNA化合物具有良好的活性和穩(wěn)定性。
(2)本發(fā)明的操作步驟簡單、便捷、靈敏、成本低而且無毒害,實用性強。
(3)本發(fā)明在識別銅離子的過程中,能快速讀取數(shù)值,有利于對銅離子的檢測。
(4) 本發(fā)明的檢測儀器為血糖儀,儀器小巧方便攜帶,操作簡單快速,特別適用于現(xiàn)場檢測。
圖1為本發(fā)明對銅離子檢測的響應曲線。(A)在不同銅離子濃度時所對應的血糖儀信號,從低到高分別為I ρΜ、3.16 PM、10 ρΜ、31.6 ρΜ、100 ρΜ和316 ρΜ; (B)從I到6為隨著銅離子濃度的增加(1-316 PM),其血糖試紙比色窗顏色的變化。
圖2為本發(fā)明對銅離子檢測的特異性。(A)從左到右為在不同干擾物質(zhì)中所示的血糖儀信號,從左到右分別為銅離子、鉀離子、鈉離子、鎂離子、銀離子、鈣離子、鎳離子和鐵離子;銅離子和所有干擾物質(zhì)的濃度均為I ηΜ ; (B)在不同干擾物質(zhì)中所示的血糖試紙比色窗顏色,從O到7分別為銅離子、鉀離子、鈉離子、鎂離子、銀離子、鈣離子、鎳離子和鐵離子;銅離子和所有干擾物質(zhì)的濃度均為I ηΜ。
具體實施方式
實施例1 1、修飾有炔基和蔗糖轉(zhuǎn)化酶的DNA化合物的合成。參考文獻(Hermanson,G.T.Bioconjugate Techniques; Elsevier: London, 2008)。具體步驟如下: A、將30μ M修飾有巰基的DNA與60 μ M TCEP于PBS緩沖溶液中混合均勻,室溫培育I小時; B、將11.30 mg/mL 蔗糖轉(zhuǎn)化酶與 I mg Sulfo-SMCC 于緩沖溶液(0.1 M PBS, ΡΗ=7.3,0.1 M NaCl)中混合5min,室溫下置于搖床上振動I小時,再將混合物離心分離,取上清液; C、將A與B制備的物質(zhì)混合,室溫下反應48小時。
2、修飾有蔗糖轉(zhuǎn)化酶的磁珠的制備與銅離子的檢測,具體步驟如下: (I)將修飾有鏈霉親和素的磁珠溶于由0.1M NaCU0.1M PH=7.3的PBS、0.05%Tween-20組成的緩沖溶液中,加入0.3μΜ修飾有生物素的DNA,室溫振蕩(30± I)分鐘。
(2)將步驟I與步驟2 (I)制備的0.3μ M修飾有炔基和蔗糖轉(zhuǎn)化酶的DNA化合物與0.3 μ M修飾在磁珠上的DNA化合物以摩爾比1:1混合均勻,加入含銅離子的待測樣品(銅離子濃度從低到高分別為I PM,3.16 ρΜ、10 ρΜ、31.6 ρΜ、100 ρΜ和316 ρΜ)和0.6mM抗壞血酸鈉,室溫培育(1.5±0.05)小時,發(fā)生點擊化學反應,生成三唑化合物。
(3)用磁鐵分離步驟(2)中的磁珠與混合溶液,用由0.1M NaCU0.1M PH=7.3的PBS,0.05% Tween-20組成的緩沖溶液洗滌磁珠三次并向磁珠中加入該緩沖溶液10 μ L,再加入20yL I M蔗糖溶液,于40°C反應15分鐘。
( 4 )用羅氏血糖儀測定步驟(3 )反應后的溶液,記錄血糖儀讀數(shù)。隨著銅離子濃度的增加,其所對應的血糖儀信號也相應增強(血糖儀信號從低到高分別為0.9 mMU.6 mM、2.45 mM、3.4 mM、4.2 mM和5.3 mM。其對應的血糖試紙比色窗顏色變化依次如圖1 (B)所示,從左至右,顏色依次由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色再轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色。以銅離子濃度為橫坐標,其對應的血糖儀讀數(shù)為縱坐標,繪制曲線(圖1);得到銅離子濃度和血糖儀讀數(shù)的線性方程Y=0.86807+1.660281gX,其中Y為血糖儀讀數(shù),單位為mM ;X為其所對應的銅離子濃度,單位為ρΜ。
實施例2 人血清中銅離子濃度的檢測,具體步驟如下: 向0.3 μ M兩種修飾的DNA混合物中加入0.6 mM抗壞血酸鈉和稀釋IO5倍的人血清樣品,室溫培育(1.5±0.05)小時,然后用磁鐵分離混合物,用50 μ L緩沖溶液洗滌磁珠三次并加入10 μ L緩沖溶液,再加入20 μ L IM蔗糖溶液,于40°C反應15分鐘,移取2.5 μ L用血糖儀測量,記錄數(shù)據(jù)。根據(jù)實施例1中得到的銅離子濃度和血糖儀讀數(shù)的線性方程Y=0.86807+1.660281gX,計算得到四組人血清樣品中銅離子濃度分別為19.23 pM、16.74PM、16.74 pM、16.74 ρΜ、16.74 pM。
實施例3 為了檢測本發(fā)明的特異性,將實施例1步驟2中所使用的銅離子換成其他干擾物質(zhì),分別為鉀離子、鈉離子、鎂離子、銀離子、鈣離子、鎳離子和鐵離子,銅離子和其他干擾物質(zhì)的濃度均為I ηΜ。如圖2 (A)所示,從左到右為在不同干擾物質(zhì)中所示的血糖儀信號,從左到右分別為銅離子(6.5 mM)、鉀離子(1.1 mM)、鈉離子(0.9 1111)、鎂離子(1.4 mM)、銀離子(1.8 mM)、鈣離子(2.3禮)、鎳離子(1.4 mM)和鐵離子(1.7 mM),其相對應的血糖試紙比色窗顏色變化如圖2 (B)所示,從O到7分別為銅離子、鉀離子、6.5鈉離子、鎂離子、銀離子、鈣離子、鎳離子和鐵離子,除了 O是明顯的綠色,其余均為黃色。結(jié)果說明本發(fā)明所述方法對銅離子檢測有較好的特異性。
權(quán)利要求
1.一種基于點擊化學的便攜式檢測銅離子濃度的方法,其特征在于:按照以下步驟進行: (1)制備濃度為0.3 μ M的修飾有炔基和蔗糖轉(zhuǎn)化酶的DNA化合物; (2)將修飾有鏈霉親和素的磁珠溶于由0.1M NaCU0.1M ρΗ=7.3的PBS、0.05%Tween-20組成的緩沖溶液中,加入0.3 μ M修飾有生物素的DNA,室溫振蕩30± I分鐘,制備修飾在磁珠上的DNA化合物; (3)將步驟(I)與(2)制備的修飾有炔基和蔗糖轉(zhuǎn)化酶的DNA化合物與修飾在磁珠上的DNA化合物以摩爾比1:1混合,加入待測樣品和抗壞血酸鈉,室溫培育1.5±0.5小時; (4)用磁鐵分離步驟(3)中的磁珠與混合溶液,用緩沖溶液洗滌磁珠三次,洗滌后的磁珠中加入10 μ L緩沖溶液,再加入20 μ L IM蔗糖溶液,于40°C反應15分鐘; (5)用血糖儀配合血糖儀試紙測定步驟(4)反應后的溶液,記錄數(shù)據(jù); (6)以已知銅離子濃度為橫坐標,其對應的血糖儀讀數(shù)為縱坐標,繪制曲線,得到銅離子濃度和血糖儀讀數(shù)的線性方程,然后根據(jù)待測樣品的血糖儀讀數(shù),計算對應的銅離子濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于點擊化學的便攜式檢測銅離子濃度的方法,其特征在于步驟(I)中所述的修飾有炔基和蔗糖轉(zhuǎn)化酶的DNA化合物的序列為從左到右5’到3’:炔基-TGTCCGTAGCTAAAAAAAAAAAAA-轉(zhuǎn)化酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于點擊化學的便攜式檢測銅離子濃度的方法,其特征在于步驟(2)中所述的修飾有生物素的DNA的序列為從左到右5’到3’:生物素-AAAAAAAAAAAATCACAGATGAGTAGT-疊氮基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于點擊化學的便攜式檢測銅離子濃度的方法,其特征在于步驟(3)中抗壞血酸鈉的加入量為0.6mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于點擊化學的便攜式檢測銅離子濃度的方法,其特征在于:所述銅離子濃度和血糖儀讀數(shù)的線性方程Y=0.86807+1.660281gX,其中Y為血糖儀讀數(shù),單位為mM ;X為其所對應的銅離子濃度,單位為PM。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于點擊化學的便攜式檢測銅離子濃度的方法,屬于分析化學領域。在抗壞血酸鈉還原二價銅為一價銅作為催化劑的條件下,使修飾有疊氮基與修飾有炔基的DNA發(fā)生1,3-偶極環(huán)加成反應,從而將修飾有蔗糖轉(zhuǎn)化酶的DNA固定在磁珠上。通過分離磁珠與溶液,并將清洗后的磁珠溶于蔗糖溶液中進行酶解反應,再使用血糖儀測量酶解后的反應溶液,即可檢測銅離子的濃度。該方法以血糖儀為平臺,能夠便攜的、快速、現(xiàn)場檢測銅離子濃度??蓪⒃摲椒☉糜谌梭w血清樣品中銅離子濃度的檢測,本發(fā)明具有操作簡單、成本低、靈敏度高、特異性好等優(yōu)點。
文檔編號G01N21/78GK103163130SQ20131009592
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月25日
發(fā)明者林振宇, 周津, 陳國南, 郭隆華, 邱彬 申請人:福州大學