專利名稱：一種菜用大豆鮮籽粒品質(zhì)¹H NMR評價方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種菜用大豆鮮籽粒品質(zhì)1HNMR評價方法。
背景技術(shù)：
菜用大豆(Glycine max L.)俗稱毛豆，是指在鼓粒期至完熟初期收獲鮮莢食用的專用型大豆品種，其營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)元素，作為蔬菜食用，味道鮮美，深受廣大消費者的喜愛。研究表明，不同品種菜用大豆品質(zhì)差異顯著，因此深入研究不同菜用大豆品種品質(zhì)特性，系統(tǒng)研究不同品種的化學(xué)成分(代謝物)差異，這對于闡釋菜用大豆?fàn)I養(yǎng)差異及其合理利用都具有十分重要的意義。目前，菜用大豆的質(zhì)量控制及評價，主要是運用現(xiàn)代分析技術(shù)(如HPLC、UPLC、HPLC-ES1-MS,CE-ES1-T0F-MS等)或某個營養(yǎng)成分為指標(biāo)進行含量測定或DNA指紋圖譜研究。然而，這些分析方法主要強調(diào)與營養(yǎng)、食味品質(zhì)密切相關(guān)的少數(shù)內(nèi)含物成分的重要性，而忽略了菜用大豆中其他小分子物質(zhì)的影響；DNA指紋圖譜主要用于菜用大豆品種/系和純度的鑒定，卻不直接能反映物質(zhì)代謝差異?；?H-NMR的代謝組學(xué)從代謝物的組成上能夠區(qū)分像引起甜、鮮、酸等口味的化合物成分，應(yīng)用1H-NMR能同時檢測分析初生和次生代謝組分，因此更能體現(xiàn)方法的整體性和系統(tǒng)性，在果蔬品質(zhì)評價中逐漸發(fā)揮著重要的作用，但是利用代謝組學(xué)整體性的方法研究菜用大豆品質(zhì)目前還沒有相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題

本發(fā)明的目的是提供一種菜用大豆鮮籽粒品質(zhì)1HNMR評價方法，通過高頻核磁共振的代謝物組學(xué)技術(shù)，建立菜用大豆鮮籽粒的整體代謝指紋圖譜，并結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法，系統(tǒng)評價不同品種品質(zhì)差異，為菜用大豆質(zhì)量控制與評價、品種鑒別等提供理論依據(jù)。技術(shù)方案本發(fā)明所提供的一種菜用大豆鮮籽粒品質(zhì)1HNMR評價方法，包括如下步驟:I)原料收集:采摘R6-R7期菜用大豆鮮籽粒，快速置于_80°C深冷冰箱低溫冷凍2h 4h，經(jīng)真空冷凍干燥24h 48h、低溫液氮粉碎后，過0.25mm孔徑篩處理作為供試原料。2)樣本制備:a.準(zhǔn)確稱取200mg 500mg粉碎樣品加入體積比50%的甲醇溶液1000 μ L，進行冰水浴超聲提取3s 5s，間歇4s，循環(huán)3次；b.浸提液經(jīng)4°C、13000rpm高速離心IOmin 15min后,取上清液用氮氣吹干,然后置于-80°C深冷冰箱冰凍12h ；c.將冰凍樣品離心抽真空后，加入450 μ LpH7.29的0.lmol/L磷酸緩沖溶液，再加入50 μ L的5mmol/L DSS重水標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋IOs ；d.所得混勻液經(jīng)低溫離心后，取上清液過0.22 μ m濾膜，濾液供核磁共振波譜分析。3) 1HNMR測定條件:觀察頻率:600.13MHz ;頻率內(nèi)鎖:D20 ;測定溫度T:279.93K ;譜寬sw:12019.23Hz ;采樣時間at:4.0s ;脈沖延遲時間dl:1.0s ;采樣次數(shù)nt:32 ;脈沖寬度pw:10 μ s ;脈沖序列=1H-NOESY ;混合時間mixT:0.1s。每次樣本米集時間約為4min。4) 1HNMR信號歸屬及代謝物鑒定:將測得的1H-NMR自由感應(yīng)衰減信號導(dǎo)入ChenomxNMR suit軟件進行傅立葉轉(zhuǎn)換，并輸入DSS的濃度以及每個樣本的pH值等信息。手動調(diào)整相位和基線，以DSS峰(0.0Oppm)為基準(zhǔn)校正譜圖的化學(xué)位移，并進行反轉(zhuǎn)卷積調(diào)整譜圖峰形，數(shù)據(jù)積分后利用Chenomx數(shù)據(jù)庫比對分析，獲得代謝物種類及相應(yīng)濃度。5)基于化學(xué)計量學(xué)方法的代謝組分比較與分析:使用SIMCA-P+軟件對歸一化后的數(shù)據(jù)進行模式識別多變量分析，主成分分析使用中心化換算的數(shù)據(jù)標(biāo)度換算方式，并通過得分圖的形式進行菜用大豆物質(zhì)組成區(qū)分。6)根據(jù)步驟4)圖譜庫檢索的結(jié)果，挑選出70%以上樣品共有峰，建立1HNMR指紋圖譜共有峰數(shù)據(jù)庫，對菜用大豆核磁共振圖譜共有峰數(shù)據(jù)庫進行聚類分析，判定菜用大豆品質(zhì)類別。本發(fā)明方法涉及在菜用大豆品質(zhì)分類、質(zhì)量區(qū)別及品質(zhì)評價中的應(yīng)用。有益效果I)與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明采用高通量、高分辨率的1HNMR代謝組學(xué)技術(shù)，利用不同品種菜用大豆化學(xué)組成差異對菜用大豆品質(zhì)進行評價。該方法表明，不同品種菜用大豆鮮籽粒初級與次級代謝產(chǎn)物組成與含量都有顯著的差異。特別是采用本發(fā)明方法可進行育種、新品種篩選及品質(zhì)評價，建立菜用大豆的核磁共振指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。本發(fā)明方法具有系統(tǒng)、準(zhǔn)確、可靠、高效的特點，結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)對于完善目前的菜用大豆品質(zhì)評價技術(shù)體系具有重要意義。2)本發(fā)明方法從根本上解決了依靠人為感官評定與主要化學(xué)成分分析所帶來的問題:人為感官評定工作量大，且結(jié)果受許多環(huán)境因紊、人的心理因素等制約，有很大的主觀性和隨機性，以及化學(xué)分析雖是菜用大豆品質(zhì)評價的基本方法，但是化學(xué)分析的指標(biāo)有限，菜用大豆作為特色蔬菜佳品，成分十分復(fù)雜，單純的某些化學(xué)組分并不足以反映菜用大豆的內(nèi)在品質(zhì)，在應(yīng)用中有嚴(yán)重的局限性。3)本發(fā)明提供的菜用大豆鮮籽粒品質(zhì)1HNMR評價方法，是一種對成分復(fù)雜樣品也能進行很好的分析的手段，它的整體性和模糊性，既能反映樣本的整體信息，且工作量并不大。更為重要的是它能達(dá)到區(qū)分不同品種，甚至不同產(chǎn)地、不同采收期的菜用大豆。因此，如果采用科學(xué)的方法對菜用大豆指紋圖譜進行表征，就可以實現(xiàn)對菜用大豆品質(zhì)的科學(xué)分類。


圖1為菜用大 豆鮮籽粒的核磁共振氫譜圖。
圖2為不同品種菜用大豆代謝體系差異分析。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但不因此而限制本發(fā)明。
實施例I)原料采集:2012年7月于江蘇省農(nóng)科院六合動物科學(xué)基地試驗田采摘鼓粒末期(R6-R7期)八個不同品種菜用大豆(表I)，取其鮮籽?？焖僦糜赺80°C深冷冰箱低溫冷凍2h，真空冷凍干燥24h，并進行低溫粉碎、過0.25mm孔徑篩處理，獲得原料樣本備用。表I參試材料
權(quán)利要求
1.一種菜用大豆鮮籽粒品質(zhì)1H NMR評價方法，其特征在于包括如下步驟: 1)原料采集:采摘R6-R7期菜用大豆鮮籽粒，快速置于-80°C深冷冰箱低溫冷凍2h 4h，經(jīng)真空冷凍干燥24h 48h、低溫液氮粉碎后，過0.25mm孔徑篩處理作為供試原料。
2)樣本制備: a.準(zhǔn)確稱取200mg 500mg粉碎樣品加入體積比50%的甲醇溶液1000μ L，進行冰水浴超聲提取3s 5s，間歇4s，循環(huán)3次； b.浸提液經(jīng)4°C、13000rpm高速離心IOmin I5min后,取上清液用氮氣吹干,然后置于-80°C深冷冰箱冰凍12h ； c.將冰凍樣品離心抽真空后，加入450μ L ρΗ7.29的0.lmol/L磷酸緩沖溶液，再加入50 μ L的5mmol/L DSS重水標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋IOs ； d.所得混勻液經(jīng)低溫離心后，取上清液過0.22 μ m濾膜，濾液供核磁共振波譜分析。
3) NMR測定條件:觀察頻率:600.13MHz ;頻率內(nèi)鎖=D2O ;測定溫度T:279.93K ;譜寬sw:12019.23Hz ;采樣時間at:4.0s ;脈沖延遲時間dl:1.0s ;采樣次數(shù)nt:32 ;脈沖寬度pw:10 μ s ;脈沖序列^H-NOESY ;混合時間mixT:0.1s。每次樣本采集時間4mmin。
4) NMR信號歸屬及代謝物鑒定:將測得的1H-NMR自由感應(yīng)衰減信號導(dǎo)入ChenomxNMR suit軟件進行傅立葉轉(zhuǎn)換，并輸入DSS的濃度以及每個樣本的pH值等信息。手動調(diào)整相位和基線，以DSS峰(0.0Oppm)為基準(zhǔn)校正譜圖的化學(xué)位移，并進行反轉(zhuǎn)卷積調(diào)整譜圖峰形，數(shù)據(jù)積分后利用Chenomx數(shù)據(jù)庫比對分析，獲得代謝物種類及相應(yīng)濃度。
5)基于化學(xué)計量學(xué)方法的代謝組·分比較與分析:使用SIMCA-P+軟件對歸一化后的數(shù)據(jù)進行模式識別多變量分析，主成分分析使用中心化換算的數(shù)據(jù)標(biāo)度換算方式，并通過得分圖的形式進行菜用大豆物質(zhì)組成區(qū)分。
6)根據(jù)步驟4)圖譜庫檢索的結(jié)果，挑選出70%以上樣品共有峰，建立1HNMR指紋圖譜共有峰數(shù)據(jù)庫，對菜用大豆核磁共振圖譜共有峰數(shù)據(jù)庫進行聚類分析，判定菜用大豆品質(zhì)類別。
2.一種如權(quán)利要求1所述的方法在菜用大豆品質(zhì)分類、質(zhì)量區(qū)別及品質(zhì)評價中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種菜用大豆鮮籽粒品質(zhì)1H NMR評價方法，屬于果蔬品質(zhì)分析領(lǐng)域。它首先對不同品種、不同品質(zhì)的菜用大豆樣品進行低溫液氮粉碎、50％甲醇超聲快速浸提，然后在相同的參數(shù)條件下對樣品提取液進行核磁共振信號采集，對采集得到的圖譜進行反轉(zhuǎn)卷積，通過Chenomx數(shù)據(jù)庫匹配與DSS內(nèi)標(biāo)定量，確定可溶性糖、游離氨基酸、有機酸等系列代謝物的組成及含量，從而明確不同菜用大豆品種的特征，并根據(jù)相應(yīng)的核磁共振氫譜指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，進行模式識別多變量分析，以獲取有效的品質(zhì)區(qū)分與評價結(jié)果。本發(fā)明方法具有全面、準(zhǔn)確、可靠、高效等優(yōu)點。
文檔編號G01N24/08GK103245685SQ20131010087
公開日2013年8月14日 申請日期2013年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月27日
發(fā)明者宋江峰, 吳海虹, 李大婧, 劉春泉, 姜曉青 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院