專利名稱：一種測定脂溶性茶多酚含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化學定量檢測領(lǐng)域，特別涉及一種測定脂溶性茶多酚含量的方法。
背景技術(shù)：
茶多酚(Green Tea Polyphenols，GTP)是茶葉中30多種多羥基酚類化合物的總稱，兒茶素類化合物約占茶多酚含量的65% 80%左右，主要包括:( + )兒茶素[(+ ) Catechin, C],(-)表兒茶素[(_) Epicatechin, EC],(-)沒食子兒茶素[(_)Gallocatechin, GC], (_)表兒茶素沒食子酸酯[(-)Epicatechin Gallate, ECG],(-)表沒食子兒茶素[(-)Epigall0catechin，EGC]，(-)表沒食子兒茶素沒食子酸酯[(-)Epigallocatechin Gallate)，EGCG]六種物質(zhì)，均為黃烷_3醇衍生物。其中EGCG占兒茶素類化合物的50% 60%，在結(jié)構(gòu)、組成、生物活性等方面均為茶多酚的代表性成分。茶多酚是一種性能十分優(yōu)異的純天然抗氧化劑，無毒副作用，具抑制細菌、抗氧化等性能，但茶多酚易溶于水而難溶于脂，因而直接將其用于抗油脂及高脂食品的氧化變質(zhì)便受到很大限制，所以，研究者為了克服茶多酚容易被氧化且脂溶性差等缺點，通過對其化學改性，即在茶多酚上連接脂肪酸，研制出的茶多酚組成中相應(yīng)結(jié)構(gòu)的長鏈脂肪酸酯，該長鏈脂肪酸酯可能是其一酯化、二酯化或多酯化產(chǎn)物，因此脂溶性茶多酚的組成比茶多酚更加復(fù)雜?，F(xiàn)有技術(shù)中有一種在植物油中檢測微量脂溶性茶多酚的方法，該方法首先以沒食子酸乙酯為標準品，采用酒石酸亞鐵比色法，以亞鐵離子為顯色劑，通過茶多酚類能與亞鐵離子形成紫藍色絡(luò)合物，測定脂溶性茶多酚的含量，然后用已知含量的脂溶性茶多酚作為對照品，采用福林酚試劑氧化法，測定植物油中微量脂溶性茶多酚的含量。在實現(xiàn)本發(fā)明的 過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下問題:相對于茶多酚的理化性質(zhì)，脂溶性茶多酚在組成、結(jié)構(gòu)、平均分子量、分子中鄰二酚羥基或連三酚羥基的數(shù)量和與亞鐵離子顯色的強度等均發(fā)生了較大的變化，在這種情況下，上述方法仍然采用沒食子酸乙酯與表沒食子兒茶素沒食子酸酯在相同質(zhì)量下與亞鐵離子顯色物吸光度的比值1.5，而且，上述方法是通過測定酚羥基的含量間接反映脂溶性茶多酚的含量，導(dǎo)致其測定結(jié)果偏低，不能直接得到脂溶性茶多酚的含量，而且該方法較為繁瑣，只適用于微量脂溶性茶多酚的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中不能準確測定脂溶性茶多酚的含量的問題，本發(fā)明實施例提供了一種測定脂溶性茶多酚含量的方法。所述技術(shù)方案如下:本發(fā)明提供了一種測定脂溶性茶多酚含量的方法，所述方法包括以下步驟:將對照品和供試品分別制備成對照品溶液和供試品溶液，所述供試品為脂溶性茶多酚或含有脂溶性茶多酚的制劑，所述供試品溶液的溶劑為有機溶劑，所述對照品為脂溶性茶多酚，所述對照品溶液的溶劑為有機溶劑；
通過分別繪制所述對照品溶液和所述供試品溶液的紫外波長掃描圖，獲得所述對照品溶液和所述供試品溶液的最大吸收波長，并根據(jù)所述最大吸收波長確定檢測波長；繪制所述對照品溶液的標準曲線并計算所述標準曲線的回歸方程；采用紫外分光光度法測定所述供試品溶液的吸光度；將所述供試品溶液的吸光度帶入所述標準曲線回歸方程計算所述供試品中脂溶性茶多酚的含量。具體地，所述脂溶性茶多酚為茶多酚與所述8碳以上的有機脂肪酸的酰鹵或酸酐反應(yīng)得到的產(chǎn)物、或者為所述茶多酚中含有的黃烷-3醇衍生物與所述8碳以上的有機脂肪酸的酰鹵或酸酐反應(yīng)得到的產(chǎn)物。具體地，通過所述供試品溶液的紫外波長掃描圖確定所述供試品溶液的最大吸收波長的方法為:所述供試品為所述脂溶性茶多酚時，將所述脂溶性茶多酚配制成每毫升含有所述脂溶性茶多酚為0.04mg的所述供試品溶液，以所述有機溶劑為參比，在200-400nm波長范圍內(nèi)掃描，得到所述供試品溶液的紫外波長掃描圖，由所述紫外波長掃描圖確定所述供試品溶液的最大吸收波長為275nm。具體地，通過所述供試品溶液的紫外波長掃描圖確定所述供試品溶液的最大吸收波長的方法為:所述供試品為所述含有脂溶性茶多酚的制劑時，取所述制劑適量，精密稱定，置于容器中，加適量所述有機溶劑，充分攪拌，于離心機3600rpm離心30min,分取上清液，并重復(fù)提取3次，合并所述上清液并過濾，將濾液移入容量瓶,用所述有機溶劑定容,配制成每毫升含有所述脂溶性茶多酚為0.04mg的所述供試品溶液，以制備所述供試品溶液的方法制備等質(zhì)量空白制劑提取液作為參比，在200-400nm波長范圍內(nèi)掃描，得到所述供試品溶液的紫外波長掃描圖，由所述紫外波長掃描圖確定所述供試品溶液的最大吸收波長為 275nm。 具體地，通過所述對照品溶液的紫外波長掃描圖確定所述對照品溶液的最大吸收波長的方法為:取所述對照品，用所述有機溶劑溶解，配制成每毫升含有所述對照品為0.04mg的所述對照品溶液，以所述有機溶劑為參比,在200-400nm波長范圍內(nèi)掃描,得到所述對照品溶液的紫外波長掃描圖，由所述紫外波長掃描圖確定所述對照品溶液的最大吸收波長為275nm。具體地，根據(jù)所述對照品溶液與所述供試品溶液的最大吸收波長均為275nm，確定所述檢測波長為275nm誤差為±2nm。具體地，繪制所述對照品溶液的標準曲線并計算所述標準曲線的回歸方程的方法為:取干燥的所述對照品，用所述有機溶劑溶解，配制成每毫升含有所述對照品分別為0，20，40，60，80和100 μ g的所述對照品溶液，以所述有機溶劑為參比，于275nm波長處測定吸光度，并繪制所述對照品溶液的標準曲線，由所述標準曲線經(jīng)計算得所述線性回歸方程。具體地，測定所述供試品溶液的吸光度的方法為:所述供試品溶液的濃度在線性回歸方程的線性范圍以內(nèi)，當所述供試品為所述脂溶性茶多酚時，以所述有機溶劑為參比；當所述供試品為所述含有所述脂溶性茶多酚的制劑時，以所述空白制劑提取液為參比，于275nm波長處測定所述供試品溶液的吸光度。具體地，所述含所述茶多酚硬脂酸酯的制劑為以所述茶多酚硬脂酸酯為主藥的凝膠劑、霜劑、軟膏劑、涂劑、涂膜劑、膜劑和貼劑中的至少一種的藥物制劑。
具體地，所述有機溶劑為無水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、鹵仿、正已烷、環(huán)己烷、石油醚和二甲基亞砜中的至少一種。優(yōu)選地，所述有機溶劑為無水乙醇、乙酸乙酯?？蛇x地，所述茶多酚中含有的黃烷-3醇衍生物為:兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素或表沒食子兒茶素沒食子酸酯。可選地，所述8碳以上的有機脂肪酸為:癸酸、羊蠟酸、月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、珠光脂酸、硬脂酸、花生酸、山崳酸、桐酸、油酸或亞油酸。本發(fā)明實施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是:本發(fā)明通過對脂溶性茶多酚以及含有脂溶性茶多酚的制劑進行含量測定，避免通過測定酚羥基的含量間接反映脂溶性茶多酚含量，這樣就無需加入顯色劑，避免了使用昂貴的標準品和昂貴的儀器設(shè)備條件，降低了成本，而且本發(fā)明測定方法簡單可行，測定結(jié)果準確，易于推廣應(yīng)用，而且，本發(fā)明的測定方法也適用于含有脂溶性茶多酚的制劑中有復(fù)雜共存成分存在時脂溶性茶多酚的含量測定，其測定結(jié)果準確。


為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1是本發(fā)明實施例一提供的茶多酚硬脂酸酯在275nm波長處的標準曲線圖；圖2是本發(fā)明實施例一提供的茶多酚硬脂酸酯的紫外波長掃描圖；圖3是本發(fā)明實施·例二提供的表沒食子兒茶素沒食子酸酯硬脂酸酯的紫外波長掃描圖； 圖4是本發(fā)明實施例二提供的表沒食子兒茶素沒食子酸酯硬脂酸酯在275nm波長處的標準曲線圖；圖5是本發(fā)明實施例三提供的表沒食子兒茶素沒食子酸酯棕櫚酸酯在275nm波長處的標準曲線圖；圖6是本發(fā)明實施例三提供的含茶多酚棕櫚酸酯凝膠劑的紫外波長掃描圖；圖7是本發(fā)明實施例三提供的空白凝膠劑的紫外波長掃描圖；圖8是本發(fā)明實施例四提供的茶多酚棕櫚酸酯在274nm波長處的標準曲線圖；圖9是本發(fā)明實施例五提供的茶多酚月桂酸酯的紫外波長掃描圖；圖10是本發(fā)明實施例五提供的茶多酚月桂酸酯在275nm波長處的標準曲線；圖11是本發(fā)明實施例六提供的茶多酚肉豆蘧酸酯的紫外波長掃描圖；圖12是本發(fā)明實施例六提供的茶多酚肉豆蘧酸酯在275nm波長處的標準曲線；圖13是本發(fā)明實施例七提供的茶多酚葵酸酯的紫外波長掃描圖；圖14是本發(fā)明實施例七提供的茶多酚葵酸酯在275nm波長處的標準曲線。
具體實施例方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明實施方式作進一步地詳細描述。本發(fā)明所用試劑均為分析純市售試劑。本發(fā)明提供的方法包括以下步驟:將對照品和供試品分別制備成對照品溶液和供試品溶液，供試品為脂溶性茶多酚或含有脂溶性茶多酚的制劑，供試品溶液的溶劑為有機溶劑，對照品為脂溶性茶多酚，對照品溶液的溶劑為有機溶劑。通過分別繪制對照品溶液和供試品溶液的紫外波長掃描圖，獲得對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長，用于確定檢測波長。繪制對照品溶液的標準曲線并計算該標準曲線的回歸方程。采用紫外分光光度法測定供試品溶液的吸光度。將供試品溶液的吸光度帶入上述標準曲線回歸方程計算供試品中脂溶性茶多酚的含量。具體地，有機溶劑為無水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、正已烷、環(huán)己烷、石油醚和二甲基亞砜中的至少一種。具體如下:
本發(fā)明提供的供試品為茶多酚硬脂酸酯時，將脂溶性茶多酚配制成每毫升含有脂溶性茶多酚為0.04mg的供試品溶液，具體地，取脂溶性茶多酚4mg，用無水乙醇溶解并定容至IOOmL,以有機溶劑無水乙醇為參比，在200-400nm波長范圍內(nèi)掃描，得到供試品溶液的紫外波長掃描圖，由該紫外波長掃描圖確定供試品溶液在275nm或274nm波長處有最大吸收峰。本發(fā)明提供的供試品為含有脂溶性茶多酚的制劑時，取該制劑適量，精密稱定，置于容器中，加適量有機溶劑無水乙醇，充分攪拌，于離心機3600rpm離心30min，分取上清液，并重復(fù)提取3次，合并上清液并過濾，將濾液移入容量瓶，用無水乙醇定容，配制成每毫升含有脂溶性茶多酚為0.04mg的供試品溶液，以制備該供試品溶液的方法制備空白制劑提取液作為參比，在200-400nm波長范圍內(nèi)掃描，得到供試品溶液的紫外波長掃描圖，由該紫外波長掃描圖確定供試品溶液在波長275nm或274nm處有最大吸收峰。具體地，對照品為脂溶性茶多酚，對照品溶液的溶劑為有機溶劑。具體地，通過對照品溶液的紫外波長掃描圖確定對照品溶液的最大吸收波長的方法為:取對照品，用有機溶劑溶解，配制成每毫升含有對照品為0.04mg的對照品溶液，以有機溶劑為參比，在200-400nm波長范圍內(nèi)掃描，得到對照品溶液的紫外波長掃描圖，由紫外波長掃描圖確定對照品溶液的最大吸收波長為275nm或274nm。根據(jù)對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為275nm,則確定檢測波長為275nm誤差為±2nm，即在275nm誤差為±2nm范圍內(nèi)檢測有效。根據(jù)對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為274nm，則確定檢測波長為274nm誤差為±2nm，即在274nm誤差為±2nm范圍內(nèi)檢測有效。具體地，含脂溶性茶多酚的制劑為以脂溶性茶多酚為主藥的凝膠劑、霜劑、軟膏齊U、涂劑、涂膜劑、膜劑和貼劑中的至少一種的藥物制劑。繪制對照品溶液的標準曲線并計算標準曲線的回歸方程的方法為:取干燥的對照品，用有機溶劑溶解，配制成每毫升含有對照品分別為0，20，40，60，80和100 μ g的對照品溶液，以有機溶劑為參比。具體地，取干燥的對照品50mg，用無水乙醇溶解并定容至IOOmL,分別取該溶液0，2，4，6，8和IOmL于50mL容量瓶中，用無水乙醇定容，即得每毫升定容后的溶液含對照品0，20，40，60，80和100 μ g的對照品溶液，以無水乙醇為參比，于275nm或274nm波長處測定吸光度，并繪制對照品溶液的標準曲線，由該標準曲線經(jīng)計算得線性回歸方程。測定供試品溶液的吸光度的方法為:供試品溶液的濃度在線性回歸方程的線性范圍以內(nèi)，當供試品為茶多酚硬脂酸酯時，以有機溶劑為參比；當供試品為含有脂溶性茶多酚的制劑時，以空白制劑提取液為參比，于275nm波長處測定供試品溶液的吸光度?？蛇x地，茶多酚中含有的黃烷-3醇衍生物為:兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素或表沒食子兒茶素沒食子酸酯。可選地，8碳以上的有機脂肪酸為:癸酸、羊蠟酸、月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、珠光脂酸、硬脂酸、花生酸、山崳酸、桐酸、油酸或亞油酸。對照例茶多酚硬脂酸酯原料的含量測定茶多酚硬脂酸酯原料是以茶多酚為原料，?；瘎橛仓狨｛u或硬脂酸酸酐時，制備的茶多酚硬脂酸酯。取干燥的茶多酹硬脂酸酯200mg,精密稱定,用無水乙醇溶解并定容至IOOmL,作為供試品溶液，取經(jīng) 過100°C干燥Ih的沒食子酸乙酯lOOmg，精密稱定，用水溶解并定容至IOOmL,作為標準品溶液；分別吸取lOOmg/lOOmL的標準品溶液2，4，6，8和IOmL于IOmL容量瓶中，用水定容至刻度，制備成每IOOmL含沒食子酸乙酯20，40，60，80和IOOmg的溶液。測定:分別準確吸取供試品溶液及各種濃度的標準品溶液各lmL，于IOmL比色管中，各加入三乙醇胺水溶液lmL，混勻，加入酒石酸鐵溶液5mL，加水定容至25mL，以空白試劑作為參比，于540nm波長下，在Icm比色杯中比色。結(jié)果計算:茶多酹硬脂酸酯(％)=樣品相當于標準品含量X 1.5X 100+樣品質(zhì)量。按式計算，茶多酚硬脂酸酯含量為41.63%。該法不足之處是:相對于茶多酚，在茶多酚硬脂酸酯的組成、結(jié)構(gòu)、平均分子量、分子中鄰二酚羥基或連三酚羥基的數(shù)量、與亞鐵離子顯色的強度等理化性質(zhì)均發(fā)生了較大變化的情況下，該對照例仍然采用沒食子酸乙酯與表沒食子兒茶素沒食子酸酯在相同質(zhì)量下與亞鐵離子顯色物吸光度的經(jīng)驗比值即1.5，而且是通過測定酚羥基的含量間接反映茶多酚硬脂酸酯的含量，其測定結(jié)果偏低，不能直接測定茶多酚硬脂酸酯的含量。實施例一當以茶多酚為原料，?；瘎橛仓狨｛u或硬脂酸酸酐時，脂溶性茶多酚為茶多酚硬脂酸酯，測定茶多酚硬脂酸酯的含量。對照品為茶多酚硬脂酸酯，其茶多酚硬脂酸酯的紫外波長掃描圖如2所示。根據(jù)對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為275nm，則確定檢測波長為275nm誤差為±2nm，即在275nm誤差為±2nm范圍內(nèi)檢測有效。取干燥的茶多酚硬脂酸酯50mg，用無水乙醇溶解并定容至IOOmL,分別取該溶液0，2，4，6，8和IOmL于50mL容量瓶中，用無水乙醇定容，即得每毫升定容后的溶液含茶多酚硬脂酸酯O，20，40，60，80和IOOyg的對照品溶液，以無水乙醇為參比，于275nm波長處測定吸光度，并繪制對照品溶液的標準曲線，由該標準曲線經(jīng)計算得線性回歸方程為:Y=0.0085X+0.0142，如圖1所示，其中，線性范圍為0-100 μ g/mL,線性范圍為X的取值范圍，R2=0.9992，R2為確定系數(shù)，該R2值越接近I表示該線性回歸方程越可靠，Y為對照品溶液的吸光度，X為對照品溶液的濃度。取茶多酚硬脂酸酯200mg，該樣品與對照例的樣品相同，精密稱定，置于50mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容，精密量取該溶液ImL置于IOOmL容量瓶中，用無水乙醇定容，其紫外光譜掃描圖見附圖2，以無水乙醇為參比，按紫外分光光度法，在樣品配制2小時內(nèi)，于275nm波長處測定吸光度，其吸光度為0.3558，將吸光度代入上述線性回歸方程并計算含量。結(jié)果測得茶多酚硬脂酸酯含量為100.47%，本發(fā)明實施例提供的方法測得含量值與茶多酚硬脂酸酯的實際含量接近。實施例二當以茶多酚為原料，?；瘎橛仓狨｛u或硬脂酸酸酐時，脂溶性茶多酚為茶多酚硬脂酸酯，測定茶多酚硬脂酸酯原料的含量。根據(jù)對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為275nm，則確定檢測波長為275nm誤差為±2nm，即在275nm誤差為±2nm范圍內(nèi)檢測有效。對照品為表沒食子兒茶素沒食子酸酯硬脂酸酯，為茶多酚含有的表沒食子兒茶素沒食子酸酯與硬脂酸酰齒或硬脂酸酸酐反應(yīng)的產(chǎn)物，其表沒食子兒茶素沒食子酸酯硬脂酸酯的紫外波長掃描圖如圖3所示。取干燥的表沒食子兒茶素沒食子酸酯硬脂酸酯，用有機溶劑溶解，配制成每毫升含有表沒食子兒茶素沒食子酸酯硬 脂酸酯分別為0，20，40，60，80和100 μ g的對照品溶液，以有機溶劑為參比。具體地，取干燥的表沒食子兒茶素沒食子酸酯硬脂酸酯50mg，用無水乙醇溶解并定容至IOOmL,分別取該溶液0，2，4，6，8和IOmL于5OmL容量瓶中，用無水乙醇定容，即得每毫升定容后的溶液含表沒食子兒茶素沒食子酸酯硬脂酸酯0，20，40，60，80和100 μ g的對照品溶液，以無水乙醇為參比，于275nm波長處測定吸光度，并繪制對照品溶液的標準曲線，如圖4所示，由該標準曲線經(jīng)計算得線性回歸方程為:Y=0.0091Χ，其中，線性范圍為O-1OOy g/mL，線性范圍為X的取值范圍，R2=0.9993，R2為確定系數(shù)，該R2值越接近I表示該線性回歸方程越可靠，Y為對照品溶液的吸光度，X為對照品溶液的濃度。取茶多酚硬脂酸酯200mg，該樣品與對照例的樣品相同，精密稱定，置于50mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容，精密量取該溶液ImL置于IOOmL容量瓶中，用無水乙醇定容，以無水乙醇為參比，按紫外分光光度法，在樣品配制2小時內(nèi)，于275nm波長處測定吸光度，其吸光度為0.3716，將吸光度代入上述線性回歸方程并計算含量。結(jié)果測得茶多酚硬脂酸酯含量為102.09%，本發(fā)明實施例提供的方法測得含量值與茶多酚硬脂酸酯的實際含量接近。實施例三當以茶多酚為原料，酰化劑為棕櫚酸酰鹵或棕櫚酸酸酐時，脂溶性茶多酚為茶多酚棕櫚酸酯，測定茶多酚棕櫚酸酯的制劑的含量，具體為測定茶多酚棕櫚酸酯凝膠劑的含量。對照品為表沒食子兒茶素沒食子酸酯棕櫚酸酯，為茶多酚含有的表沒食子兒茶素沒食子酸酯與棕櫚酸酰鹵或棕櫚酸酸酐反應(yīng)的產(chǎn)物。根據(jù)對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為275nm，則確定檢測波長為275nm誤差為±2nm，即在275nm誤差為±2nm波長范圍內(nèi)檢測有效。取干燥的表沒食子兒茶素沒食子酸酯棕櫚酸酯，用有機溶劑溶解，配制成每毫升含有表沒食子兒茶素沒食子酸酯棕櫚酸酯分別為0，20，40，60，80和100 μ g的對照品溶液，以有機溶劑為參比。具體地，取干燥的表沒食子兒茶素沒食子酸酯棕櫚酸酯50mg，用無水乙醇溶解并定容至IOOmL,分別取該溶液0，2，4，6，8和IOmL于5OmL容量瓶中，用無水乙醇定容，即得每毫升定容后的溶液含表沒食子兒茶素沒食子酸酯棕櫚酸酯0，20，40，60，80和100 μ g的對照品溶液，以無水乙醇為參比，于275nm波長處測定吸光度，并繪制對照品溶液的標準曲線，如圖5所示，由該標準曲線經(jīng)計算得線性回歸方程為:Y=0.0101X+0.0159，其中，線性范圍為0-100 μ g/mL,線性范圍為X的取值范圍，R2=0.9991，R2為確定系數(shù)，該R2值越接近I表示該線性回歸方程越可靠，Y為對照品溶液的吸光度，X為對照品溶液的濃度。取標示量為0.5%的茶多酚棕櫚酸酯凝膠劑5g，精密稱定，置于燒杯中，加適量正已烷，充分攪拌，混合物于離心機3600rpm離心30min，分取上清液，重復(fù)提取3次，合并上清液，過濾，濾液移入IOOmL容量瓶中，用正已烷定容，即得供試品溶液；取等質(zhì)量空白凝膠劑，并按照制備供試品溶液的方法制備空白凝膠劑提取液，并作為參比；取供試品溶液，以制備的空白凝膠劑提取液作參比，按紫外分光光度法，在凝膠劑提取液配制2小時內(nèi)，于275nm波長處測定吸光度，其中，含茶多酚棕櫚酸酯的凝膠劑的紫外波長掃描圖如圖6所示，處理過的空白凝膠劑的紫外波長掃描圖如圖7所示，其吸光度為0.5198，將吸光度代入上述線性回歸方程并計算茶多酚棕櫚酸酯含量，該凝膠劑中茶多酚棕櫚酸酯的含量為
0.4989%，本發(fā)明實施例提供的方法測得含量值與茶多酚棕櫚酸酯的實際含量接近。實施例四當以茶多酚為原料，?；瘎樽貦八狨｛u或棕櫚酸酸酐時，脂溶性茶多酚為茶多酚棕櫚酸酯，測定茶多酚棕櫚酸酯的制劑的含量，具體為茶多酚棕櫚酸酯軟膏劑的含量。對照品為茶多酚棕櫚酸酯。根據(jù)對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為274nm，則確定檢測波長為274nm誤差為±2nm，即在274nm誤差為±2nm范圍內(nèi)檢測有效。取干燥的茶多酚棕櫚酸酯，用有機溶劑溶解，配制成每毫升含有茶多酚棕櫚酸酯分別為0，20，40，60，80和100 μ g的對照品溶液，以有機溶劑為參比。具體地，取干燥的茶多酚棕櫚酸酯50mg，用無水乙醇溶解并定容至IOOmL,分別取該溶液0，2，4，6，8和IOmL于50mL容量瓶中，用無水乙醇定容，即得每毫升定容后的溶液含茶多酚棕櫚酸酯0，20，40，60，80和100 μ g的對照品溶液，以無水乙醇為參比，于274nm波長處測定吸光度，并繪制對照品溶液的標準曲線，如圖8所示，由該標準曲線經(jīng)計算得線性回歸方程為:Y=0.0101X+0.0042，其中，線性范圍為0-100 μ g/mL，線性范圍為X的取值范圍，R2=0.9992，R2為確定系數(shù)，該R2值越接近I表示該線性回歸方程越可靠，Y為對照品溶液的吸光度，X為對照品溶液的濃度。取標示量為2%的茶多酚棕櫚酸酯軟膏劑10g，精密稱定，置于燒杯中，加適量乙酸乙酯，充分攪拌，混合物于離心機3600rpm離心30min,分取上清液,重復(fù)提取3次,合并上清液，過濾，濾液移入I OOmL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，精密量取該溶液ImL置于50mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，即得供試品溶液；取等質(zhì)量空白軟膏劑，并按照制備供試品溶液的方法制備空白軟膏劑提取液，并作為參比；取供試品溶液，以制備的空白軟膏劑提取液作參t匕，按紫外分光光度法，在供試品溶液配制2小時內(nèi)，于274nm波長處測定吸光度，其吸光度為0.4084，將吸光度代入上述線性回歸方程并計算茶多酚棕櫚酸酯含量，該凝膠劑中茶多酚棕櫚酸酯的含量為2.0012%，本發(fā)明實施例提供的方法測得含量值與茶多酚棕櫚酸酯的實際含量接近。實施例五當以茶多酚為原料，?；瘎樵鹿鹚狨｛u或月桂酸酸酐時，脂溶性茶多酚為茶多酚月桂酸酯，測定茶多酚月桂酸酯的含量。對照品為茶多酚月桂酸酯，其茶多酚月桂酸酯的紫外波長掃描圖如圖9所示。根據(jù)對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為275nm，則確定檢測波長為275nm誤差為±2nm，即在275nm誤差為±2nm范圍內(nèi)檢測有效。取干燥的茶多酹月桂酸酯50mg,用無水乙醇溶解并定容至IOOmL,分別取該溶液0，2，4，6，8和IOmL于50mL容量瓶中，用無水乙醇定容，即得每毫升定容后的溶液含茶多酚月桂酸酯O，20，40，60，80和IOOyg的對照品溶液，以無水乙醇為參比，于275nm波長處測定吸光度，并繪制對照品溶液的標準曲線，由該標準曲線經(jīng)計算得線性回歸方程為:Y=0.0101X+0.0019，如圖10所示，其中，線性范圍為0-100 μ g/mL,線性范圍為X的取值范圍，R2=0.9992，R2為確定系數(shù)，該R2值越接近I表示該線性回歸方程越可靠，Y為對照品溶液的吸光度，X為對照品溶液的濃度。取茶多酚月桂酸酯200mg，精密稱定，置于50mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容，精密量取該溶液ImL置于IOOmL容量瓶中，用無水乙醇定容，以無水乙醇為參比，按紫外分光光度法，在樣品配制2小時內(nèi)，于275nm波長處測定吸光度，其吸光度為0.4017，將吸光度代入上述線性回歸方程并計算含量。
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結(jié)果測得茶多酚月桂酸酯含量為98.96%，本發(fā)明實施例提供的方法測得含量值與茶多酚月桂酸酯的實際含量接近。實施例六當以茶多酚為原料，?；瘎槿舛罐舅狨｛u或肉豆蘧酸酸酐時，脂溶性茶多酚為茶多酚肉豆蘧酸酯，測定茶多酚肉豆蘧酸酯的含量。對照品為茶多酚肉豆蘧酸酯，其茶多酚肉豆蘧酸酯的紫外波長掃描圖如圖11所
/Jn ο根據(jù)對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為275nm，則確定檢測波長為275nm誤差為±2nm，即在275nm誤差為±2nm范圍內(nèi)檢測有效。取干燥的茶多酹肉豆蘧酸酯50mg,用無水乙醇溶解并定容至IOOmL,分別取該溶液0，2，4，6，8和IOmL于50mL容量瓶中，用無水乙醇定容，即得每毫升定容后的溶液含茶多酚肉豆蘧酸酯0，20，40，60，80和100 μ g的對照品溶液，以無水乙醇為參比，于275nm波長處測定吸光度，并繪制對照品溶液的標準曲線，由該標準曲線經(jīng)計算得線性回歸方程為:Y=0.0103X+0.0091，如圖12所示，其中，線性范圍為0-100 μ g/mL，線性范圍為X的取值范圍，R2=0.9992，R2為確定系數(shù)，該R2值越接近I表示該線性回歸方程越可靠，Y為對照品溶液的吸光度，X為對照品溶液的濃度。
取茶多酚肉豆蘧酸酯200mg，精密稱定，置于50mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容，精密量取該溶液ImL置于IOOmL容量瓶中，用無水乙醇定容，以無水乙醇為參比，按紫外分光光度法，在樣品配制2小時內(nèi)，于275nm波長處測定吸光度，其吸光度為0.4255，將吸光度代入上述線性回歸方程并計算含量。結(jié)果測得茶多酚肉豆蘧酸酯含量為101.08%，本發(fā)明實施例提供的方法測得含量值與茶多酚肉豆蘧酸酯的實際含量接近。實施例七當以茶多酚為原料，?；瘎楣锼狨｛u或癸酸酸酐時，脂溶性茶多酚為茶多酚癸酸酯，測定茶多酚癸酸酯的含量。對照品為茶多酚癸酸酯，其茶多酚癸酸酯的紫外波長掃描圖如圖13所示。根據(jù)對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為275nm，則確定檢測波長為275nm誤差為±2nm，即在275nm誤差為±2nm范圍內(nèi)檢測有效。取干燥的茶多酹癸酸酯50mg,用無水乙醇溶解并定容至IOOmL,分別取該溶液0，2，4，6，8和IOmL于50mL容量瓶中，用無水乙醇定容，即得每毫升定容后的溶液含茶多酚月桂酸酯0，20，40，60，80和100 μ g的對照品溶液，以無水乙醇為參比，于275nm波長處測定吸光度，并繪制對照品溶液的標準曲線，由該標準曲線經(jīng)計算得線性回歸方程為:Y=0.0099X+0.0036，如圖14所示，其中，線性范圍為0-100 μ g/mL,線性范圍為X的取值范圍，R2=0.9998，R2為確定系數(shù)，該R2值越接近I表示該線性回歸方程越可靠，Y為對照品溶液的吸光度，X為對照品溶液的濃度。取茶多酚 癸酸酯200mg，精密稱定，置于50mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容，精密量取該溶液ImL置于IOOmL容量瓶中，用無水乙醇定容，以無水乙醇為參比，按紫外分光光度法，在樣品配制2小時內(nèi)，于275nm波長處測定吸光度，其吸光度為0.3911，將吸光度代入上述線性回歸方程并計算含量。結(jié)果測得茶多酚癸酸酯含量為97.86%，本發(fā)明實施例提供的方法測得含量值與茶多酚癸酸酯的實際含量接近。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，脂溶性茶多酚組分雖然較多，但其結(jié)構(gòu)中的母核以黃烷-3醇衍生物為主，其它組分也主要為多羥基酚，本發(fā)明采用紫外分光光度法，通過測定脂溶性茶多酚母核的含量來間接得知脂溶性茶多酚的含量，經(jīng)過大量實驗研究發(fā)現(xiàn)，以茶多酚或茶多酚中含有的黃烷-3醇衍生物為反應(yīng)物制備的脂溶性茶多酚的有機溶劑溶液，以及由脂溶性茶多酚制備的所述制劑的有機溶劑提取液，紫外吸收峰位穩(wěn)定，均在275nm誤差為±2nm，而且其濃度在一定范圍內(nèi)與吸收度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，此結(jié)果為本發(fā)明技術(shù)的基礎(chǔ)。需要說明的是，在本發(fā)明提供的實施例中，有機溶劑采用無水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和正已烷，但是在其它實施例中，也可以采用環(huán)己烷、石油醚或二甲基亞砜，由實驗可知，當有機溶劑采用無水乙醇、正丁醇、氯仿、正已烷、環(huán)己烷、石油醚或二甲基亞砜時，獲得的實驗結(jié)果數(shù)據(jù)與前述實施例基本相同；同樣地，在本發(fā)明提供的實施例中采用茶多酚棕櫚酸酯為主藥的凝膠劑和軟膏劑，但是在其他實施例中，采用茶多酚棕櫚酸酯為主藥的霜劑、涂劑、涂膜劑、膜劑或貼劑作為供試品，獲得的實驗結(jié)果數(shù)據(jù)與前述實施例基本相同。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種測定脂溶性茶多酚含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: 將對照品和供試品分別制備成對照品溶液和供試品溶液，所述供試品為脂溶性茶多酚或含有所述脂溶性茶多酚的制劑，所述供試品溶液的溶劑為有機溶劑，所述對照品為脂溶性茶多酚，所述對照品溶液的溶劑為有機溶劑； 通過分別繪制所述對照品溶液和所述供試品溶液的紫外波長掃描圖，獲得所述對照品溶液和所述供試品溶液的最大吸收波長，并根據(jù)所述最大吸收波長確定檢測波長； 繪制所述對照品溶液的標準曲線并計算所述標準曲線的回歸方程； 采用紫外分光光度法測定所述供試品溶液的吸光度； 將所述供試品溶液的吸光度帶入所述標準曲線回歸方程計算所述供試品中脂溶性茶多酚的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂溶性茶多酚為茶多酚與8碳以上的有機脂肪酸的酰鹵或酸酐反應(yīng)得到的產(chǎn)物、或者為所述茶多酚中含有的黃烷-3醇衍生物與所述8碳以上的有機脂肪酸的酰鹵或酸酐反應(yīng)得到的產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過所述供試品溶液的紫外波長掃描圖確定所述供試品溶液的最大吸收波長的方法為:所述供試品為所述脂溶性茶多酚時，將所述脂溶性茶多酚配制成每毫升含有所述脂溶性茶多酚為0.04mg的所述供試品溶液，以所述有機溶劑為參比，在200-400nm波長范圍內(nèi)掃描，得到所述供試品溶液的紫外波長掃描圖，由所述紫外波長掃描圖確定所述供試品溶液的最大吸收波長為275nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過所述供試品溶液的紫外波長掃描圖確定所述供試品溶液的最大吸收波長的方法為:所述供試品為所述含有所述脂溶性茶多酚的制劑時，取所述制劑適量，精密稱定，置于容器中，加適量所述有機溶劑，充分攪拌，于離心機3600rpm離心30min，分取上清液，并重復(fù)提取3次，合并所述上清液并過濾，將濾液移入容量瓶，用所述有機溶劑定容，配制成每毫升含有所述脂溶性茶多酚為0.04mg的所述供試品溶液，以制備所述供試品溶液的方法制備等質(zhì)量空白制劑提取液作為參比，在200-400nm波長范圍內(nèi)掃描，得到所述供試品溶液的紫外波長掃描圖，由所述紫外波長掃描圖確定所述供試品溶液的最大吸收波長為275nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過所述對照品溶液的紫外波長掃描圖確定所述對照品溶液的最大吸收波長的方法為:取所述對照品，用所述有機溶劑溶解，配制成每毫升含有所述對照品為0.04mg的所述對照品溶液，以所述有機溶劑為參比，在200-400nm波長范圍內(nèi)掃描，得到所述對照品溶液的紫外波長掃描圖，由所述紫外波長掃描圖確定所述對照品溶液的最大吸收波長為275nm。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，根據(jù)所述對照品溶液與所述供試品溶液的最大吸收波長均為275nm,確定所述檢測波長為275nm誤差為±2nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，繪制所述對照品溶液的標準曲線并計算所述標準曲線的回歸方程的方法為:取干燥的所述對照品，用所述有機溶劑溶解，配制成每毫升含有所述對照品分別為O，20，40，60，80和100 μ g的所述對照品溶液，以所述有機溶劑為參比，于275nm波長處測定吸光度，并繪制所述對照品溶液的標準曲線，由所述標準曲線經(jīng)計算得所述線性回歸方程。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，測定所述供試品溶液的吸光度的方法為:所述供試品溶液的濃度在線性回歸方程的線性范圍以內(nèi)，當所述供試品為所述脂溶性茶多酚時，以所述有機溶劑為參比；當所述供試品為所述含有脂溶性茶多酚的制劑時，以所述空白制劑提取液為參比，于275nm波長處測定所述供試品溶液的吸光度。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述含所述茶多酚硬脂酸酯的制劑為以所述茶多酚硬脂酸酯為主藥的凝膠劑、霜劑、軟膏劑、涂劑、涂膜劑、膜劑和貼劑中的至少一種的藥物制劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述有機溶劑為無水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、正已烷、環(huán)己烷、石油醚和二甲基亞砜中的至少一種。
11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述茶多酚中含有的黃烷-3醇衍生物為:兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素或表沒食子兒茶素沒食子酸酯。
12.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述8碳以上的有機脂肪酸為:癸酸、羊蠟酸、月桂酸、肉豆 蘧酸、棕櫚酸、珠光脂酸、硬脂酸、花生酸、山崳酸、桐酸、油酸或亞油酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測定脂溶性茶多酚含量的方法，屬于化學定量檢測領(lǐng)域。所述方法包括將對照品和供試品分別制備成對照品溶液和供試品溶液；通過分別繪制所述對照品溶液和所述供試品溶液的紫外波長掃描圖確定檢測波長；繪制所述對照品溶液的標準曲線并計算所述標準曲線的回歸方程；測定所述供試品溶液的吸光度；將所述吸光度帶入所述標準曲線回歸方程計算所述供試品中脂溶性茶多酚的含量。本發(fā)明通過對脂溶性茶多酚以及含有脂溶性茶多酚的制劑進行含量測定，避免通過測定酚羥基的含量間接反映脂溶性茶多酚含量，這樣就無需加入顯色劑或氧化劑，避免了使用昂貴的標準品和昂貴的儀器設(shè)備條件，降低了成本，而且測定方法簡便、準確。
文檔編號G01N21/35GK103234934SQ20131010823
公開日2013年8月7日 申請日期2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月29日
發(fā)明者張濤 申請人:江漢大學