一種促性腺激素的純度測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種促性腺激素的HPLC純度測定方法，具體地，本發(fā)明提供了一種用交聯(lián)葡聚糖或交聯(lián)瓊脂糖或兩者的混合交聯(lián)物為填料的分子排阻層析柱對原粉和/或原料藥進(jìn)行高壓液相色譜測定的方法；其中，所述分子排阻層析柱的主峰USP理論塔板數(shù)不低于1600。該方法具有良好的專屬性、準(zhǔn)確度和重復(fù)性。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及促性腺激素的純度分析。尤其涉及人尿卵泡刺激素的純度分析。 一種促性腺激素的純度測定方法

【背景技術(shù)】
[0002] 治療不孕癥的促性腺激素是一類結(jié)構(gòu)接近的糖蛋白物質(zhì)，包括絨毛膜促性腺激素 (HCG)、絕經(jīng)期促性腺素（HMG)、卵泡刺激素（FSH)、黃體生成素（LH)，其中絕經(jīng)期促性腺素 是含有卵泡刺激素和黃體生成素且兩者成一定比例（2:1-1:2)的混合物。
[0003] HCG、FSH、LH都是由α鏈和β鏈兩個亞基通過非共價鍵的形式結(jié)合，其中它們 的α亞基完全相同，具有92個氨基酸，分子量約為14500D，第52和78位置上的天冬酰胺 是發(fā)生Ν-糖基化的氨基酸。HCG的β亞基有145-147個氨基酸，分子量22200-39000D，其 中第13、30位置上的天冬酰胺以及第121、127、132、145位置是發(fā)生糖基化的地方。FSH的 β亞基由111個氨基酸組成，分子量約為18000D，其中第7和24位置上的天冬酰胺是發(fā)生 Ν-糖基化的氨基酸。而LH的β亞基由121個氨基酸組成，分子量約為14800D。
[0004] 臨床上HCG、HMG、FSH、LH主要用于治療不育癥以及體外輔助生殖。它們可以從特 定婦女（孕期或絕經(jīng)期）的尿液中提取出來，也可通過DNA重組技術(shù)而制備。
[0005] 治療不孕癥的促性腺激素的第一代產(chǎn)品是上世紀(jì)60年代Serono公司的 Profasi (HCG)、Pergonal (HMG)，它們的純度都較低，含有大量雜質(zhì)。上世紀(jì)80年代之后， Serono公司分別推出了 Metrodin-HP，它是一種雜質(zhì)含量很低的高純度的FSH制劑；后來又 推出利用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)的Gonal-F(rFSH)、Luveris(rLH)等，另外，F(xiàn)erring公司也推 出了高純度絕經(jīng)期促性腺素一Menopur。
[0006] 低純度的產(chǎn)品由于雜蛋白含量大，對人體有較大的副作用，主要的臨床不良反應(yīng) 表現(xiàn)為過敏、皮疹、發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛以及下腹不適或脹感、腹痛、惡心、嘔吐等，對使用安全性 帶來一定的風(fēng)險。另外，由于低純度產(chǎn)品雜質(zhì)含量大，刺激性較大，因此給藥方式也只能局 限于肌肉注射。由于肌肉注射需要一定深度的刺入，故一般都是選擇臀大肌或上臂三角肌 部位，這種注射方式的缺點是疼痛大、注射不便。因此，若能開發(fā)出比活高、雜質(zhì)少的高純度 產(chǎn)品，就能在臨床不良反應(yīng)和注射方式這兩方面得到極大地改善，一是大大減少副作用，提 高產(chǎn)品的安全性，二是可以進(jìn)行皮下注射，減輕患者的痛苦并且操作方便，現(xiàn)在進(jìn)行皮下注 射的患者一般都在家中自己進(jìn)行注射給藥。但皮下注射時對產(chǎn)品純度的要求格外高，微量 雜質(zhì)的存在更容易引起局部過敏反應(yīng)。目前已經(jīng)投入市場的高純度促性腺激素類糖蛋白藥 物通過皮下注射仍有發(fā)生過敏反應(yīng)的報道。因此有必要進(jìn)一步提高和控制促性腺激素類藥 物的純度，然而，現(xiàn)有檢測方法并不能很精確的檢測出產(chǎn)品中的所有雜質(zhì)，由此無法真正有 效地控制雜質(zhì)的含量，以保證用藥的安全性。
[0007] 因此，如何改進(jìn)此類促性腺激素的純度的測定方法，提高測定的準(zhǔn)確性，一直以來 都是人們不斷研究的課題。蛋白類的藥物與一般的化學(xué)藥物在性質(zhì)上有很大的不同，一般 的化學(xué)藥物檢測方法針對于蛋白類的藥物的檢測往往不能發(fā)揮較好的作用，尤其是針對于 促性腺激素類藥物。主要原因是蛋白類物質(zhì)分子量相對較大，結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，存在有四級結(jié) 構(gòu)，結(jié)構(gòu)上的差異可以讓同一種蛋白表現(xiàn)出不同的性質(zhì)。促性腺激素由于在蛋白的骨架上 連有糖鏈，同一種蛋白質(zhì)的每個蛋白分子上連有的糖鏈數(shù)目可能有所不同，而每一條糖鏈 的長短、糖鏈的單糖組成也不盡相同，這就造成了促性腺激素性質(zhì)不均一性非常明顯。另 夕卜，經(jīng)高度純化后的蛋白質(zhì)藥物，其殘留的雜蛋白在性質(zhì)上已與主成分非常相似，正是因為 這種相似，讓常規(guī)的蛋白分離手段不能有效的去除這些雜蛋白，因此，常規(guī)的純度分析方法 也無法有效的檢測促性腺激素的純度。
[0008] 目前，促性腺激素的純度分析方法使用最多的是SDS-凝膠電泳和凝膠色譜法，這 兩種方法雖然都是根據(jù)分子的大小進(jìn)行蛋白分離，但其原理不盡相同，電泳是通過蛋白質(zhì) 與SDS結(jié)合后，通過蛋白質(zhì)在電場中進(jìn)行泳動來進(jìn)行分離，而凝膠色譜法則是靠被分離組 分分子體積與凝膠的孔徑大小之間的相對關(guān)系而分離。兩種方法相互之間不可取代，互補(bǔ) 短長。
[0009] 凝膠色譜法測定促性腺激素的純度同樣也受到促性腺激素的分子大小不均一的 影響，其分離促性腺激素的效果一直不夠理想，只有對分子量差異非常大，性質(zhì)很均一的蛋 白才能夠達(dá)到有效分離。而促性腺激素的分子量普遍在28KD至50KD之間，本身差異不大， 可能含有的雜質(zhì)或有關(guān)物質(zhì)的分子量也與之相差不是很大，因此，測定的效果也無法盡如 人意。
[0010] 現(xiàn)有文獻(xiàn)也有報道采用凝膠色譜的方法檢測促性腺激素純度的方法，如 文獻(xiàn)：Claudio ffolfenson and others, ^Article Batch-to-batch Consistency of Human-derived Gonadotrophin Preparations Compared with Recombinant Preparations，Reproductive biomedicine online, 10 (2005) ,442 - 454.以及其它多篇 文獻(xiàn)都報道過采用Tosoh Bioscience公司的Bios印S2000 (TSKG2000)凝膠柱對卵泡刺 激素，絕經(jīng)期促性腺激素或者絨毛膜促性腺激素進(jìn)行純度分析。然而這種分析方法對卵泡 刺激素，高純度絕經(jīng)期促性腺激素樣品中的小分子雜質(zhì)無法有效的分離，其小分子雜質(zhì)峰 被主成分峰所掩蓋，無法計算小分子雜質(zhì)含量，其對絨毛膜促性腺激素的小分子雜質(zhì)的分 離效果也不理想。
[0011] 另外，文獻(xiàn)：Bert HM van de Wei jer and others, 'Compositional Analyses of a Human Menopausal Gonadotrophin Preparation Extracted from Urine(menotropin). Identification of Some of Its Major Impurities. '，Reproductive biomedicine online, 7(2003)，547 - 57.也報道過采用Superdex7510/30凝膠柱，以含有20%乙腈的 0. 2mol/L的磷酸鹽緩沖液，pH7. 0為流動相，210nm處紫外檢測的方法對高純度絕經(jīng)期促性 腺激素，重組卵泡刺激素，重組絨毛膜促性腺激素和重組促黃體生成素等進(jìn)行純度分析。然 而，由于該方法的分離效果并不是很理想，其對高純度絕經(jīng)期促性腺激素的雜質(zhì)沒法有效 分離，造成主峰前伸和拖尾，致使大分子雜質(zhì)和小分子雜質(zhì)與主成分峰的USP分離度都小 于1，遠(yuǎn)不能符合要求，因此無法較準(zhǔn)確的測定樣品中的雜質(zhì)量。發(fā)明人參照該文獻(xiàn)分析方 法進(jìn)行卵泡刺激素的純度分析，發(fā)現(xiàn)該方法雖然可以同時較好的分離卵泡刺激素中的大分 子和小分子雜質(zhì)，但在分離度上都不盡如人意，尤其是在雜質(zhì)(或有關(guān)物質(zhì)）量較低的情況 下，如雜質(zhì)量小于2%的情況下，其分離度較差。
[0012] 文獻(xiàn)：鄭璐俠等，注射用絨促性素中純度測定方法的研究，藥物分析雜志，32 (2012),333-336.報道了采用兩根TSK G3000SWXL進(jìn)行串聯(lián)對注射用絨促性素進(jìn)行純度分 析，雖然對于分子量在40KD附近的不同物質(zhì)的分離情況有改善，但對于小分子雜質(zhì)，尤其 是卵泡刺激素中分子量較小的蛋白雜質(zhì)的分離情況沒有改善，并且其試過了不同型號針對 于不同分子量段的TSK層析柱，都不如TSK G3000SWXL的效果好。
[0013] 由此可見，目前針對于治療不孕癥的促性腺激素的純度液相分析方法還不夠理 想，其主要原因為：首先，由于該類糖蛋白的雜質(zhì)與主物質(zhì)的分子量相差并不是很大，在現(xiàn) 有的分子排阻的填料上無法非常有效的分離。其次，由于該類糖蛋白上含有多個糖鏈，且每 個糖鏈都具有很大程度上的多樣性，造成了同一種糖蛋白也具有分子量上的一定差異，因 此，在分子排阻的液相上反映出來的就是峰展寬，從而易造成主峰和雜質(zhì)峰無法有效分離。 再次，由于糖蛋白在性質(zhì)上的多樣性，而雜質(zhì)的性質(zhì)又與主活性成分相似，因此無法通過其 他原理的分離分析方法進(jìn)行有效的純度分析。
[0014] 人們也嘗試了通過兩根凝膠色譜柱進(jìn)行串聯(lián)來增加柱長，提高理論塔板數(shù)，從而 提高雜質(zhì)的分離效果的方法，雖然雜質(zhì)的分離效果確實有所改善，針對于絨促性素的雜質(zhì) 檢測有明顯的改善，但針對于高純度卵泡刺激素中小分子雜質(zhì)的檢測并未有較好的改觀。
[0015] 另外，在促性腺激素類原料藥和促性腺激素類制劑的制備過程中，其制備用的原 料，如促性腺激素類原粉和促性腺激素類原料藥的質(zhì)量直接關(guān)系到最終產(chǎn)品的質(zhì)量，若所 用原料的質(zhì)量不符合要求，則制備出的產(chǎn)品也將不符合藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。因此，迫切需要找到 一種切實可靠的檢測方法，有效保障最終獲得的制劑產(chǎn)品的質(zhì)量。
[0016] 因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)出一種能更好的測定該類促性腺激素純度的分析方 法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種測定促性腺激素純度的分析方法。
[0018] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種高純度，適合多種給藥方式的促性腺激素類原 料藥或促性腺激素類制劑的制備方法。
[0019] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種通過HPLC測定樣品中促性腺激素純度的方法， 其特征在于，用分子排阻層析柱對所述樣品進(jìn)行高壓液相色譜測定，從而測得所述樣品中 的促性腺激素純度，其中所述分子排阻層析柱的填料包括交聯(lián)葡聚糖、交聯(lián)瓊脂糖或其組 合；
[0020] 并且，所述分子排阻層析柱的主峰USP理論塔板數(shù)彡1600。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的分子排阻層析柱為葡聚糖、瓊脂糖或其混合交聯(lián)物為填 料的層析柱，較佳地為由瓊脂糖和葡聚糖交聯(lián)組成的Superdex為填料的層析柱。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的分子排阻層析柱為Superdex7510/300GL層析柱。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述層析柱為預(yù)裝柱或非預(yù)裝柱。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的理論塔板數(shù)不低于1700,更佳地不低于1800。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，采用2根分子排阻層析柱串聯(lián)進(jìn)行檢測，較佳地，采用2根 Superdex7510/300GL層析柱串聯(lián)進(jìn)行檢測。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述測定方法中使用的流動相為乙腈和緩沖鹽溶液。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述測定方法中使用的流動相流速為0. 1?1. 0ml/分鐘。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述測定方法中使用的檢測波長為200?300nm。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的流動相中乙腈對水相的體積比為0?1/2,較佳地為 1/20 ?2/5。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述的緩沖鹽選自下組：磷酸鹽、Tris、醋酸鹽、氯化鈉，或其組 合；較佳地，所述的緩沖鹽選自下組：磷酸鹽、氯化鈉，或其組合。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述的緩沖鹽是磷酸二氫鹽，較佳地為磷酸二氫鈉。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述的緩沖鹽溶液濃度為10mM?1700mM，較佳地為lOOmM? 300mM ;所述緩沖鹽溶液濃度為溶液中各種鹽的總濃度。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述的緩沖鹽的pH為5. 0?10. 0。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述促性腺激素包括選自下組的一個或多個成分：絨毛膜促性 腺激素、絕經(jīng)期促性腺素、卵泡刺激素、黃體生成素；較佳地，所述促性腺激素包括卵泡刺激 素。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括如下的一個或多個條件：
[0036] a、高壓液相色譜系統(tǒng)包括兩根串聯(lián)的Superdex7510/300GL柱；
[0037] b、流動相：乙腈：緩沖鹽溶液=1 :20?2 :5,其中所述的比例為體積比；
[0038] c、流速：0· 2 ?0· 8ml/min，
[0039] d、柱溫：25 ?45°C ;
[0040] e、檢測波長：210 ?235nm ;
[0041] f、進(jìn)樣濃度：3000 ?4500IU/ml。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，所述的樣品為促性腺激素類原粉或促性腺激素類原料藥。
[0043] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種制備促性腺激素類原料藥的方法，所述的促性腺 激素類原料藥的制備過程包含如下步驟：
[0044] A、用如本發(fā)明第一方面所述的純度測定方法，測定促性腺激素類原粉純度；
[0045] B、若步驟（A)的測定結(jié)果表明原粉中總雜質(zhì)含量> 2%，則對所述原粉重新進(jìn)行純 化，直至測定結(jié)果表明總雜質(zhì)含量< 2% ;
[0046] C、若步驟（A)的測定結(jié)果表明該原粉中總雜質(zhì)含量< 2%，則在該促性腺激素類原 粉中加入藥學(xué)上可接受量的賦形劑，制得促性腺激素類原料藥。
[0047] 本發(fā)明的第三方面，提供了一種制備促性腺激素類藥物制劑的方法，所述的促性 腺激素類藥物制劑制備過程包含如下步驟：
[0048] A、用如本發(fā)明第一方面所述的純度測定方法，測定促性腺激素類原料藥的純度；
[0049] B、若步驟（A)的測定結(jié)果表明該原料藥中總雜質(zhì)含量< 2%，則在該促性腺激素類 原料藥中加入藥學(xué)上可接受量的賦形劑，制得促性腺激素類藥物制劑。
[0050] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0051] 圖1顯示了實施例1方法一所得的色譜圖；
[0052] 圖2顯示了實施例1方法二所得的色譜圖；
[0053] 圖3顯示了實施例1方法三所得的色譜圖；
[0054] 圖4顯示了實施例1方法四所得的色譜圖；
[0055] 圖5顯示了實施例2方法一所得的色譜圖；
[0056] 圖6顯示了實施例2方法二所得的色譜圖；
[0057] 圖7顯示了實施例3序號1實驗所得的色譜圖。

【具體實施方式】
[0058] 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究發(fā)現(xiàn)，首次意外地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用交聯(lián)葡聚糖和/ 或交聯(lián)瓊脂糖作為分子排阻層析柱的填料，并且分子篩的理論塔板數(shù)達(dá)到1600以上時，可 以有效地將雜質(zhì)與主物質(zhì)分離開，從而可以準(zhǔn)確地測定高純度促性腺激素樣品中的少量雜 質(zhì)的含量。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人完成了本發(fā)明。
[0059] 本發(fā)明的試驗表明，當(dāng)分子篩的理論塔板數(shù)達(dá)到1600以上（可采用兩根串聯(lián)的分 子篩柱，如兩根Superd ex7510/300GL)，通過HPLC進(jìn)行促性腺激素純度測定時，以一定比例 的乙腈為流動相，以紫外檢測器在200?300nm處進(jìn)行監(jiān)測，對于測定含有極低雜質(zhì)含量的 促性腺激素，其雜質(zhì)與主物質(zhì)能夠得到較好的分離，對于較準(zhǔn)確的測定高純度促性腺激素 的雜質(zhì)含量起了積極的作用，為該類物質(zhì)的安全性評價和質(zhì)量的進(jìn)一步提高提供了有力的 手段。
[0060] 術(shù)語
[0061] 如本文所用，"促性腺激素"選自下述的一種或多種混合：絨毛膜促性腺激素 (chorionic gonadotropin, CG)、卵泡刺激素(follicule-stimulating hormone, FSH)、 黃體生成素 （luteotropic hormone, LH)、絕經(jīng)期促性腺素 （human menopausal gonadotropin，HMG)。所述"促性腺激素原粉"是促性腺激素在加入稀釋劑制備成原料藥之 前的干燥粉。所述促性腺激素類原粉可用現(xiàn)有技術(shù)的方法制備，如可以從特定婦女（孕期 或絕經(jīng)期）的尿液中提取出來，也可通過DNA重組技術(shù)而制備。
[0062] 在另一優(yōu)選例中，所述現(xiàn)有技術(shù)包括（但不限于），中國專利CN1246332C公開的 制備方法獲得的高純度的HMG ;中國專利CN1958603B公開的制備方法獲得的HCG ;以及 CN101307103A公開的方法獲得的FSH。
[0063] 如本文所用，"促性腺激素類原料藥"是指含有促性腺激素類原粉的組合物，其組 成為促性腺激素和藥學(xué)上/食品學(xué)上可接受的載體?？梢詾楣腆w或液體，可以使用本領(lǐng)域 現(xiàn)有的制備促性腺激素組合物的方法來獲得，其可以直接用來制備成藥物制劑，其在藥學(xué) 上定義為原料藥。例如但不限于，中國專利CN101269215B公開的方法獲得的促性腺激素類 原料藥。
[0064] 以上原料藥的取得方法僅是舉例，本發(fā)明所述的原料藥應(yīng)當(dāng)不受此限制。
[0065] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述FSH原料藥中的FSH原粉含量為不低于10 μ g/ mg原料藥或不低于100國際單位/mg原料藥。
[0066] 如本文所用，術(shù)語"促性腺激素類藥物制劑"是指含有治療有效量的促性腺激素類 原料藥，以及藥學(xué)上可接受的載體，例如(但并不限于)，中國專利CN1795012A公開的方法獲 得的FSH組合物或歐洲專利EP0618808公開的方法獲得的FSH組合物。
[0067] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述FSH制劑中的FSH原料藥占制劑總重量的 0. 001?99. 9wt% ;優(yōu)選為組合物總重量的0. 01?99wt%，較優(yōu)選為0. 02?95wt%，更優(yōu)選 0. 05?90wt%。余量為藥學(xué)上可接受的載體以及其它添加劑等物質(zhì)。
[0068] 如本文所用"總雜質(zhì)含量"指除主成份之外的各個雜質(zhì)含量的總和，包含了本文所 述的"大分子雜質(zhì)"、"小分子雜質(zhì)"和其它可能存在的雜質(zhì)含量的總和。
[0069] 如本文所用"大分子雜質(zhì)"是指分子量大于主成份的雜質(zhì)，"小分子雜質(zhì)"是指分子 量小于主成份的雜質(zhì)。
[0070] 如本文所用，術(shù)語"含有"或"包括"包括了"包含"、"基本上由……構(gòu)成"、和 "由……構(gòu)成"。如本文所用，術(shù)語"治療有效量"是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的 且可被人和/或動物所接受的量。
[0071] 如本文所用，術(shù)語"藥學(xué)上可接受的"或"食品學(xué)上可接受的"的成分是適用于人和 /或動物而無過度不良副反應(yīng)（如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng)）的，即有合理的效益/風(fēng)險比的 物質(zhì)。
[0072] 如本文所用，術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種 賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體：它們本身并不是必要的活性成分，且施用 后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在《雷明頓藥物科學(xué)》 (Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Pub. Co.，N.J. 1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上 可接受的賦形劑的充分討論。
[0073] 所述的"藥學(xué)上可接受的載體"可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些 載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、崩解齊?、潤滑劑、助流齊?、泡騰齊?、潤濕劑或乳 化劑、矯味劑、pH緩沖物質(zhì)等。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受 的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8,較佳地，pH約為6-8。
[0074] 應(yīng)理解，所用FSH的有效劑量可隨待施用或治療的對象的嚴(yán)重程度而變化。具體 情況根據(jù)對象的個體情況（例如對象體重、年齡、身體狀況、所需達(dá)到的效果）來決定，這在 熟練醫(yī)師或營養(yǎng)師可以判斷的范圍內(nèi)。
[0075] 本發(fā)明的藥物組合物，可以為固態(tài)（如顆粒劑、片劑、凍干粉、栓劑、膠囊、舌下含 片）或液態(tài)（如口服液、水針劑）或其它合適的形狀。
[0076] 按中國藥典規(guī)定：除另有規(guī)定外，一般情況下，待測組分與相鄰共存物之間的分離 度應(yīng)大于1. 5。然而，由于促性腺激素屬于生化藥物，此類藥物雜質(zhì)的分離非常困難，因此本 領(lǐng)域已經(jīng)形成共識：分離度大于1就符合要求。若分離度過小，則表明兩峰之間分離情況很 差，其通過積分來計算純度的誤差就會非常大。
[0077] 另外，在本領(lǐng)域普遍使用的分析方法通常積分分析時采用峰谷對峰谷積分，這樣， 會將基線人為的抬高，從而使分離度數(shù)值提高以滿足大于1的要求。由于基線被人為的抬 高，各個峰的積分面積就會相差很大，尤其是當(dāng)該峰面積本身很小時，即當(dāng)雜質(zhì)含量很低 時，這種情況會更明顯。因此當(dāng)雜質(zhì)含量很低時，如雜質(zhì)含量低于3%時，更優(yōu)選雜質(zhì)含量低 于2%時，該積分方法并不適用。另外，當(dāng)雜質(zhì)含量較低時，如雜質(zhì)含量低于3%時，更優(yōu)選雜 質(zhì)含量低于2%時，主成分峰會很高，而雜質(zhì)峰相對會很小，這樣一來，兩峰之間的分離情況 就會更差，分離度更低，純度測定的誤差就會更大。因此，本發(fā)明采用的積分方式為垂線分 割法的方式來分離峰，該種方法可以消除基線抬高而引入的誤差，從而達(dá)到準(zhǔn)確定量雜質(zhì) 的目的。兩種積分方法可以參照原著Hans-Joachim Kuss, Stavros Kromidas，陳小明、唐雅 妍編譯的《液相與氣相色譜定量分析使用指南》一書的詳細(xì)介紹進(jìn)行。
[0078] 理論塔板數(shù)
[0079] 如本文所用，"USP理論塔板數(shù)"或"理論塔板數(shù)"或"理論板數(shù)"是用于評價色譜 柱的分離效能的指標(biāo)。由于不同的物質(zhì)在同一色譜柱上的色譜行為不同，采用理論板數(shù)作 為衡量柱效能指標(biāo)時，應(yīng)指明測定物質(zhì)，本文所述的理論板數(shù)為主峰的理論板數(shù)。理論板數(shù) 的計算公式為 ：
[0080] n=16 (tK/W)2 或 η=5· 54 (?κ/Χ/2)2
[0081] 其中，η為理論板數(shù)，
[0082] tK為峰的保留時間，
[0083] W為峰的峰寬，
[0084] Wh/2為峰的半高峰寬。
[0085] 通常，理論塔板數(shù)可通過控制峰的保留時間進(jìn)行調(diào)控，如改變柱長，或?qū)⒍喔V 柱串聯(lián)使用等方法實現(xiàn)。
[0086] 如本文所用，"USP分離度"或"分離度"是用來評價待測組分與相鄰共存物或難分 離物質(zhì)的分離程度的一種指標(biāo)，其是衡量色譜系統(tǒng)效能的關(guān)鍵指標(biāo)。其是參照美國藥典對 分離度的定義而來的，而中國藥典對分離度也具有相同的計算公式。在Waters公司的液相 色譜分析軟件Empower2上，可以通過積分分析而自動計算給出"USP分離度"值。其計算公 式如下：
[0087]

【權(quán)利要求】
1. 一種通過HPLC測定樣品中促性腺激素純度的方法，其特征在于，用分子排阻層析柱 對所述樣品進(jìn)行高壓液相色譜測定，從而測得所述樣品中的促性腺激素純度，其中所述分 子排阻層析柱的填料包括交聯(lián)葡聚糖、交聯(lián)瓊脂糖或其組合； 并且，所述分子排阻層析柱的主峰USP理論塔板數(shù)> 1600。
2. 如權(quán)利要求1所述的純度測定方法，其特征在于，所述的分子排阻層析柱為葡聚糖、 瓊脂糖或其混合交聯(lián)物為填料的層析柱，較佳地為由瓊脂糖和葡聚糖交聯(lián)組成的Superdex 為填料的層析柱。
3. 如權(quán)利要求1所述的純度測定方法，其特征在于，所述的理論塔板數(shù)不低于1700,更 佳地不低于1800。
4. 如權(quán)利要求1?3任一所述的方法，其特征在于，所述測定方法中使用的流動相為乙 腈和緩沖鹽溶液。
5. 如權(quán)利要求1?3任一所述的方法，其特征在于，所述測定方法中使用的流動相流速 為(λ 1?LOml/分鐘。
6. 如權(quán)利要求1?3任一所述的方法，其特征在于，所述測定方法中使用的檢測波長為 200 ?300nm〇
7. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的流動相中乙腈對水相的體積比為0? 1/2。
8. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的緩沖鹽選自下組：磷酸鹽、Tris、醋酸 鹽、氯化鈉，或其組合；較佳地，所述的緩沖鹽選自下組：磷酸鹽、氯化鈉，或其組合。
9. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的緩沖鹽溶液濃度為10mM?1700mM， 較佳地為100mM?300mM。
10. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的緩沖鹽溶液的pH為5. 0?10. 0。
11. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述促性腺激素包括選自下組的一個或多 個成分：絨毛膜促性腺激素、絕經(jīng)期促性腺素、卵泡刺激素、黃體生成素；較佳地，所述促性 腺激素包括卵泡刺激素。
12. 如權(quán)利要求1?11任一所述的方法，其特征在于，所述方法還包括如下的一個或多 個條件： a、 高壓液相色譜系統(tǒng)包括兩根串聯(lián)的Superdex7510/300GL柱； b、 流動相：乙腈：緩沖鹽溶液=1 :20?2 :5,其中所述的比例為體積比； c、 流速：0· 2 ?0· 8ml/min， d、 柱溫：25 ?45°C ; e、 檢測波長：210?235nm ; f、 進(jìn)樣濃度：3000 ?4500IU/ml。
13. 如權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，所述的樣品為促性腺激素類原粉或促 性腺激素類原料藥。
14. 一種制備促性腺激素類原料藥的方法，其特征在于，所述的促性腺激素類原料藥的 制備過程包含如下步驟： A、 用權(quán)利要求1所述的純度測定方法，測定促性腺激素類原粉的純度； B、 若步驟（A)的測定結(jié)果表明原粉中總雜質(zhì)含量> 2%，則對所述原粉重新進(jìn)行純化， 直至測定結(jié)果表明總雜質(zhì)含量< 2% ; C、若步驟（A)的測定結(jié)果表明該原粉中總雜質(zhì)含量<2%，則在該促性腺激素類原粉中 加入藥學(xué)上可接受量的賦形劑，制得促性腺激素類原料藥。
15. -種制備促性腺激素類藥物制劑的方法，其特征在于，所述的促性腺激素類藥物制 劑制備過程包含如下步驟： A、 用權(quán)利要求1所述的純度測定方法，測定促性腺激素類原料藥的純度； B、 若步驟（A)的測定結(jié)果表明該原料藥中總雜質(zhì)含量<2%，則在該促性腺激素類原料 藥中加入藥學(xué)上可接受量的賦形劑，制得促性腺激素類藥物制劑。
【文檔編號】G01N30/60GK104101656SQ201310111942
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月1日
【發(fā)明者】洪云海, 王科偉, 季曉銘 申請人:上海天偉生物制藥有限公司