專利名稱：一種通過檢測血清中骨鈣素含量來預測優(yōu)秀冰雪運動員身高的分子生物學方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種預測優(yōu)秀冰雪運動員身高的分子生物學方法。適合于優(yōu)秀冰雪運動員在蛋白水平上的早期選材，屬于體育科學與生命科學交叉的學科領域。
背景技術：
運動員的成長過程中伴隨著身體形態(tài)的變化，對運動員身體形態(tài)尤其是身高的研究是體育科學研究中基礎而又重要的一個環(huán)節(jié)。我國優(yōu)秀冰雪運動員身高特征的研究結(jié)果，將有助于完善、系統(tǒng)的科學研究體系的建立，同時對構建科學、系統(tǒng)的我國優(yōu)秀冰雪運動員的高模型起到積極作用，并為今后的身體機能、技戰(zhàn)術、心理以及形成系統(tǒng)的研究體系奠定一定的理論基礎。

自1998年長野冬季奧運會短道速滑由表演項目正式獲準成為比賽項目以來，該項目的6枚金牌倍受冰雪強國矚目。短道運動員的選材和育材也理所當然的受到關注。身高作為身體形態(tài)的一個主要方面，有哪些特點，頂尖選手和非頂尖選手之間的身高是否有差別，根據(jù)項目的特點，究竟哪種身高更為適宜，此前曾有過專門研究，但隨著時間的推移，該項目水平的提高，運動員的身高又有哪些新的特點，需要我們進一步做出更科學的研究和推斷，探討當今世界優(yōu)秀冰雪運動員的身高特征會對我國的該項目的選材和育材方面有一定的參考價值。由于我國對優(yōu)秀冰雪運動員最適身高的研究起步比較晚，而且冰雪運動員的育材和選材大部分都是靠經(jīng)驗，沒有建立在生命科學的基礎上。近些年來，隨著體育科學和生命科學的飛速發(fā)展及兩者在理論、方法、技術和手段上的相互交叉和滲透，強有力地推動者冰雪運動員早期選材向著科學化和系統(tǒng)化的方向轉(zhuǎn)型和發(fā)展。因此，有必要建立一套完善的、科學的、系統(tǒng)的分子生物學方法，從分子水平上有效地預測優(yōu)秀冰雪運動員的最適身高。骨 丐素(Osteocalcin)又名骨谷氛酸蛋白(Bonegla protein, BGP), BGP 主要由骨和牙齒中的成骨細胞合成并分泌，是體內(nèi)最豐富的非膠原骨基質(zhì)蛋白，經(jīng)肝臟和腎水解，最后由腎排除。1975年，科學家們分別從雞和牛骨骼中首先提取到BGP后，人們在其他脊椎動物上如猴、犬、馬、硬骨魚等骨骼中也發(fā)現(xiàn)了 BGP。各種屬BGP具有很高的保守性，由49 51個氨基酸組成,在21、24和27位有3個Y -羧基谷氨酸(Y -carboxyglutami cacid, Gla)，分子量小，約6ku，具有3個Gla。BGP具有特殊的翻譯后修飾，其基因首先翻譯合成骨鈣素原蛋白，去除信號肽后，骨鈣素原蛋白在維生素K羧基化酶作用下，3個Y-谷氨酸(glutamic acid, Glu)羧基化為Y _羧基谷氨酸，羧基化后的BGP與輕基磷灰(hydroxyapatite,HA)具有很強的吸附作用，既可沉積于骨骼，又可分泌入血液。在骨吸收發(fā)生時，分泌的酸性物質(zhì)又使羧基化的骨鈣素脫羧釋放入血液。因此，血液中含有多種骨鈣素，包括完全羧基化骨韓素(total carboxylated BGP),未羧基化骨韓素或脫羧后骨I丐素(uncarboxylated BGP),降解的骨 I丐素片段(small fragment osteocalcin)。BGP 表達具有組織特異性，最初研究表明，BGP的mRNA僅見于骨組織，由成熟的骨細胞合成并分泌，后來研究表明在骨髓巨核細胞和外周血小板也可表達BGP。BGP的表達還具有發(fā)育階段特異性，成骨細胞的成熟過程分為三個階段，即成骨細胞增殖期、細胞外基質(zhì)成熟期及基質(zhì)礦化期。只有在基質(zhì)礦化期開始后，BGP基因才被誘導表達。研究認為，BGP的主要功能是維持骨的正常礦化速率，抑制異常羥基磷灰石的形成，抑制生長軟骨礦化的速度，BGP與骨礦化同時出現(xiàn)，并隨骨骼生長、羥磷灰石沉積而增加。體外研究顯示:BGP為成熟成骨細胞的標志物，BGP的產(chǎn)生隨著礦化和成骨細胞分化而增加。近期研究還提示:BGP能趨化、激活破骨細胞，BGP的羧化末端對破骨細胞的前體有化學誘導作用，可調(diào)節(jié)骨吸收。BGP基因敲除的小鼠表現(xiàn)為骨形成和骨量增加，而骨吸收和骨礦化并未受到影響，提示BGP可能抑制成骨細胞活性，成骨細胞上可能表達有BGP受體，現(xiàn)已證實人成骨細胞上確實可表達BGP受體，并發(fā)現(xiàn)它屬于G-蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，與抑制性G-蛋白偶聯(lián)，BGP通過與成骨性譜系細胞的BGP素受體結(jié)合而抑制成骨細胞的活性。BGP由成骨細胞合成和分泌，其大部分沉積在骨基質(zhì)中，約20%進入血液循環(huán)，成骨細胞活性以及成骨細胞合成和分泌BGP的能力，直接影響血清BGP水平。血清骨鈣素(S-BGP)是評估骨轉(zhuǎn)換率及骨形成的特異性指標，其表達水平間接影響著冰雪運動員的身高。因此，可以通過檢測優(yōu)秀冰雪運動員血清中BGP的含量來預測優(yōu)秀冰雪運動員的最適身高，為冰雪運動員選材提供一個最適的分子生物學標準。目前已建立的BGP測定方法主要有:放射免疫法、化學發(fā)光免疫分析法、酶聯(lián)免疫吸附分析法(Enzyme linked immunosorbent analysis,ELISA)、親和素-生物素酶免疫分析法和酶免疫熒光法等。其中以放射免疫法應用最普遍，該方法靈敏度與特異性均較理想，批內(nèi)、批間變異小，回收率高，檢測線性范圍寬?；瘜W發(fā)光免疫分析法、酶聯(lián)免疫吸附分析法、親和素-生物素酶免疫分析法等方法操作簡單、快速、微量、無放射性同位素污染與標記物蛻變等優(yōu)點，缺點是特異性較差，溶血或脂血對測定有干擾，定量不夠準確。酶免疫熒光法(Pharmacia CAP系統(tǒng))測定靈敏度為0.5μ g/L，特異性100%，適合臨床推廣。采用Elecsys2010測定血清BGP、N-MID片段，是目前最先進的免疫分析法，它是由電化學和免疫學(雙抗體夾心法)測定相結(jié)合的產(chǎn)物。其產(chǎn)生的光子通過檢測儀器測定光信號強度，光強度與待測物質(zhì)濃度呈線性關系，據(jù)此可測出BGP的含量。其優(yōu)點為特異性強，靈敏度高，檢測線性可達7個數(shù)量級；重復性好`；無放射性核素的污染；操作簡單、快速。骨是骨干和骨骺的積聚物，骺軟骨區(qū)形成成骨細胞，然后由軟骨變成骨頭，身體因此變高。骨鈣素(osteocalcin)是成骨細胞的特異性表面標記物，通過ELISA技術對血液中骨鈣素進行檢測，從而推斷出軟骨組織分泌骨鈣素水平的差異情況，從分子生物學水平上預測基因表達與身高的聯(lián)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種在分子生物學水平上預測優(yōu)秀冰雪運動員身高的方法。本發(fā)明從分子生物學水平上預測了優(yōu)秀冰雪運動員的最適身高，通過ELISA技術檢測血清中骨鈣素含量比較和預測與身高的聯(lián)系。方法簡單，易操作。
具體實施例方式
下面以優(yōu)秀冰雪運動員血清中的分子標記骨鈣素為例，通過檢測其相對水平來詳細說明本發(fā)明的具體實施。實施例:檢測優(yōu)秀冰雪運動員血清中的分子標記骨鈣素的水平。選取5名優(yōu)秀冰雪運動員，每名靜脈取血5ml，于抗凝管中備用(抗凝管編號為
01-05，設為5個重復)，設為實驗組；選取5名普通人進行靜脈取血，每名5ml，于抗凝管中備用(抗凝管編號為06-10，設為5個重復)，設為對照組。ELISA定量檢測血清中骨鈣素，具體方法如下:I)上述骨鈣素蛋白用PBS配成100μ g/ml的溶液，按100 μ I/每孔加入96孔酶標板，4°C過夜吸附；2)次日將過夜包被的酶標板中未吸附的蛋白溶液倒掉，以PBS洗3次。加入3%(質(zhì)量百分比)BSA (用PBS配制不含Tween20)封閉，100 μ I/每孔，37°C，1.5h ；3)用PBS徹底洗2 )中的沉淀4次后加入實驗組血清或?qū)φ战M血清(用PBS按體積比為 I: 100,1: 500,1: 2500,1: 12500 或 I: 62500 稀釋)，100 μ I/每孔，37°C，
1.5h ；4)用PBS洗3)中的沉淀4次，加二抗(兔抗人IgG用PBS按體積比為1: 10000稀釋)，100 μ I/每孔，37°C，lh ；5)用PBS洗4)中的沉淀4次，加AP顯色液P-NPP (2mg/ml)，80 μ I/每孔，避光反應，加等體積0.2Μ NaOH終止反應；6)取100 μ 15)中終止反應后的溶液100μ 1，用酶標儀測定405nm下的OD值，并根據(jù)標準曲線，求出血清中BGP的含量。實驗組和對照組的測定結(jié)果比較其差異，并取實驗組結(jié)果的平均值作為實驗結(jié)果。實驗組測定結(jié)果顯示，實驗組血清中的BGP濃度為1.50±0.76nmol/L相對對照組血清中 BGP 濃度 1.48±0.58nmol/L 較高。
權利要求
1.一種預測優(yōu)秀冰雪運動員的身高的分子生物學方法。
2.依據(jù)權利要求1所述的分子生物學方法，其特征在于通過酶聯(lián)免疫吸附技術檢測優(yōu)秀冰雪運動員血清中骨鈣素的表達量來預測優(yōu)秀冰雪運動員的身高。
3.依據(jù)權利要求2所述，通過酶聯(lián)免疫吸附技術檢測優(yōu)秀冰雪運動員血清中骨鈣素濃度為1.50±0.76nmol /L相對普通人血清中BGP濃度1.48±0.58nmol/L較高。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預測優(yōu)秀冰雪運動員身高的分子生物學方法。本發(fā)明通過酶聯(lián)免疫吸附技術檢測并比較了優(yōu)秀冰雪運動員和普通人血液中骨鈣素的表達量，骨鈣素通過對成骨細胞的作用進而影響人的身高，因此，骨鈣素的表達水平可以間接地預測優(yōu)秀冰雪運動員的最適身高。結(jié)果顯示，通過酶聯(lián)免疫吸附技術檢測優(yōu)秀冰雪運動員血清中骨鈣素濃度為1.50±0.76nmol/L相對普通人血清中骨鈣素濃度1.48±0.58nmol/L較高。說明血清中相對較高的骨鈣素含量可以作為衡量優(yōu)秀冰雪運動員的最適身高。本發(fā)明為建立該項目運動員潛能的早期預測、評定、選材和育材的科學體系打下堅實的理論和技術基礎，提升選材的成功率，突破一次性選材的理論和技術難關。
文檔編號G01N33/68GK103235138SQ201310113488
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月3日 優(yōu)先權日2013年4月3日
發(fā)明者趙玉華, 朱志強, 劉冬, 崔鵬, 金紅, 關偉軍 申請人:哈爾濱體育學院