專利名稱：雞pcdh1基因部分片段的克隆、表達及多克隆抗體的制備的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種多克隆抗體制作技術，具體而言，就是利用設計的特定引物，通過相應手段原核表達和純化目的蛋白，免疫動物制作免疫血清，進而通過實驗闡明本抗血清用作基因蛋白表達檢測的可行性。
背景技術：
原I丐粘蛋白(Protocadherins, pcdh)是一種帶有親同種抗原粘附活性的跨膜蛋白，是鈣粘蛋白超家族中最大的亞群。/7 *主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達，迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大約有60多種在大腦中表達?，F(xiàn)有的研究表明對神經(jīng)元突觸的發(fā)育有直接的影響。pcdh分子不僅可以作為粘附分子加強神經(jīng)突觸的連接，而且還可以作為受體在信號轉導過程中起到一定作用。此外，/7 *參與細胞遷移和細胞分選，神經(jīng)元回路和神經(jīng)突觸的建立以及細胞存活和細胞生長抑制。一箜PCdh基因的突變已經(jīng)與一些人類疾病聯(lián)系在了一起。比如，功能的缺失會導致動脈管壁的結構和功能發(fā)生改變，通過啟動子的高度甲基化使沉默表達會導致17腫瘤抑制活性的消失，說明PCdhM的表達可以抑制食管癌的發(fā)生；臨床研究表明等位突變可導致隱形視網(wǎng)膜色素變性'pcdtm的突變或者缺失會造成女性患家族性的癲癇；Koppelman等發(fā)現(xiàn)是氣道高反應的易感基因，又有研究表明I是引發(fā)哮喘的并且在呼吸道上皮組織表達的一個新的易感基因。雖然目前我們對Pci*的功能有了一定的了解，但是有些Pci*在胚胎發(fā)育及病理過程中的時空表達及作用機制仍然不清楚。本發(fā)明所述以雞源I (GeneBank收錄號NM_001045827)為研究對象，建立制備其多克隆抗體的方法以及制備雞源的多克隆抗體和用于其表達檢測，迄今未見相關報道。本發(fā)明目的在于，通 過克隆、異源表達和純化特定肽段的融合蛋白，作為抗原免疫動物，制作多克隆抗體，利用此抗體檢測雞I基因在各種生理病理條件下的表達，進而提供一種的表達檢測試劑用于基礎及醫(yī)療實踐。

發(fā)明內容
本發(fā)明首先根據(jù)雞基因(GeneBank收錄號NM_001045827)的序列，先用Globplot2.3軟件分析的跨膜區(qū),然后再用DNAStar引物設計軟件設計I膜內區(qū)段引物:
上游引物 5’ -GGGATCCTCCTGCCTGGCCCTGTGGTTCCTCT-3,
下游引物 5’ -GGAATTCCTCGGGGCCAGCCAGCAGTTCATA-3> ；
上游引物和下游引物分別添加和及^RI酶切位點(下劃線所示)。從一周左右的雞胚腦組織中提取總RNA，RT-PCR反轉錄合成cDNA，再以cDNA為模板PCR擴增膜外目的片段。將目的片段連入表達載體，篩選陽性重組質粒。本發(fā)明目的之一在于提供一種雞源I特異性多克隆抗體。
本發(fā)明的目的之二在于提供制備該克隆抗體的方法。本發(fā)明的目的之三在于提供克隆表達該肽段的序列引物，該引物還可以用于RT-PCR來檢測該基因的mRNA表達水平。為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案:
一種雞源特異性多克隆抗體，其特征在于所述的特異性多克隆抗體是將氨基酸序列的第33位到204位氨基酸殘基組成的多肽特異性結合。上述的特異性多克隆抗體是將第33位到204位氨基酸殘基對應的cDNA序列構建到原核表達質粒PGEX-2TK中，得到重組質粒pGEX-2TK-pcdhl01，再將該重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，得到可溶表達帶有雞源I第33位到204位氨基酸殘基的多妝融和蛋白。上述的特異性多克隆抗體是將多肽融和蛋白作為抗原免疫動物而獲得。一種制備上述的雞源I特異性多克隆抗體的方法，其特征在于該方法的具體步驟為:
a.Mpcdhl氨基酸序列進行了蛋白跨膜結構預測，其中第I到239位氨基酸為胞外段結構；
b.用PCR擴增處于胞外段第33到204位氨基酸殘基對應的cDNA，重組入pGEX_2TK中，構建成 pGEX-2TK-pcdhl01 載體；
c.將載體轉化到疋BL21(DE3)中，原核可溶表達表達得到包含目的DCFI多肽的可溶性融合蛋白；
d.將融合蛋白為抗原免疫動物燥，得到以上述制備的蛋白，按照多抗免疫方案進行動物免疫，得到特異性多克隆抗體。利用Western Blot技術對制備得到的多克隆抗體進行特異性評測。同時利用制備的上述多克隆抗體能夠檢測到雞胚組織pcdhI蛋白的表達。制備的多克隆抗體也檢測到了的蛋白表達變化，說明制備的多克隆抗體可以用來檢測雞胚不同時期的表達水平。本發(fā)明為此提供了以下的生物學實驗:
1)pcdhI基因的RT-PCR檢測實驗；
2)Western blotting方法檢測雞胚組織中I的表達水平。本發(fā)明的優(yōu)點與積極效果在于，設計合成了克隆雞第33位到204位氨基酸殘基的引物，并且此引物可以用于RT-PCR檢測pcdh I基因的mRNA表達水平；制作了針對雞pcdhl蛋白的鼠源多克隆抗體,實驗證明此抗體可用于Western blot檢測的蛋白表達水平。


圖1 pcdhl基因pcdh胤片段PCR擴增產(chǎn)物的0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。其中: 泳道 M.DNA marker ；
泳道1.PcdhlQl PCR擴增片斷；
縮寫:bp, base pair。圖2重組表達載體的PCR及酶切檢測。其中:
泳道1.PCR擴增pET32a-pcdhl01產(chǎn)生的目的片斷；泳道 2.Βαω I 和 &oR I 雙酶切 pET32a_pcdhl01 ；
泳道 3.pET32a-pcdhl01 ；
泳道4.PCR擴增pGEX-2TK-pcdhl01產(chǎn)生的目的片斷；
泳道 5.Bam^ I 和 &oR I 雙酶切 pGEX_2TK-pcdhl01 ；
泳道 6.pGEX-2TK-101 ；
縮寫:bp, base pair ；M, DNA marker。圖3 GST-PCDH101融合蛋白的SDS-PAGE電泳檢測。其中:
泳道1.未誘導的含pGEX-2TK-pcdhl01質粒的大腸桿菌BL21全蛋白；
泳道2.誘導的含pGEX-2TK-pcdhl01質粒的大腸桿菌BL21全蛋白；
泳道3.未誘導的含pGEX-2TK-pcdhl01質粒的大腸桿菌BL21裂解沉淀；
泳道4.誘導的含pGEX-2TK-pcdhl01質粒的大腸桿菌BL21裂解沉淀；
泳道5.未誘導的含pGEX-2TK-pcdhl01質粒的大腸桿菌BL21裂解上清；
泳道6.誘導的含pGEX-2TK-pcdhl01質粒的大腸桿菌BL21裂解上清。圖4 SDS-PAGE分析(His)6-1Ol融合蛋白和純化蛋白。其中:
泳道1.未誘導的含pET32a-pcdhl01質粒的BL21總蛋白；
泳道2.1PTG誘導的含pET32a-pcdhl01質粒的大腸桿菌BL21全蛋白；
泳道3.1PTG誘導的含pET32a-pcdhl01質粒的大腸桿菌BL21沉淀；
泳道4、5.1PTG誘導的含pET32a-pcdhl01質粒的大腸桿菌BL21上清；
泳道6.純化的(His)6-PCDHlOl融合蛋白。圖5 SDS-PAGE分析重組GST-PCDH101融合蛋白。其中:
泳道1.未誘導的含pGEX-2TK-pcdhl01質粒的大腸桿菌BL21全蛋白；
泳道2.1PTG未誘導的含pGEX-2TK-pcdhl01質粒的大腸桿菌BL21全蛋白；
泳道3、4.純化的GST-P⑶HlOl融合蛋白(星號標示目的蛋白)；M，蛋白marker。圖6 Western blot分析抗體特異性。其中:
泳道1.370C IPTG誘導的BL21全蛋白(含pET32a_pcdh 1701質粒)；
泳道2.純化的(His)6-PCdhlOl融合蛋白；
泳道3.純化的GST-pcdhlOl融合蛋白。圖7 Western blot分析在雞胚不同發(fā)育階段及不同部位的表達情況。其中:
泳道1.發(fā)育6.5天的雞胚脊索；
泳道2、3、4分別是發(fā)育6.5天、7.5天、8.5天雞胚胎中pcdhl的表達。圖8 pcdhl基因在各個時期的mRNA水平RT-PCR半定量分析。實施例
以下實施例僅為幫助所屬領域技術人員更好的理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。(I)引物設計及載體的構建
先用Globplot2.3軟件分析的跨膜區(qū)，然后再用DNAStar引物設計軟件設計pcdhl膜內區(qū)段引物:
上游引物 5’ -GGGATCCTCCTGCCTGGCCCTGTGGTTCCTCT-3,下游引物 5’ -GGAATTCCTCGGGGCCAGCCAGCAGTTCATA-3> ；
上游引物和下游引物分別添加和及^RI酶切位點(下劃線所示)。用發(fā)育一周左右的雞胚腦組織提取總RNA，RT-PCR反轉錄合成cDNA。再以cDNA為模板PCR擴增膜內目的片段，電泳結果如圖1所示。將目的片段連入T載體測序驗證無誤后再分別插入表達載體PGEX-2TK和pET32a中構建成pGEX_2TK-pcdhl01和pET32a_pcdhl01表達質粒，酶切鑒定結果如圖2所示。(2)重組載體在大腸桿菌中的誘導和表達和純化
將經(jīng)測序正確的重組質粒pGEX-2TK-pcdhl01和pET32a_pcdhl01表達質粒分別轉入E.coli BL21，在含羧芐的 LB培養(yǎng)基中進行篩選培養(yǎng)。挑取單克隆至含羧芐LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜。以1:50的比例接種于含羧芐LB培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)至對數(shù)期(A55tl為0.5-1.0)時，加入IPTG至終濃度0.lmmol/L，2rC繼續(xù)培養(yǎng)6-7h。離心收集菌體，PBS洗漆兩次，超聲波破碎，12000rpm離心IOmin,收集上清。用Glutathione-sepharose 4B柱親和層析純化GST-P⑶Hl融合蛋白。SDS-PAGE電泳檢測，考馬斯亮藍R-250染色30min，乙醇-冰醋酸脫色后觀察，結果如圖3飛所示。(3)免疫大鼠
取10周左右的大鼠3只，腹腔注射戊巴比妥(75mg/kg)，每只斷尾取ΙΟΟμ L外周血樣本作為免疫前血清。每只大鼠腳墊注射200 μ L乳劑(含200 μ g目的蛋白，用等量的生理鹽水和弗氏完全佐劑乳化)。兩周后，每只取ΙΟΟμ L的外周血檢測血清抗體的濃度，然后用相同劑量的乳劑加強免疫。強化免疫一周后，用乙醚將大鼠深度麻醉，通過股大腿靜脈收集所有的血液，370C孵育30min，使血清分離出來，然后lOOOrmp，4°C，離心20min，收集血清，將血清每20 μ L分裝，儲存于-80°C。(4)間接 ELISA 檢測
用純化的(His)6-PCDHl包被酶標板，每孔100μ L，4°C過夜，((His)6-PCDHl用ρΗ9.6，
0.05Μ的碳酸鹽包被緩沖液稀釋成1-10 μ g)。棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液PBST洗滌3次，每次輕敲板壁。用PBST (含有1%的Tween20)配制的5%的脫脂奶粉(每孔200 μ L) 37°C封閉2h。將按一定比例稀釋的血清加入酶標板中37°C孵育2-3h (每孔100μ L)，PBST洗滌3-5次，將HRP標記的山羊抗大鼠(1:5000)加入各孔，每孔100μ L，37°C孵育lh，PBST洗滌3-5次，每孔加100 μ L的TMB底物顯色液，作用5_10min，用2M的濃硫酸終止反應(每孔100 μ L),450nm下測定OD值。結果表明在稀釋度大于1:5000時仍能很好的發(fā)揮作用。(5) Western Bloting 檢測抗體特異性
分別取37 °C IPTG誘導的萬.co7iBL21全蛋白(含pET32a_pcdh 1701質粒)、純化的(His)6- pcdh 101融合蛋白及純化的GST-pcdhlOl融合蛋白作加入一定量的5X上樣Buffer煮沸5min進行SDS-PAGE電泳，分離膠濃度10%，200mA轉膜3h至PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉(g/ml，含l%Tween20的TBST配制)室溫封閉2_3h，用TBST稀釋的一抗((His)6-PCDHl, 1:500)室溫孵育2_3h或者4°C過夜，TBST洗滌3次，每次lOmin，用TBST稀釋的二抗(HRP標記的山羊抗大鼠，1:5000)室溫孵育lh，TBST洗滌3次，每次lOmin。然后用ECL發(fā)光試劑進行發(fā)光，在暗示進行曝光，顯影、定影后觀察，結果如圖6所示，表明此多克隆抗體具有較好的特異性。(6)雞胚不同發(fā)育時期/7 * I的表達檢測用勻漿器對E6.5的雞胚的軀干，E6.5、E7.5、E8.5的雞胚的雞腦進行研碎，12000rmp、4°C離心5min,分離上清，加入一定量的5X上樣Buffer煮沸5min進行SDS-PAGE電泳。200mA轉膜3h至PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉(g/ml，含l%Tween20的TBST配制)室溫封閉2-3h，用TBST稀釋的一抗((His)6-PCDHl, 1:500)室溫孵育2_3h或者4°C過夜，TBST洗滌3次，每次lOmin，用TBST稀釋的二抗(HRP標記的山羊抗大鼠，1:5000)室溫孵育lh，TBST洗滌3次，每次lOmin。然后用ECL發(fā)光試劑進行發(fā)光，在暗示進行曝光，顯影、定影后觀察，實驗結果如圖6-7所示，表明此多抗可以靈敏和有效檢測雞胚中I蛋白的表達。 (7 )雞胚中pcdh I基因mRNA表達水平的半定量RT-PCR檢測
用 TRIzol 提取不同發(fā)育時期(E4, E4.5, E5.5, E6.5, E7.5, E9, ElO, Ell.5, E12,E13)雞胚腦的總 RNA,用 Fermentas RevertAid First Strand Synhesis Kit 反轉錄 cDNA,GAPDH作為陽性對照和內參，GAPDH引物序列為:
上游:5’ -GGGCTCATCTGAAGGGTGGTGCTA-3’
下游:5’ -GTGGGGGAGACAGAAGGGAACAGA-3，
目的基因用前邊所述的引物來檢測:
上游引物 5’ -GGGATCCTCCTGCCTGGCCCTGTGGTTCCTCT-3,
下游引物 5’ -GGAATTCCTCGGGGCCAGCCAGCAGTTCATA-3> ；
PCR結果用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果 如圖8所示。
權利要求
1.一種雞特異性多克隆抗體的制備方法，其特征是包括如下步驟: (1)根據(jù)雞基因，設計并合成引物:上游引物 5’ -GGGATCCTCCTGCCTGGCCCTGTGGTTCCTCT-3，,下游引物 5’ -GGAATTCCTCGGGGCCAGCCAGCAGTTCATA-3> ； 通過RT-PCR擴增雞pci* I基因片段，其全長為516 bp ； (2)將步驟(I)獲得的基因片段連入表達載體pGEX-2TK中，將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌疋co7i DH5a感受態(tài)細胞，篩選得到重組表達質粒pGEX-2TK_pcdhl01 ; (3)將步驟(2)獲得的表達雞基因片段的重組表達質粒轉化到大腸桿菌萬.coliBL21中，用LB液體培養(yǎng)基，21°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，誘導； (4)將誘導后的菌體在4°C下離心收集，用去離子水和PBS分別清洗，加入溶菌酶并超聲裂解破碎，離心破碎后的菌液，收集上清； (5)使用GlutathioneSepharose 4B親和層析柱純化融合蛋白； (6)把純化后的融合蛋白作為抗原，采用常規(guī)多克隆抗體制備方法制備抗血清。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種雞特異性多克隆抗體的制備方法，其特征在于步驟(3)中，所述誘導為:21°C，加入0.1 M IPTG培養(yǎng)6-7小時。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種雞特異性多克隆抗體的制備方法，其特征在于步驟(5)所述融合蛋白是谷胱甘肽-S轉移酶與雞基因編碼序列的第33位到204位氨基酸殘基融合表達的蛋白。
4.權利要求1-3任一方法所制備的雞pcdhl特異性多克隆抗體在檢測雞基因表達中的用途。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種雞特異性多克隆抗體的制備方法，其特征在于步驟(I)中，所述引物在檢測雞基因mRNA表達水平中的應用。
全文摘要
發(fā)明涉及protocadherin1(pcdh1)基因的部分序列在制備多克隆抗體和表達檢測中的應用，具體而言，是對雞pcdh1基因的部分序列進行了PCR擴增，插入到表達載體，并通過在大腸桿菌E.coliBL21中原核表達和融合蛋白親和純化，把純化的蛋白與弗氏完全佐劑混合乳化后通過足墊等部位多點注射免疫SD大鼠,快速地產(chǎn)生針對目的抗原的特異性抗體。利用該方法快速制作的免疫血清，對不同發(fā)育階段雞胚中的pcdh1基因的表達情況進行檢測，說明利用本方法制作的針對pcdh1蛋白部分肽段的多抗有望成為pcdh1基因蛋白表達檢測的有效工具。
文檔編號G01N33/68GK103194476SQ20131011523
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月7日 優(yōu)先權日2013年4月7日
發(fā)明者李永海, 李萌, 陳國榮, 王琳, 陳紅麗, 劉涌濤, 趙興華, 李超英, 豐慧根, 林俊堂 申請人:新鄉(xiāng)醫(yī)學院