專利名稱：可分泌抗心肌肌鈣蛋白i單抗的雜交瘤細胞及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及心肌肌鈣蛋白I免疫檢測領(lǐng)域，尤其是涉及一種可分泌抗心肌肌鈣蛋白I單抗的雜交瘤細胞及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
20世紀(jì)80年代前，世界衛(wèi)生組織(WHO) —直將心肌酶譜活性作為急性心肌梗死(AMI)的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。20世紀(jì)80年代末,科研人員發(fā)現(xiàn),肌I丐蛋白(troponin, Tn)的敏感性和特異性高于磷酸肌酸激酶(CK)、磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶等生物標(biāo)志物。心肌肌鈣蛋白I(cTnl)僅存于心肌，是心肌細胞的標(biāo)志物，其異常改變可影響心臟的舒縮功能，并可用于診斷心肌壞死，判斷心肌損傷等，成為心肌細胞損傷敏感性和特異性最強的標(biāo)志物之一，是公認的快速診斷AMI和急性冠脈綜合征(acutecoronary syndromes, ACS)以及協(xié)助ACS危險分層和反映其預(yù)后的主要生化標(biāo)志。正常人血液中cTnl含量一般低于0.3 μ g/L。當(dāng)心肌細胞胞膜完整性因缺血或缺氧等受到破壞時，游離的cTnl可迅速透過細胞膜進入血流。因此，在發(fā)病初期快速、靈敏且準(zhǔn)確的測定人血中的cTnl及其變化趨勢對急性心肌梗死的診斷、急性冠狀動脈綜合征的危險分層、監(jiān)測各種因素導(dǎo)致的心肌損傷等有著重要的臨床意義。然而傳統(tǒng)的ELISA法存在測定周期偏長、靈敏度相對低、線性范圍偏窄等諸多不足；化學(xué)發(fā)光法和酶聯(lián)熒光分析法靈敏度高，特異性好，但是需要專用設(shè)備，使用不方便，投入也比較大。單克隆抗體可用于分析抗原的細微結(jié)構(gòu)及檢驗抗原抗體未知的結(jié)構(gòu)關(guān)系，生產(chǎn)出針對復(fù)雜生物混合物中的特定分子的抗體，可用于分離、分析及純化該特定分子抗原；其試劑可用于臨床診斷和治療。研究發(fā)現(xiàn)，人cTnl(hcTnl)是一種全α型蛋白質(zhì)，有五個螺旋區(qū)域，呈伸展式構(gòu)型，其抗體識別相應(yīng)抗原表位不依賴于蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，使其大部分氨基酸序列易被免疫系統(tǒng)識別。cTnl合成肽與多種單抗的反應(yīng)表明，該蛋白質(zhì)中絕大多數(shù)氨基酸序列具有抗原性，特別是N端和C端的序列抗原性非常強。因此，在cTnl的快速檢測領(lǐng)域，研究開發(fā)適合于快速檢測用的抗體具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
基于此，有必要提供一種可快速簡便的應(yīng)用于hcTnl檢測的可分泌抗心肌肌鈣蛋白I單抗的雜交瘤細胞及其分泌的單克隆抗體。此外，還有必要提供上述雜交瘤細胞或單克隆抗體在醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域的應(yīng)用。一種可分泌抗心肌肌鈣蛋白I單抗的雜交瘤細胞，保藏號為CCTCC No:C201317。一種由上述可分泌抗心肌肌鈣蛋白I單抗的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體。上述可分泌抗心肌肌鈣蛋白I單抗的雜交瘤細胞可應(yīng)用在制備心肌肌鈣蛋白I的檢測試劑或設(shè)備領(lǐng)域中。上述單克隆抗體可應(yīng)用在制備心肌肌鈣蛋白I檢測試劑或設(shè)備領(lǐng)域中。

一種心肌肌鈣蛋白I的檢測試紙，包括上述單克隆抗體。
在優(yōu)選的實施例中，所述檢測試紙包括支撐薄片、樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸收墊、檢測線及質(zhì)控線，所述樣品墊、所述金標(biāo)墊、所述硝酸纖維素膜及所述吸收墊從所述支撐薄片的一端向另一端依次設(shè)置在所述支撐薄片上，所述樣品墊與所述金標(biāo)墊部分重疊，所述金標(biāo)墊與所述硝酸纖維素膜部分重疊，所述硝酸纖維素膜與所述吸收墊部分重疊，所述檢測線及所述質(zhì)控線設(shè)在所述硝酸纖維素膜上，且所述檢測線設(shè)在靠近所述金標(biāo)墊的一端，所述質(zhì)控線設(shè)在靠近所述吸收墊的一端，所述金標(biāo)墊上涂覆有所述單克隆單體包附膠體金顆粒形成膠體金標(biāo)記的單克隆抗體，所述檢測線為親和純化的抗心肌肌鈣蛋白I的兔多抗，所述質(zhì)控線為羊抗鼠IgG抗體。一種檢測試劑盒，包括上述心肌肌鈣蛋白I的檢測試紙。上述雜交瘤細胞，命名為cTnI_C4，于2013年I月24日保藏在湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心(即中國典型培養(yǎng)物保藏中心)，保藏號是CCTCC No:C201317。上述雜交瘤細胞的分泌產(chǎn)量高，其分泌得到的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體具有高親和力、高特異性等優(yōu)點，可廣泛應(yīng)用在制備心肌肌鈣蛋白I的檢測領(lǐng)域，如檢測試劑或檢測設(shè)備的制備領(lǐng)域等，在特異性、靈敏度和檢測率等方面較之傳統(tǒng)的檢測方法具有顯著的優(yōu)勢。


圖1為一實施方式的檢測試紙的正面示意圖；圖2為圖1中檢測試紙的縱截面示意圖；圖3為檢測試劑盒示意圖。
具體實施例方式本實施方式的可 分泌抗心肌肌鈣蛋白I單抗的雜交瘤細胞保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCC No:C201317。該雜交瘤細胞可分泌出抗心肌肌鈣蛋白I的單克隆抗體。該雜交瘤細胞及其分泌的單克隆抗體可用于制備心肌肌鈣蛋白I的檢測試劑或設(shè)備領(lǐng)域中。一實施方式的心肌肌鈣蛋白I的檢測試劑盒包括殼體、檢測試紙和其他檢測試劑。如圖1和圖2所示，本實施方式的檢測試紙100包括支撐薄片110、樣品墊120、金標(biāo)墊130、硝酸纖維素膜140、吸收墊150、檢測線160及質(zhì)控線170。樣品墊120、金標(biāo)墊130、硝酸纖維素膜140及吸收墊150從支撐薄片110的一端向另一端依次設(shè)置在支撐薄片110上。樣品墊120與金標(biāo)墊130部分重疊，金標(biāo)墊130與硝酸纖維素膜140部分重疊，硝酸纖維素膜140與吸收墊150部分重疊。檢測線160及質(zhì)控線170設(shè)在硝酸纖維素膜上，且檢測線160設(shè)在靠近金標(biāo)墊130的一端，質(zhì)控線170設(shè)在靠近吸收墊150的一端。支撐薄片110采用不吸水的材料制作。樣品墊120用于樣品點樣。單克隆單體包附膠體金顆粒形成膠體金標(biāo)記的單克隆抗體均勻涂覆在金標(biāo)墊130上。檢測線160為親和純化的抗心肌肌鈣蛋白I的兔多抗，質(zhì)控線170為羊抗鼠IgG抗體。如圖3所示，檢測試紙100可置于檢測試劑盒的殼體200內(nèi)。殼體200上開設(shè)有加樣孔210及觀察窗220。加樣孔210對應(yīng)樣品墊120的位置。檢測線160及質(zhì)控線170裸露于觀察窗220中，方便觀察。其他檢測試劑可以根據(jù)需要直接在實驗室制備。上述檢測試劑盒利用雙抗體夾心法來檢測被檢材料中的心肌肌鈣蛋白I。檢測時，樣品中所有的cTnl先和金標(biāo)記抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體結(jié)合，由于毛細管作用，反應(yīng)復(fù)合物沿硝酸纖維素膜140向前泳動，若樣品中有cTnl，到達檢測線160時，遇到包被在硝酸纖維素膜140上的抗心肌肌鈣蛋白I的兔多抗，就會形成兔多抗-心肌肌鈣蛋白1-金標(biāo)記單克隆抗體復(fù)合物，從而富集在檢測線160上,形成紅色沉淀線；未結(jié)合cTnl的金標(biāo)記單克隆抗體則通過檢測線160，被羊抗鼠IgG抗體捕獲，富集在質(zhì)控線170上，形成紅色沉淀線。當(dāng)檢測線160與質(zhì)控線170上同時有紅色沉淀線時判為陽性結(jié)果。若樣品中不含有cTnl，反應(yīng)復(fù)合物到達檢測線160時，遇到捕獲多抗就不會形成兔多抗-cTnl-金標(biāo)記單克隆抗體復(fù)合物，反應(yīng)復(fù)合物通過檢測線160，僅富集在質(zhì)控線170上形成紅色沉淀線，此時判為陰性結(jié)果。此外，在其他實施方式中，該檢測試劑盒的結(jié)構(gòu)不限于上文描述。上述單克隆抗體除應(yīng)用在上述膠體金標(biāo)記的單抗檢測試劑盒外，還可以用于其他心肌肌鈣蛋白I檢測試劑盒或設(shè)備中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，將本實施方式的單克隆抗體直接或間接結(jié)合其他信號基團(如磁性微球、辣根過氧化酶等)，或?qū)⒈緦嵤┓绞降膯慰寺】贵w作為包被抗體(例如ELISA)，則可用于其他形式的心肌肌鈣蛋白I檢測試劑或設(shè)備。故本實施方式所制備得到的雜交 瘤細胞及其分泌的單克隆抗體可廣泛適用于制備心肌肌鈣蛋白I檢測試劑或設(shè)備。下面主要結(jié)合附圖及具體實施例對可分泌抗心肌肌鈣蛋白I單抗的雜交瘤細胞及相關(guān)應(yīng)用作進一步詳細的說明。實施例1雜交瘤細胞的建立與抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的制備1.抗原免疫將人重組心肌肌鈣蛋白I抗原(1.5mg/ml，深圳市菲鵬生物股份有限公司生產(chǎn)，貨號AG-CTN1-HP0005)與等體積的弗氏完全佐劑(外觀:琥珀色細胞懸浮液；組份=ParaffinOi 185%,Mannide Monooleatel5%,Mycobacterium smegmatislmg/ml)混合，得到油狀乳液。將該乳液以0.2ml的劑量皮下施給BALB/c小鼠(廣州省實驗動物中心，6周齡雌性，5只)背部位點，第一次免疫14天后腹腔增強免疫(抗原與等量弗氏不完全佐劑混合)，增強免疫到四針后，采尾血進行效價檢測，效價達到融合要求。融合前3天，用相同劑量抗原腹腔注射追加免疫，免疫方法同上。2.雜交瘤細胞的制備(I)飼養(yǎng)細胞的制備以BALB/c鼠腹腔巨噬細胞作飼養(yǎng)細胞。在融合前I天，將BALB/c鼠拉頸處死并用75%酒精全身浸泡，在超凈臺內(nèi)，無菌操作下用剪刀剪開腹部皮膚，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液5ml，反復(fù)沖洗，回收沖洗液，IOOOrpm,離心5分鐘，留沉淀，用RPMI1640篩選培養(yǎng)液(含HAT的RPMI1640完全培養(yǎng)液中)重懸，調(diào)整細胞濃度I X IO5個/ml，加入96孔板，15(^1/孔，在37°〇、5%0)2環(huán)境中培養(yǎng)過夜。(2)免疫脾細胞的制備小鼠末次免疫后三天，在無菌條件下取出脾臟，置于平皿中，RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液沖洗一次，放于小燒杯的尼龍網(wǎng)上磨碎過濾，制成細胞懸液。離心，棄上清，RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸，如此重復(fù)三次，得到免疫脾細胞，計數(shù)。(3)骨髓瘤細胞的制備將小鼠骨髓瘤細胞Sp2/0 (深圳市菲鵬生物股份有限公司保存)經(jīng)8-氮鳥嘌呤篩選后，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取兩大瓶制成細胞懸液，離心，棄上清，用RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸，如些重復(fù)三次，得到骨髓瘤細胞，計數(shù)。(4)細胞融合及HAT選擇雜交瘤將骨髓瘤細胞與免疫脾細胞按1:10的細胞數(shù)量比例混合，在50ml塑膠離心管內(nèi)用RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗I次，在1200rpm下離心8分鐘，棄上清，將細胞混勻，緩慢加入Iml50%的PEG1500融合，融合I分鐘后加入15ml的RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止細胞融合。IOOOrpm,離心5分鐘，棄上清，用50ml的RPMI1640篩選培養(yǎng)液輕輕混懸，平分于10塊96孔板，50 μ I/孔，在37°C、5%C02環(huán)境中培養(yǎng)。培養(yǎng)至第六天，換HT培養(yǎng)液(含HT的RPMI1640完全培養(yǎng)液)兩次。(5)抗體的檢測用0.06M pH9.6碳酸緩沖溶液稀釋人重組心肌肌鈣蛋白I抗原(深圳市菲鵬生物股份有限公司生產(chǎn)，貨號AG-CTN1-HP0005)，使其終濃度為8 μ g/ml。加入96孔聚苯乙烯板，每孔0.1ml, 370C 2小時或4°C過夜。次日，用含10%小牛血清或1%脫脂奶粉的0.02MpH7.2PBS，0.15ml/孔，37°C封閉2小時，用于檢測。重組融合后第七天，取細胞上清0.1ml于上述96孔檢測板中，37°C 30分鐘，水洗六次后加入2000倍稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG (深圳市菲鵬生物股份有限公司生產(chǎn)，貨號BA-PAB-MU0001)，37°C 30分鐘同上洗后，每孔加入100μ I含0.1% (Μ/V)鄰苯二胺，0.1% (V/V)雙氧水，ρΗ5.0檸檬酸磷酸緩沖液，370C 15分鐘，加入稀硫酸溶液，每孔50 μ 1，測450nm吸收值。RPMI1640完全培養(yǎng)液作為陰性對照，以測定值與對照值得比3 2.0為陽性細胞孔。分泌抗體陽性細胞孔以I個細胞/孔在96孔培養(yǎng)板上用有限稀釋法克隆，篩選陽性孔依上法連續(xù)克隆三次，擴大培養(yǎng)后，用含10%DMS0的培養(yǎng)液凍存，細胞密度為IO6個/ml。細胞融合一次共獲得I株能穩(wěn)定分泌抗體的細胞株，即可分泌抗心肌肌鈣蛋白I單抗的雜交瘤細胞，命名為cTn1-C4雜交瘤細胞，于2013年I月24日保藏在湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心(即中國典型培養(yǎng)物保藏中心)，保藏號是CCTCC No:C201317。3.單克隆抗體的制備選6 8周健壯的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml的降植烷；10天后腹腔注射I X IO6個雜交瘤細胞。接種細胞7 10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲5 IOml腹水。收集腹水，離心取上清，放于_20°C冰箱保存。取腹水上清，用3倍體積的PBS稀釋后濾紙過濾。將所得的濾液在lml/min的流速下加到一個已用PBS平衡的蛋白G親和層析柱(購自Amersham Biosciences公司)。然后用PBS以lml/min的流速洗滌未被蛋白G吸附的物質(zhì)直至在0D280nm下的吸附值達到基線為止。再用0.1M的甘氨酸洗脫液(pH2.5)洗脫并回收該抗體。所回收的溶液用0.1M TRIS(pH8.8)中和，通過超濾將抗體濃度調(diào)節(jié)到一個合適的濃度，_20°C分裝凍存。4.效價測定`
以間接ELISA法檢測，上述cTnI_C4雜交瘤細胞培養(yǎng)上清效價2.18X 103，腹水抗體效價1.59X 106。具體實驗步驟如下:(I)包被:將免疫的cTnl抗原稀釋至8ug/ml，IOOul/孔加至酶標(biāo)板，37度2小時或者4度過夜；(2)用洗板機洗板5次，每次每孔注洗液350ul，停留20秒；最后拍干；(3)用洗滌液洗去包被液，用封閉液封閉，每孔150ul，37度放置1.5h_2h ；(4)洗板機洗板5次，每次每孔注洗液350ul，停留20秒；最后拍干；(5)加樣品:分 別將稀釋成不同梯度的細胞培養(yǎng)上清和腹水加入用cTnl包被好的酶標(biāo)板，IOOul/孔，37度反應(yīng)I小時(同時做陰性對照孔和陽性對照孔)；(6)洗板機洗板5次，每次每孔注洗液350ul，停留20秒；最后拍干；(7)加辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG (用封閉液稀釋2000倍)，IOOul/孔，37度反應(yīng)I小時；(8)洗板機洗板5次，每次每孔注洗液350ul，停留20秒；最后拍干；(9)加顯色液TMB:即用即配，IOOul/孔，37度避光反應(yīng)30分鐘；(10)終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入2M的硫酸，50ul/孔；(11)酶標(biāo)儀讀數(shù):450nm，630nm波長測定，最終測定cTnI_C4雜交瘤細胞培養(yǎng)上清與重組cTnl抗原的反應(yīng)效價為2.18X IO3,腹水抗體與重組cTnl抗原反應(yīng)效價為
1.59 X IO605.單克隆抗體鑒定親和力:上述cTnI_C4雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體以ELISA法檢測，其親和力常數(shù)(Kaff)為1.16X109。以下為具體測定cTn1-C4雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體親和力的過程:以定量的小鼠IgG作標(biāo)準(zhǔn)品，用純化羊抗鼠IgG抗體分別作包被抗體和酶標(biāo)抗體，用雙抗體夾心ELISA測定雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中的單抗總蛋白濃度。然后將高度純化的cTnl抗原(8ug/ml)以原倍、1:2和1:4三種倍比稀釋度包板于微孔酶標(biāo)板,加入已知濃度且進行倍比稀釋的單抗上清液，反應(yīng)后繼續(xù)加酶標(biāo)羊抗鼠IgG抗體。最后以各單抗不同濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以其相應(yīng)的OD492值為縱坐標(biāo)，繪制出包不同濃度板抗原的三條反應(yīng)曲線，取各曲線上部趨于平坦段的OD492值為0D-100，查出其0D-50點的單抗?jié)舛萚Ab]t，故可得[Ab] t, [Ab' ]t和[Ab" ]t三個值,按下列Beatty等推導(dǎo)公式計算Kaff值:當(dāng)包被抗原濃度比為1:2時:Kaff^l/2 (2 [Ab' ]t_[Ab]t)或Kaff2=l/2 (2 [Ab" ] t_[Ab' ] t)1:4 時:Kaff3=3/2 (2 [Ab" ] t_[Ab] t)這樣單抗每次測定可得三個Kaff值，平均值即其親和力常數(shù)Kaff。實施例2心肌肌鈣蛋白I膠體金檢測試紙的制備1.硝酸纖維素膜的制備包被緩沖液的配制:含6%甲醇、0.0lM pH7.2PBS緩沖液為包被緩沖液，0.22 μ m膜濾過，置4°C備用，有效期一周。1000ml6%甲醇的0.0lM pH7.2PBS緩沖液配方:NaCL8g、KCL0.2g、Na2HPO4.12H202.9g、KH2PO40.2g、甲醇 60ml，雙蒸去離子水定容至 1000ml。
硝酸纖維素膜的制備:用包被緩沖液將抗心肌肌鈣蛋白I兔多克隆抗體(深圳市菲鵬生物股份有限公司生產(chǎn)，貨號PAB-CTN1-AP0002)稀釋到I 5mg/ml，調(diào)整機器，劃線為T線，即為檢測線，T線靠近金標(biāo)墊端，距金標(biāo)墊端約5mm ;用包被緩沖液將羊抗鼠IgG抗體(深圳市菲鵬生物股份有限公司生產(chǎn)，貨號BA-PAB-MU0001)稀釋到I 5mg/ml，調(diào)整機器，劃線為C線，即為控制線，C線靠近吸收墊，距吸收墊約3mm。兩線距離5 8mm，均勻。37°C烘干，封裝備用。2.膠體金、金標(biāo)記單克隆抗體的制備(1)溶液的配制①氯金酸的配制:用雙蒸去離子水溶解氯金酸，配成1%溶液，置4°C備用，有效期四個月。1OOOml 1%氯金酸溶液配方:10g氯金酸:雙蒸去離子水定容至1000ml。②檸檬酸三鈉的配制:用雙蒸去離子水溶解檸檬酸鈉，配成1%溶液，0.22 μ m膜濾過，置4度備用，有效期容至IOOOml。③0.1M碳酸鉀的配制:用雙蒸去離子水配制，0.22μπι膜濾過，置4度備用，有效期四個月。IOOOml0.1M碳酸鉀溶液配方:13.8g碳酸鉀；雙蒸去離子水定容至1000ml。④2%PEG_20000的配制:用雙蒸去離子水配制，0.22 μ m膜濾過，置4°C備用，有效期四個月。1000ml2%PEG-20000溶液配方:20g PEG-20000 ;雙蒸去離子水定容至1000ml。⑤標(biāo)記洗滌保存液的配制:2%牛血清白蛋白(BSA)，0.05%疊氮鈉(NaN3), 0.0lMpH7.2PBS溶液，0.22 μ膜濾過，置4°C備用，有效期四個月。IOOOml標(biāo)記洗滌保存液配方:20g BSA, 0.5g NaN3、0.0lM ρΗ7.2PBS 溶液定容至 1000ml。(2)膠體金的制備:用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01%，置電爐煮沸，按每IOOml0.01%氯金酸加入2mll%檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，直到液體呈亮紅色即停止加熱，冷卻至室溫后補足失水。制備好的膠體金外觀應(yīng)純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，有效期一周。(3)膠體金標(biāo)記單克隆抗體的制備:用0.1M碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值至8.2,按8 10 μ g抗體/ml膠體金加入實施例1中制備得到的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體，磁力攪拌器混勻30min，攪拌下加入BSA至終濃度為1%靜置I小時。13000rpm、4°C離心30min，棄上清，沉淀用標(biāo)記洗滌保存液洗滌兩次，用十分之一初始膠體金體積的標(biāo)記洗滌保存液將沉淀重懸，置4°C備用，有效期一周。3.金標(biāo)墊的制備(1)封閉液的配制:2%BSA, 0.l%TritonX-100、0.05%NaN3,0.0lM ρΗ7.2PBS 溶液，0.22 μ m 膜濾過，置 4度備用，有效期四個月。IOOOml 封閉液配方:20g BSA,0.5g NaN3、lml TritonX_100、0.0lMpH7.2PBS溶液定容至1000ml。(2)金標(biāo)墊的制備:將金標(biāo)墊浸泡于封閉液中30min后，于37°C烘干。然后將制備好的金標(biāo)記抗體均勻的鋪在金標(biāo)墊上，每毫升溶液鋪20平方厘米，冷凍干燥，封裝，置4°C備用。4.試紙條樣品墊的制備(1)封閉液的配制:2%BSA, 0.l%TrtionX-100、0.05%NaN3,0.0lM ρΗ7.2PBS 溶液，0.22 μ m 膜濾過，置 4度備用，有效期四個月。IOOOml 封閉液配方:20g BSA,0.5g NaN3、lml TrtionX_100、0.0lMpH7.2PBS溶液定容至1000ml。(2)樣品墊的制備:將樣品墊浸泡于封閉液中30min后，于37°C烘干，封裝，置4°C備用。5.檢測試紙的組裝將吸收墊(購自Millipore公司)、硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊設(shè)置在不吸水的支撐薄片上，切成3mm寬的小條。每十小條一包，加入干燥劑，真空封裝，得到所述檢測試紙。實施例3檢測心肌肌鈣蛋白I的試劑盒1.快速檢測心肌肌鈣蛋白I的試劑盒包括:實施例2制作的檢測試紙及樣品稀釋液。其中，樣品稀釋液為8%NaCl溶液。配制方法:80gNaCl，加蒸餾水定容至1000ml。2.膠體金法心肌肌鈣蛋白I的檢測(I)直接吸取120 μ I采集好的人血清或血漿加入到試紙卡加樣孔，等待15min后
即可觀察結(jié)果。(2)結(jié)果判定:當(dāng)試紙條出現(xiàn)肉眼可見的紅色質(zhì)控線，沒有出現(xiàn)肉眼可見的紅色檢測線，結(jié)果判為陰性；當(dāng)試紙條出現(xiàn)肉眼可見的紅色質(zhì)控線，同時也出現(xiàn)肉眼可見的紅色檢測線，結(jié)果判為陽性。檢測線顏色越深說明被檢測樣品的心肌肌鈣蛋白I水平越高。當(dāng)試紙條沒有出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質(zhì)控線，不管有沒有出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色檢測線，結(jié)果都判為檢測試紙條失效，應(yīng)廢棄。實施例4快速診斷心肌肌鈣蛋白I試劑盒的應(yīng)用以羅氏心肌肌鈣蛋白I診斷試劑盒(TiOponin I STAT)檢出的陽性樣本和陰性樣本作為本試劑盒的檢測樣本，其中205例心肌肌鈣蛋白I檢測陽性樣本，800例檢出陰性樣本，檢測結(jié)果見表I。結(jié)果表明，本試劑盒檢出陽性標(biāo)本201份，相對靈敏度為98.05% ；800份陰性樣本檢出771份，其中29份為假陽，相對特異性為96.38%。該結(jié)果與羅氏心肌肌鈣蛋白I檢測試劑盒的結(jié)果符合率為96.72%。說明實施例3制作的檢測試劑盒完全可以用于常規(guī)的心肌肌鈣蛋白I快速診斷。表I實施例3的心肌肌鈣蛋白I檢測試劑盒的檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種可分泌抗心肌肌鈣蛋白I單抗的雜交瘤細胞，保藏號為CCTCC No:C201317。
2.權(quán)利要求1所述的可分泌抗心肌肌鈣蛋白I單抗的雜交瘤細胞在制備心肌肌鈣蛋白I檢測試劑或設(shè)備中的應(yīng)用。
3.一種由權(quán)利要求1所述的可分泌抗心肌肌鈣蛋白I單抗的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體。
4.權(quán)利要求3所述的單克隆抗體在制備心肌肌鈣蛋白I檢測試劑或設(shè)備中的應(yīng)用。
5.一種心肌肌鈣蛋白I的檢測試紙，其特征在于，包括如權(quán)利要求3所述的單克隆抗體。
6.如權(quán)利要求5所述的心肌肌鈣蛋白I的檢測試紙，其特征在于，包括支撐薄片、樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸收墊、檢測線及質(zhì)控線，所述樣品墊、所述金標(biāo)墊、所述硝酸纖維素膜及所述吸收墊從所述支撐薄片的一端向另一端依次設(shè)置在所述支撐薄片上，所述樣品墊與所述金標(biāo)墊部分重疊，所述金標(biāo)墊與所述硝酸纖維素膜部分重疊，所述硝酸纖維素膜與所述吸收墊部分重疊，所述檢測線及所述質(zhì)控線設(shè)在所述硝酸纖維素膜上，且所述檢測線設(shè)在靠近所述金標(biāo)墊的一端，所述質(zhì)控線設(shè)在靠近所述吸收墊的一端，所述金標(biāo)墊上涂覆有所述單克隆單體包附膠體金顆粒形成膠體金標(biāo)記的單克隆抗體，所述檢測線為親和純化的抗心肌肌鈣蛋白I的兔多抗，所述質(zhì)控線為羊抗鼠IgG抗體。
7.一種檢測試 劑盒，包括如權(quán)利要求5或6所述的心肌肌鈣蛋白I的檢測試紙。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可快速簡便的應(yīng)用于hcTnI檢測的可分泌抗心肌肌鈣蛋白I單抗的雜交瘤細胞、其分泌的單克隆抗體及在檢測心肌肌鈣蛋白I領(lǐng)域的應(yīng)用。該雜交瘤細胞，保藏在湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心(即中國典型培養(yǎng)物保藏中心)，保藏號是CCTCC NoC201317。上述雜交瘤細胞的分泌產(chǎn)量高，其分泌得到的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體具有高親和力、高特異性等優(yōu)點，可廣泛應(yīng)用在制備心肌肌鈣蛋白I的檢測領(lǐng)域，如檢測試劑或檢測設(shè)備的制備領(lǐng)域等，在特異性、靈敏度和檢測率等方面較之傳統(tǒng)的檢測方法具有顯著的優(yōu)勢。
文檔編號G01N33/68GK103173420SQ20131011973
公開日2013年6月26日 申請日期2013年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月8日
發(fā)明者楊耿周, 朱碧銀, 林育佳, 劉莉莉 申請人:深圳市菲鵬生物股份有限公司