專利名稱：一種優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員eb病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員愛潑斯坦-巴爾病毒(epstein-barr virus, EB)轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡鑒定方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞永生化技術(shù)發(fā)展到今天已有了長足的進(jìn)步，EB病毒、猴空泡病毒40 (Simianvacuolating virus40, SV40)都是永生化細(xì)胞常用的轉(zhuǎn)化病毒。EB病毒轉(zhuǎn)化優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員外周血B淋巴細(xì)胞建立的永生細(xì)胞株讓原本有一定壽命的人體細(xì)胞能夠不間斷地繁殖下去，使一些特殊細(xì)胞的增殖能力加強(qiáng)，細(xì)胞凋亡率減小。優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員EB病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以永久的保存人類與杰出運(yùn)動(dòng)能力相關(guān)的基因資源，同時(shí)解決以往實(shí)驗(yàn)研究的接力式進(jìn)行與標(biāo)本的暫時(shí)性采集中存在的矛盾，以便有效的對(duì)同一研究對(duì)象進(jìn)行持久的連續(xù)性研究。EB病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡表現(xiàn)出與普通細(xì)胞凋亡相同的形態(tài)特征和生活化特征，但因其細(xì)胞凋亡率很小，許多檢測(cè)方法難以檢測(cè)或檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率很低。細(xì)胞凋亡鑒定主要是利用細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和生化特征來進(jìn)行的。通常是通過光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡對(duì)組織或細(xì)胞進(jìn)行各種染色來觀察凋亡現(xiàn)象，其次是采用原位末端標(biāo)記法(Terminal deoxynucIeotidyl trasnferase-mediated deoxyuridine triphosphatenick-end labelling assay, TUNEL)和DNA瓊脂糖凝膠電泳法來分析凋亡情況,但這些方法都存在檢測(cè)費(fèi)用昂貴、主觀性太強(qiáng)且不可定量檢測(cè)等弊端。近年來，隨著流式細(xì)胞分析術(shù)的不斷發(fā)展，應(yīng)用該項(xiàng)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡得到充分的應(yīng)用。異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate, FITC)與碘化丙唳(Propidium iodide, PI)復(fù)染法，即 Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法能夠定量分析細(xì)胞凋亡，磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)能與連接素V(Annexin V)發(fā)生特異性結(jié)合。PI為核酸熒光染料，不能透過正常細(xì)胞膜，只能進(jìn)入已經(jīng)破損的細(xì)胞膜。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，其細(xì)胞膜的磷脂對(duì)稱性改變而使PS暴露于細(xì)胞膜外(即PS外翻)，且凋亡細(xì)胞仍然保持其細(xì)胞膜的完整性，因而能與Annexin V (熒光素標(biāo)記的Annexin V,如FITC-Annexin V)結(jié)合,而不能結(jié)合核酸突光染料PI,仍保留細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的壞死細(xì)胞雖PS不發(fā)生翻轉(zhuǎn)，但由于其細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了改變，Annexin V仍能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞膜內(nèi)表面的PS結(jié)合，但同時(shí)也能被PI著色；晚期凋亡的細(xì)胞因PS外翻和膜通透性發(fā)生了改變，被Annexin V和PI標(biāo)記，也呈Annexin V+/PI+;正常細(xì)胞因胞膜完整且不發(fā)生PS翻轉(zhuǎn)現(xiàn)象,所以不能被Annexin V和PI標(biāo)記,表現(xiàn)為雙陰性。Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)法克服了單染檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確的缺點(diǎn)，并且可定量分析優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員EB病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡情況，可定量區(qū)分早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員EB病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡定量分析方法；提供一種優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員EB病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡鑒定方法步驟。


圖1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員EB病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡率Cl:壞死和機(jī)械性損傷細(xì)胞C2:早期凋亡細(xì)胞C3:活細(xì)胞C4:晚期凋亡細(xì)胞
具體實(shí)施例方式(I)制備單細(xì)胞懸液，收集EB病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞于流式管中，1200rpm，離心8min。(2)用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)洗漆細(xì)胞二次(1200rpm 離心 8min)收集(1-5) X IO5 細(xì)胞。(3)每個(gè)樣品加入100 μ I的連接緩沖液(Binding Buffer)懸浮細(xì)胞。(4)同時(shí)加入5μ1 FITC和5μ I PI雙染，混勻。(5)用已知可使EB病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡的藥物(如喜樹堿)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，作為陽性對(duì)照。檢測(cè)前分別用5μ I FITC和PI染色。(6)室溫，避光，反應(yīng) 5-10min。(7)首先在488nm共聚焦下觀察細(xì)胞的凋亡情況。(8)補(bǔ)充400μ1 Binding Buffe，400目篩網(wǎng)過篩，Ih內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)。(9)結(jié)果判斷:凋亡細(xì)胞對(duì)所有用于細(xì)胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細(xì)胞則不能。細(xì)胞膜有損傷的細(xì)胞的DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光，而細(xì)胞膜保持完好的細(xì)胞則不會(huì)有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細(xì)胞凋亡的早期PI不會(huì)著染而沒有紅色熒光信號(hào)。正常活細(xì)胞與此相似。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為(FITC-/P1-);右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為(FITC+/PI+);而右下象限為凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)(FITC+/P1-)。
權(quán)利要求
1.一種優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員EB病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡定量分析方法，其主要特征是采用 AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)并結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析檢測(cè)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員EB病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞的凋 亡。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員EB病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡鑒定方法。一種優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員EB病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡鑒定方法，其實(shí)施步驟見具體實(shí)施方式
部分。本發(fā)明為優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員EB病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡鑒定提供了新的研究手段，可定量分析優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員EB病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡情況，并且可定量區(qū)分早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，經(jīng)電鏡檢驗(yàn)及Tunel法檢驗(yàn)其效果和準(zhǔn)確性可靠。
文檔編號(hào)G01N15/14GK103196817SQ201310121689
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月10日
發(fā)明者陳偉光, 田小健, 馬喜強(qiáng), 王會(huì), 孫博, 關(guān)偉軍 申請(qǐng)人:哈爾濱體育學(xué)院