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      一種高靈敏、高線性的d-d二聚體檢測試劑盒及其使用方法

      文檔序號(hào):5868094閱讀:228來源:國知局
      專利名稱:一種高靈敏、高線性的d-d二聚體檢測試劑盒及其使用方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及生物樣本檢測領(lǐng)域,特別是涉及到一種利用平均直徑不同的兩種乳膠微粒來提高生物樣本檢測靈敏度和檢測范圍的試劑盒及其使用方法,具體地說是一種高靈敏、高線性的D-D 二聚體檢測試劑盒及其使用方法。
      背景技術(shù)
      D 二聚體(D-D dimer)來源于纖溶酶溶解的交聯(lián)纖維蛋白凝塊。是在血液凝固 纖溶系統(tǒng)中,由于凝固第十三因子的作用,安定的交聯(lián)纖維蛋白被纖溶酶分解的FDP的一種,纖維蛋白單體經(jīng)活化因子XIII交聯(lián)后,再經(jīng)纖溶酶水解所產(chǎn)生的一種特異性降解產(chǎn)物,是一個(gè)特異性的纖溶過程標(biāo)記物。血液中D 二聚體的增加證明體內(nèi)有血栓形成,啟動(dòng)纖溶系統(tǒng),在惡性腫瘤,產(chǎn)科疾患,血管病變,DIC (Disseminated Intravascular Coagulation Syndrome;彌散性血管內(nèi)凝血綜合癥)等疾病中顯示高值。纖維蛋白降解產(chǎn)物D-二聚體的水平升高,表明體內(nèi)存在著頻繁的纖維蛋白降解過程。因此,纖維D-二聚體是深靜脈血栓(DVT),肺栓塞(PE),彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)的關(guān)鍵指標(biāo)。該適應(yīng)癥所采用的診斷方法是D 二聚體測定。血清D 二聚體的測定目前檢測的方法是膠乳免疫比濁法,標(biāo)本中的D-D 二聚體與鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳增強(qiáng)顆粒發(fā)生抗原抗體反應(yīng),產(chǎn)生凝集以致濁度上升。通過對濁度,測定D二聚體濃度。其反應(yīng)過程如下:
      血清中D-D 二聚體+鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體一抗原抗體復(fù)合物。然而,現(xiàn)有的方法在檢測靈敏度上及線性上均不寬,在用于臨床檢測D-D 二聚體時(shí)常常受到高濃度樣本檢測線性不足亦或是低濃度樣本檢測靈敏度低的制約。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)現(xiàn)狀,而提供一種同時(shí)運(yùn)用平均直徑不同的兩種乳膠微粒對D-D 二聚體進(jìn)行檢測,并通過優(yōu)化大、小微粒的平均直徑和它們在反應(yīng)體系中的濃度,可以實(shí)現(xiàn)低濃度場合的高靈敏度檢測,也可以使高濃度場合下的檢測范圍得以拓寬,并提升低濃度場合的檢測準(zhǔn)確度從而得到準(zhǔn)確的臨床判定的高靈敏、高線性的D-D 二聚體檢測試劑盒及其使用方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:
      一種高靈敏、高線性的D-D 二聚體檢測試劑盒,其中:包括有試劑一、試劑二、D-D 二聚體標(biāo)準(zhǔn)品以及對照用D-D 二聚體異常血清,試劑一為三羥甲基氨基甲烷緩沖液,試劑二包括有濃度為0.01%(w/v)至0.04%(w/v)的大直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒與濃度為0.05 (w/v)至0.2%(w/v)的小直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆?;旌弦海≈睆绞罂谷薉-D 二聚體單 克隆抗體膠乳顆粒上的特異性抗體含量為大直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒上的特異性抗體含量的0.5%至10%。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:
      上述的大直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒直徑在0.15微米至0.29微米之間,小直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒直徑在0.05微米至0.10微米之間。上述的大直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒以及小直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒上的抗體的蛋白質(zhì)質(zhì)量高于兩種膠乳顆??偟鞍琢抠|(zhì)量的14%。上述的試劑二中含有的D-D 二聚體單克隆抗體為大直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒以及小直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒所能吸附的D-D 二聚體單克隆抗體最大量的85%至120%。上述的試劑二中含有的D-D 二聚體單克隆抗體為大直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒以及小直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒所能吸附的D-D 二聚體單克隆抗體最大量的95%至120%。上述的試劑一為30mmol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液。一種高靈敏、高線性的D-D 二聚體檢測試劑盒的使用方法,包括以下步驟:
      步驟一、在試劑一中加入D-D 二聚體試驗(yàn)品,置于37°C水浴5分鐘,然后加入試劑二,置
      于37°C水浴,使D-D 二聚體試驗(yàn)品中的D-D 二聚體與試劑二中的大直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒以及小直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒發(fā)生抗原抗體反應(yīng),加入試劑二 10秒后, 通過分光光度計(jì)在570nm處讀取吸光度AO,3分鐘后,再次通過分光光度計(jì)在570nm處讀取吸光度Al,得出Λ k職=Al-AO ;
      步驟二、通過已知的D-D 二聚體標(biāo)準(zhǔn)品吸光度ΛD-D 二聚體標(biāo)準(zhǔn)品濃度計(jì)算
      D-D 二聚體試驗(yàn)品濃度;公式為:D-D 二聚體試驗(yàn)品濃度=D-D 二聚體標(biāo)準(zhǔn)品濃度X Δ A試驗(yàn)
      品/ △ A標(biāo)準(zhǔn)。上述的D-D 二聚體試驗(yàn)品濃度在Omg/L至20.8mg/L。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明試劑二包括有濃度為0.01%(w/v)至0.04%(w/v)的大直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒與濃度為0.05(w/v)至0.2%(w/v)的小直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆?;旌弦?,小直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒上的特異性抗體含量為大直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒上的特異性抗體含量的0.5%至10%。這兩種乳膠微粒均屬致敏乳膠微粒。運(yùn)用平均直徑不同的兩種乳膠微粒的可以提高低濃度場合的檢測靈敏度和拓寬高濃度場合的檢測范圍;平均直徑大的乳膠微粒(大直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒)偶連一定數(shù)量的抗體后進(jìn)行免疫反應(yīng),可以達(dá)到或者接近免疫反應(yīng)的最大速率,而平均直徑小的乳膠微粒(小直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒)偶連少于某個(gè)量的抗體后進(jìn)行免疫反應(yīng),可以降低反應(yīng)速率;通過優(yōu)化大、小微粒的平均直徑和它們在反應(yīng)體系中的濃度,可以實(shí)現(xiàn)低濃度場合的高靈敏度檢測,也可以使高濃度場合下的檢測范圍得以拓寬,并提升低濃度場合的檢測準(zhǔn)確度從而得到準(zhǔn)確的臨床判定。檢測D-D 二聚體濃度的方法是通過標(biāo)本中的D-D 二聚體與鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳增強(qiáng)顆粒發(fā)生抗原抗體反應(yīng),產(chǎn)生凝集以致濁度上升。在570nm處通過分光光度計(jì)測定濁度的變化率,再與標(biāo)準(zhǔn)品對比求出D-D 二聚體的濃度。D-D 二聚體檢測試劑采用先進(jìn)的納米技術(shù)制作的乳膠顆粒非特異性地吸附樣品中的鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體,使其固相化,易于分散。在D-D 二聚體單克隆抗體乳膠顆粒的制備上,將以兩種不同親和力的抗體分別標(biāo)記不同大小的微球,以高親和力抗體標(biāo)記大微球,其檢測范圍窄但靈敏度高,適合對低濃度樣本進(jìn)行檢測,而以低親和力抗體標(biāo)記小微球,適合定量檢測高濃度標(biāo)本。如此即克服了血清學(xué)中的鉤狀效應(yīng),同時(shí)也提高了試劑檢測的靈敏度,這是其它檢測方法學(xué)所不能具備的。用大微球包被的高親和力的抗體容易和低濃度的抗原發(fā)生抗原抗體反應(yīng),小微球包被的低親和力的抗體容易和樣本中的高濃度抗原發(fā)生反應(yīng)??梢哉f該試劑可同時(shí)兼顧高低濃度的樣本測定。
      具體實(shí)施例方式以下對本發(fā)明的實(shí)施例作進(jìn)一步詳細(xì)描述。本發(fā)明的一種高靈敏、高線性的D-D 二聚體檢測試劑盒,其中:包括有試劑一、試劑二、D-D 二聚體標(biāo)準(zhǔn)品以及對照用D-D 二聚體異常血清,試劑一為30mmol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液。試劑二包括有濃度為0.01%(w/v)至0.04%(w/v)的大直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒與濃度為0.05 (w/v)至0.2% (w/v)的小直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆?;旌弦?,小直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒上的特異性抗體含量為大直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒上的特異性抗體含量的0.5%至10%。大直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒直徑在0.15微米至0.29微米之間,小直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒直徑在0.05微米至0.10微米之間。大直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒以及小直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒上的抗體的蛋白質(zhì)質(zhì)量高于兩種膠乳顆??偟鞍琢抠|(zhì)量的14%。試劑二中含有的D-D 二聚體單克隆抗體為大直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒以及小直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒所能吸附的D-D 二聚體單克隆抗體最大量的95%至120%。一種高靈敏、高線性 的D-D 二聚體檢測試劑盒的使用方法,包括以下步驟:
      步驟一、在試劑一中加入D-D 二聚體試驗(yàn)品,置于37°C水浴5分鐘,然后加入試劑II,
      置于37°C水浴,使D-D 二聚體試驗(yàn)品中的D-D 二聚體與試劑二中的大直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒以及小直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒發(fā)生抗原抗體反應(yīng),加入試劑二 10秒后,通過分光光度計(jì)在570nm處讀取吸光度A0,3分鐘后,再次通過分光光度計(jì)在570nm處讀取吸光度Al,得出Λ A, P =Al-AO ;
      步驟二、通過已知的D-D 二聚體標(biāo)準(zhǔn)品吸光度ΛD-D 二聚體標(biāo)準(zhǔn)品濃度計(jì)算
      D-D 二聚體試驗(yàn)品濃度;公式為:D-D 二聚體試驗(yàn)品濃度=D-D 二聚體標(biāo)準(zhǔn)品濃度X Δ A試驗(yàn)
      品/ △ A標(biāo)準(zhǔn)。上述的D-D 二聚體試驗(yàn)品濃度在Omg/L至20.8mg/L。由于減少乳膠顆粒上的抗體含量可以減緩免疫反應(yīng)的速率,因此可通過計(jì)算反應(yīng)時(shí)間,選擇最適的抗體含量。在高濃度的檢測場合,使用標(biāo)準(zhǔn)曲線可以使測量范圍向檢測限的上限方向延伸。另外,偶連在微粒上的特異性抗體的量,可以通過使用緩沖液對含有異性抗體或者抗原親和性片段的溶液進(jìn)行稀釋而自由調(diào)節(jié)。此外,應(yīng)根據(jù)待檢抗原的類型,以及檢測目的、檢測范圍、抗體滴度等,在上述界定限以內(nèi)可適度選擇更佳合適偶連劑量。另一方面,吸附在乳膠微粒上的抗體越多,反應(yīng)速率越快;乳膠微粒直徑越大,反應(yīng)速率也越快。偶連在大微粒上的特異性抗體越多,則在低濃度場合的檢測靈敏度越高。因此,偶連在大微粒上的特異性抗體需要盡可能的多。所以,在100%吸附等溫線中,最好能到最大吸附量的85% 120%,能達(dá)到959^120%更好。根據(jù)表面化學(xué)上等溫吸附線的概念,在100%吸附等溫線的抗體最大吸附量很容易確定下來。本發(fā)明中,免疫測定法和相應(yīng)的試劑均已經(jīng)建立。使用本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)低濃度場合的高靈敏度檢測,也可以使高濃度場合下的檢測范圍得以拓寬,并提升低濃度場合的檢測準(zhǔn)確度從而得到準(zhǔn)確的臨床判定。D-D 二聚體檢測試劑盒 型號(hào):生化試劑
      產(chǎn)品編號(hào):9010-717 規(guī)格:
      每個(gè)D-D 二聚體檢測試劑盒(400測試)含有:
      1、試劑I一瓶60ml
      2、試劑2—瓶20ml
      3、D-D二聚體標(biāo)準(zhǔn)品一瓶Iml
      4、D-D二聚體標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液一瓶Iml
      5、一份使用說明書 試劑配置:
      本試劑盒為液體雙試劑,可直接上機(jī)使用`。如果受限于分析儀比色杯容積限制,可以依比例調(diào)整試劑R1、樣本/標(biāo)準(zhǔn)品及試劑R2使用量。試劑的穩(wěn)定與貯存期
      試劑及標(biāo)準(zhǔn)品避光保存2 8°C—年,嚴(yán)禁冷凍。樣本處理:
      1)空腹采血并盡快分離血清;
      2)血清標(biāo)本2 8°C保存穩(wěn)定一周,_20°C冷凍保存可穩(wěn)定3個(gè)月。試驗(yàn)參數(shù)與操作步驟:
      溫度37 °C
      測試方法終點(diǎn)法
      啟動(dòng)反應(yīng) 14微升樣本/標(biāo)準(zhǔn)品+150微升試劑Rl (或依比例混勻)
      孵育時(shí)間5min
      終止反應(yīng)加50微升試劑R2 (或依比例混勻)
      延遲時(shí)間IOmin
      測試儀日立7100
      檢測介質(zhì):血清或血漿 適用于體外診斷 用途
      D-D 二聚體檢測試劑盒用于測定血清或血漿標(biāo)本中的D-D 二聚體含量,從而用來判斷有無血栓形成,同時(shí)在惡性腫瘤,產(chǎn)科疾患,血管病變,DIC(Disseminated IntravascularCoagulation Syndrome;彌散性血管內(nèi)凝血綜合癥)等疾病中顯示高值。因此,纖維D-二聚體是深靜脈血栓(DVT),肺栓塞(PE),彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)的關(guān)鍵指標(biāo)。反應(yīng)過程:在0.150ml試劑I (30mmol/L三羥甲基氨基甲烷緩沖液)中加入14微升的D-D 二聚體,置于37°C水浴5min,加入0.050ml試劑II (鼠抗人D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒),37°C水浴IOS后,讀取吸光度AO,3分鐘后,讀取吸光度Al,Λ Ams =Al-AO。2)計(jì)算及結(jié)果:
      計(jì)算公式:D-D 二聚體濃度(mg/L) =D-D 二聚體試驗(yàn)品濃度=D-D 二聚體標(biāo)準(zhǔn)品濃
      度X Λ A試驗(yàn)品/ Λ A標(biāo)準(zhǔn)
      結(jié)果:D-D 二聚體線性范圍0.5mg/L至20mg/L。注意事項(xiàng)
      1.試劑和樣品用量可因儀器不同,按比例增減。2.測試中D-D 二聚體正?;蛏哐鍖φ諔?yīng)作為陰性或陽性參照。3.若樣品D-D 二聚體濃度大于20mg/L,須用生理鹽水稀釋樣品,結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。4.如保存不當(dāng),試劑發(fā)現(xiàn)有渾濁時(shí),應(yīng)棄用。5.溶血對測定有干擾,操作過程中要盡量避免溶血。關(guān)于本專利申請的名稱解釋,其實(shí)高靈敏度及高線性概念在IVD (體外診斷試劑)來說,是試劑指標(biāo)的專業(yè)術(shù)語,靈敏度指的是生化診斷試劑在低值上檢測的一種能力,線性則指的是生化診斷試劑 在高值上檢測的一種能力。如現(xiàn)有技術(shù)公開的D-D 二聚體檢測范圍為200-1200ug/L,而本專 利申請的檢測范圍為0-20000ug/L,在低值上相比低,高值上相比高,就說本專利申請靈敏度及線性高,優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)公開的指標(biāo)。
      權(quán)利要求
      1.一種高靈敏、高線性的D-D 二聚體檢測試劑盒,其特征是:包括有試劑一、試劑二、D-D 二聚體標(biāo)準(zhǔn)品以及對照用D-D 二聚體異常血清,所述的試劑一為三羥甲基氨基甲烷緩沖液,所述的試劑二包括有濃度為0.01%(w/v)至0.04%(w/v)的大直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒與濃度為0.05 (w/v)至0.2%(w/v)的小直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆?;旌弦?,所述的小直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒上的特異性抗體含量為大直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒上的特異性抗體含量的0.5%至10%。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高靈敏、高線性的D-D二聚體檢測試劑盒,其特征是:所述的大直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒直徑在0.15微米至0.29微米之間,所述的小直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒直徑在0.05微米至0.10微米之間。
      3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高靈敏、高線性的D-D二聚體檢測試劑盒,其特征是:所述的大直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒以及小直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒上的抗體的蛋白質(zhì)質(zhì)量高于兩種膠乳顆??偟鞍琢抠|(zhì)量的14%。
      4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種高靈敏、高線性的D-D二聚體檢測試劑盒,其特征是:所述的試劑二中含有的D-D 二聚體單克隆抗體為所述的大直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒以及小直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒所能吸附的D-D 二聚體單克隆抗體最大量的85%至120%。
      5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種高靈敏、高線性的D-D二聚體檢測試劑盒,其特征是:所述的試劑二中含有的D-D 二聚體單克隆抗體為所述的大直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒以及小直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒所能吸附的D-D 二聚體單克隆抗體最大量的95%至120%。
      6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種高靈敏、高線性的D-D二聚體檢測試劑盒,其特征是:所述的試劑一為30mmol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液?!?br> 7.—種如權(quán)利要求1所述的高靈敏、高線性的D-D二聚體檢測試劑盒的使用方法,其特征是:包括以下步驟: 步驟一、在試劑一中加入D-D 二聚體試驗(yàn)品,置于37°C水浴5分鐘,然后加入試劑二,置于37°C水浴,使D-D 二聚體試驗(yàn)品中的D-D 二聚體與試劑二中的大直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒以及小直徑鼠抗人D-D 二聚體單克隆抗體膠乳顆粒發(fā)生抗原抗體反應(yīng),加入試劑二 10秒后,通過分光光度計(jì)在570nm處讀取吸光度AO,3分鐘后,再次通過分光光度計(jì)在570nm處讀取吸光度Al,得出Λ A, P =Al-AO ; 步驟二、通過已知的D-D 二聚體標(biāo)準(zhǔn)品吸光度ΛD-D 二聚體標(biāo)準(zhǔn)品濃度計(jì)算D-D 二聚體試驗(yàn)品濃度;公式為:D-D 二聚體試驗(yàn)品濃度=D-D 二聚體標(biāo)準(zhǔn)品濃度X Δ A試驗(yàn)品/ △ A標(biāo)準(zhǔn)。
      8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種高靈敏、高線性的D-D二聚體檢測試劑盒的使用方法,其特征是:所述的D-D 二聚體試驗(yàn)品濃度在Omg/L至20.8mg/L。
      全文摘要
      本發(fā)明公開了一種高靈敏、高線性的D-D二聚體檢測試劑盒,試劑一為30mmol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液。試劑二包括有濃度為0.01%(w/v)至0.04%(w/v)的大直徑鼠抗人D-D二聚體單克隆抗體膠乳顆粒與濃度為0.05(w/v)至0.2%(w/v)的小直徑鼠抗人D-D二聚體單克隆抗體膠乳顆?;旌弦海≈睆绞罂谷薉-D二聚體單克隆抗體膠乳顆粒上的特異性抗體含量為大直徑鼠抗人D-D二聚體單克隆抗體膠乳顆粒上的特異性抗體含量的0.5%至10%。通過優(yōu)化大、小微粒的平均直徑和它們在反應(yīng)體系中的濃度,可以實(shí)現(xiàn)D-D二聚體低濃度場合的高靈敏度檢測,也可以使高濃度場合下的檢測范圍得以拓寬。
      文檔編號(hào)G01N33/577GK103235130SQ20131013507
      公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月18日
      發(fā)明者張聞 申請人:寧波瑞源生物科技有限公司
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