專利名稱：用于鑒別乳腺肌上皮病變的多重染色試劑及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫組化試劑，尤其是一種用于鑒別乳腺肌上皮病變的多重染色試劑及其檢測方法。
背景技術(shù)：
乳腺組織常含有多種抗原成分，表達于不同種類細胞的細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核不同部位。乳腺疾病病理診斷要顯示肌上皮、腺上皮組織的不同抗原，往往需要用多種抗體分別在多張切片上染色標記，若肌上皮連續(xù)存在則無浸潤癌，若肌上皮陰性反應(yīng)則為乳腺浸潤癌(盲管腺病除外)。單種抗體顯示，導(dǎo)管原位癌肌上皮細胞胞呈跳躍性陽性，肌上皮不連續(xù)。若在一張切片上同時顯示多種組織抗原，往往需要在一張切片上采用多次標記反復(fù)標記，5種抗體就要5次染色，方法煩瑣，染色時間長，且在一張切片上反復(fù)操作容易引起組織脫落，從方法學(xué)角度也費時費力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)時針對以上現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種用于鑒別乳腺肌上皮病變的多重染色試劑及其檢測方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一種用于鑒別乳腺肌上皮病變的多重染色試劑及其檢測方法，該試劑由以下重量份的抗體組成:鼠抗人CK8/18免疫組化單克隆抗體20%、即用型鈣調(diào)節(jié)蛋白鼠抗人單克隆抗體20%、即用型細胞角蛋白鼠抗人單克隆抗體20%、即用型P63蛋白鼠抗人單克隆抗體20%、肌動蛋白HHF-35鼠抗人單克隆抗體20%,其制作方法是分別等量吸取上述各組分抗體，然后進行混合，在旋渦混合器上旋轉(zhuǎn)混勻或者吸管吹打混勻即可，并置4°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｓ糜阼b別乳腺肌上皮病變的檢測方法，包括以下步驟:
步驟一、把采集的乳腺肌上皮組織經(jīng)過脫水、透明及浸蠟后，進行石蠟包埋后，進行切片，厚度為3-5um，對疑有病變的組織選作免疫標記，在溫度為58°C _60°C下，放到恒溫箱內(nèi)烤切片2-3小時，切片上的石蠟經(jīng)過脫蠟、水化后，用TBS液沖洗切片3次，每次3分鐘；步驟二、將切片經(jīng)內(nèi)源性過氧化物酶阻斷，用濃度為3%的新鮮配制的過氧化氫孵育切片5分鐘，然后用蒸餾水沖洗切片2次，每次3分鐘；
步驟三、用EDTA修復(fù)液對切片進行抗原修復(fù)；
步驟四、向切片加非免疫動物血清，室溫下孵育切片10分鐘；
步驟五、除去切片上的非免疫動物血清，向切片加多重染色試劑，在17°C—33°C溫度下孵育切片30-60分鐘；
步驟六、加使MACH 2 Double Stain酶標二抗試劑，室溫孵育切片30分鐘，用TBS液沖洗切片3次，每次3分鐘，再用蒸餾水沖洗2次，每次3分鐘；
步驟七、除去切片上的蒸餾水后，加AP-red顯色劑室溫孵育切片10-20分鐘，用蒸餾水沖洗2次，每次3分鐘，在顯微鏡下觀察，掌握染色時間，陽性信號為紅色，觀察完成后，用TBS液沖洗切片3次，每次3分鐘，再用蒸餾水沖洗2次，每次3分鐘，然后采用pH值為2.0，濃度為0.05% HCl室溫孵育切片30分鐘，用TBS液沖洗切片2次，每次3分鐘；
步驟八、加DAB顯色劑室溫孵育切片5分鐘后，用蒸餾水沖洗切片2次，每次3分鐘，在顯微鏡下觀察，掌握染色時間，陽性信號為黃色或者棕黃色，觀察完畢后，用蒸餾水沖洗切片3次，每次3分鐘；
步驟九、除去切片上的蒸餾水，加蘇木精淺染30-60秒后，用蒸餾水沖洗2次，每次3分
鐘；
步驟十、除去切片上的蒸餾水，在切片未干時，直接滴加水性封片劑封片，60°C烘干15-30分鐘，水性封片劑干燥后，待自然冷卻，再用中性樹膠封片即可。在上述步驟一中所述石蠟的熔點小于60°C。在上述步驟三中所述EDTA修復(fù)液為在100°C溫度下煮沸20分鐘，其pH為8.0。在上述步驟七中所述AP-red顯色劑為現(xiàn)用現(xiàn)配。本發(fā)明多重染色試劑在標記乳腺肌上皮細胞時，具有較強的特異性和敏感性。可以分別對同一靶細胞內(nèi)不同的靶抗原進行識別，使細胞核、細胞膜和細胞質(zhì)同步著色，明顯增加了肌上皮細胞的反應(yīng)性和敏感性，更能客觀地顯示出乳腺腺泡和導(dǎo)管的基本結(jié)構(gòu)，對乳腺病變的診斷起到很好的輔助作用。通過實驗觀察，我們發(fā)現(xiàn)本發(fā)明多重染色試劑用于免疫組織化學(xué)標記具有抗體優(yōu)勢互補的效應(yīng)，兩種抗體能分別與相同細胞的不同靶抗原起反應(yīng)，共同識別靶細胞，提示該技術(shù)有協(xié)同檢測腫瘤組織來源的潛力，尤其有助于腫瘤病理診斷。該方法目前只適用于抗原不在相同位置的雙標記，尚不適用于兩抗原可能在同一定位的檢測。本發(fā)明產(chǎn)生技術(shù)效果如下:
1、能同步標記不同組織的兩種靶細胞，又能標記相同靶細胞中不同的靶抗原；
2、避免了單標記間斷性、跳躍性，該標記法使得肌上皮連續(xù)標記，易于檢出和確認小灶性微浸潤癌，提高了診斷的可重復(fù)率和準確率；
3、尤其是在穿刺活檢小標本中，一次單張切片多種染色，可以減少相當(dāng)一部分漏診或因診斷結(jié)果不確定而導(dǎo)致患者不必要的重復(fù)穿刺活檢；
4、克服了單標記試劑染色的不連續(xù)性和跳躍性，使得單標記時肌上皮細胞貌似缺如或結(jié)構(gòu)斷裂區(qū)域顯示為肌上皮結(jié)構(gòu)連續(xù)，其反應(yīng)強度也明顯較僅單標記顯著，區(qū)別于乳腺浸潤性導(dǎo)管癌無陽性反應(yīng)，使得肌上皮與腺上皮分布一目了然。5、單張切片，同時著不同顏色，提高了色彩對比的清晰度；
6、新的封片方法不同于以往的濕封法，可長久保色，不褪色；
7、簡便、經(jīng)濟、實用，既適用于課題研究實驗，又適用于臨床病理診斷，在聯(lián)合尋找腫瘤組織來源上具有很大的潛力。
具體實施例方式一種用于鑒別乳腺肌上皮病變的多重染色免疫組化試劑，該免疫組化試劑由以下重量份的抗體組成:鼠抗人CK8/18免疫組化單克隆抗體20%、即用型鈣調(diào)節(jié)蛋白鼠抗人單克隆抗體20%、即用型細胞角蛋白鼠抗人單克隆抗體20%、即用型P63蛋白鼠抗人單克隆抗體20%、肌動蛋白HHF-35鼠抗人單克隆抗體20%，其制作方法是分別等量吸取上述各組分抗體，然后進行混合，在旋渦混合器上旋轉(zhuǎn)混勻或者吸管吹打混勻即可，并置4°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｔ谶M行多重染色之前首先分別做單獨染色的預(yù)實驗，其實驗條件與多重染色時的條件相同。該發(fā)明多重染色試劑免疫組織化學(xué)染色采用以聚合物鏈接的辣根過氧化物酶HPR檢測系統(tǒng)，具體方法為:
步驟一、把采集的乳腺肌上皮組織經(jīng)過脫水、透明及浸蠟后，進行低熔點的石蠟(熔點〈60° C)包埋后，進行切片，厚度為3-5um，對疑有病變的組織選作免疫標記，在溫度為580C _60°C下，放到恒溫箱內(nèi)烤切片2-3小時，切片上的石蠟經(jīng)過脫蠟、水化后，用TBS液沖洗切片3次，每次3分鐘；
步驟二、將切片經(jīng)內(nèi)源性過氧化物酶阻斷，用濃度為3%的新鮮配制的過氧化氫孵育切片5分鐘，然后用蒸餾水沖洗切片2次，每次3分鐘；
步驟三、用EDTA修復(fù)液對切片進行抗原修復(fù)，其EDTA修復(fù)液為在100°C溫度下煮沸20分鐘，其pH為8.0 ;
步驟四、向切片加非免疫動物血清，室溫下孵育切片10分鐘；
步驟五、除去切片上的非免疫動物血清，向切片加多重染色試劑，在17°C—33°C溫度下孵育切片30-60分鐘或者放在4°C冰箱內(nèi)孵育過夜，在潮濕密封閉的環(huán)境中進行，目的是避免多重染色試劑中抗體水分蒸發(fā)造成抗體的濃縮或干燥；
步驟六、加使MACH 2 Double Stain酶標二抗試劑，其MACH 2 Double Stain選用美國Biocare Medical公司生產(chǎn)的，室溫孵育切片30分鐘，用TBS液沖洗切片3次，每次3分鐘，再用蒸餾水沖洗2次，每次3分鐘；
步驟七、除去切片上的蒸餾水后，加AP-red顯色劑室溫孵育切片10-20分鐘，用蒸餾水沖洗2次，每次3分鐘，在顯微鏡下觀察，根據(jù)紅色的發(fā)展掌握染色時間，陽性信號為紅色，觀察完成后，用TBS液沖洗切片3次，每次3分鐘，再用蒸餾水沖洗2次，每次3分鐘，然后采用PH值為2.0，濃度為0.05% HCl室溫孵育切片30分鐘，目的是洗脫滅活多重染色試劑中的所有抗體的活性，避免雙重染色中引起的交叉反應(yīng)，用TBS液沖洗切片2次，每次3分鐘；
步驟八、加DAB顯色劑室溫孵育切片5分鐘后，用蒸餾水沖洗切片2次，每次3分鐘，在顯微鏡下觀察，根據(jù)顏色的發(fā)展掌握染色時間，陽性信號為黃色或者棕黃色，觀察完畢后，用蒸餾水沖洗切片3次，每次3分鐘；
步驟九、除去切片上的蒸餾水，加蘇木精淺染30-60秒后，用蒸餾水沖洗2次，每次3分
鐘；
步驟十、除去切片上的蒸餾水，在切片未干時，直接滴加水性封片劑封片，60°C烘干15-30分鐘，水性封片劑干燥后，待自然冷卻，再用中性樹膠封片即可。
權(quán)利要求
1.用于鑒別乳腺肌上皮病變的多重染色試劑，其特征在于該多重染色試劑由以下重量份的抗體組成:鼠抗人CK8/18免疫組化單克隆抗體20%、即用型鈣調(diào)節(jié)蛋白鼠抗人單克隆抗體20%、即用型細胞角蛋白鼠抗人單克隆抗體20%、即用型P63蛋白鼠抗人單克隆抗體20%、肌動蛋白HHF-35鼠抗人單克隆抗體20%，其制作方法是分別等量吸取上述各組分抗體，然后進行混合，在旋渦混合器上旋轉(zhuǎn)混勻或者吸管吹打混勻即可，并置4°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?br> 2.用于鑒別乳腺肌上皮病變的檢測方法，其特征在于包括以下步驟:步驟一、把采集的乳腺肌上皮組織經(jīng)過脫水、透明及浸蠟后，進行石蠟包埋后，進行切片，厚度為3-5um，對疑有病變的組織選作免疫標記，在溫度為58°C -60°C下，放到恒溫箱內(nèi)烤切片2-3小時，切片上的石蠟經(jīng)過脫蠟、水化后，用TBS液沖洗切片3次，每次3分鐘；步驟二、將切片經(jīng)內(nèi)源性過氧化物酶阻斷，用濃度為3%的新鮮配制的過氧化氫孵育切片5分鐘，然后用蒸餾水沖洗切片2次，每次3分鐘；步驟三、用EDTA修復(fù)液對切片進行抗原修復(fù)；步驟四、向切片加非免疫動物血清，室溫下孵育切片10分鐘；步驟五、除去切片上的非免疫動物血清，向切片加多重染色試劑，在17°C—33°C溫度下孵育切片30-60分鐘；步驟六、加使MACH 2 DoubleStain酶標二抗試劑，室溫孵育切片30分鐘，用TBS液沖洗切片3次，每次3分鐘，再用蒸餾水沖洗2次，每次3分鐘；步驟七、除去切片上的蒸餾水后，加AP-red顯色劑室溫孵育切片10-20分鐘，用蒸餾水沖洗2次，每次3分鐘，在顯微鏡下觀察，掌握染色時間，陽性信號為紅色，觀察完成后，用TBS液沖洗切片3次，每次3分鐘，再用蒸餾水沖洗2次，每次3分鐘，然后采用PH值為2.0，濃度為0.05% HCl室溫孵育切片30分鐘，用TBS液沖洗切片2次，每次3分鐘；步驟八、加DAB顯色劑室溫孵育切片5分鐘后，用蒸餾水沖洗切片2次，每次3分鐘，在顯微鏡下觀察，掌握染色時間，陽性信號為黃色或者棕黃色，觀察完畢后，用蒸餾水沖洗切片3次，每次3分鐘；步驟九、除去切片上的蒸餾水，加蘇木精淺染30-60秒后，用蒸餾水沖洗2次，每次3分鐘；步驟十、除去切片上的蒸餾水，在切片未干時，直接滴加水性封片劑封片，60°C烘干15-30分鐘，水性封片劑干燥后，待自然冷卻，再用中性樹膠封片即可。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于鑒別乳腺肌上皮病變的檢測方法，其特征在于在步驟一中所述石臘的熔點小于60°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于鑒別乳腺肌上皮病變的檢測方法，其特征在于在步驟三中所述EDTA修復(fù)液為在100°C溫度下煮沸20分鐘，其pH為8.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于鑒別乳腺肌上皮病變的檢測方法，其特征在于在步驟七中所述AP-red顯色劑為現(xiàn)用現(xiàn)配。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于鑒別乳腺肌上皮病變的多重染色試劑及其檢測方法，本發(fā)明試劑由鼠抗人CK8/18免疫組化單克隆抗體20%、即用型鈣調(diào)節(jié)蛋白鼠抗人單克隆抗體20%、即用型細胞角蛋白鼠抗人單克隆抗體20%、即用型P63蛋白鼠抗人單克隆抗體20%、肌動蛋白HHF-35鼠抗人單克隆抗體20%組成，在標記乳腺肌上皮細胞時，具有較強的特異性和敏感性，可以分別對同一靶細胞內(nèi)不同的靶抗原進行識別，使細胞核、細胞膜和細胞質(zhì)同步著色，明顯增加了肌上皮細胞的反應(yīng)性和敏感性，更能客觀地顯示出乳腺腺泡和導(dǎo)管的基本結(jié)構(gòu)，對乳腺病變的診斷起到很好的輔助作用。
文檔編號G01N1/30GK103196731SQ201310135248
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月18日
發(fā)明者王剛平 申請人:王剛平