專利名稱：用于減少細(xì)胞脂肪和預(yù)測用酪氨酸激酶抑制劑治療后的心臟毒性的組合物和方法
用于減少細(xì)胞脂肪和預(yù)測用酪氨酸激酶抑制劑治療后的心臟毒性的組合物和方法本申請是申請日為2007年2月27日、申請?zhí)枮?00780013697.4的同名申請的分案申請。背景心臟具有強(qiáng)大的ATP生成能力，使其在生物的一生中行使高效泵的功能。成年人的心肌利用脂肪酸(FA)和/或葡萄糖氧化作為其主要能量來源。正常情況下，成年人的心臟通過線粒體中脂肪酸的氧化獲得其絕大多數(shù)的能量。心肌細(xì)胞具有在碳水化合物糖酵解和Krebs循環(huán)(三羧酸循環(huán))之間轉(zhuǎn)換并轉(zhuǎn)換至脂肪養(yǎng)料源的能力，從而在不同的生理學(xué)和飲食條件下維持ATP以恒定速率生成。該代謝和養(yǎng)料選擇的靈活性對于正常的心功能至關(guān)重要。盡管心臟能量轉(zhuǎn)化容量和代謝通量在多個層面上受到調(diào)節(jié)，一 個重要的調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)生在基因表達(dá)的層面上。參與多重能量轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因的表達(dá)響應(yīng)于發(fā)育、生理學(xué)和病理生理學(xué)的信號而受到動態(tài)調(diào)節(jié)。參與這些關(guān)鍵能量代謝途徑的基因由核受體超家族成員特別是脂肪酸活化的過氧化物酶體增殖因子活化受體(PPAR)和核受體輔激活因子一 PPARy輔激活因子-1 a (PGC-1 α )以及雌激素受體相關(guān)蛋白ERRα，、ERR^和ERRy和它們的激活因子PGR-1和PERC在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行調(diào)節(jié)。根據(jù)生理學(xué)和病理生理學(xué)狀態(tài)心臟PPAR/PGC-1復(fù)合物的動態(tài)調(diào)節(jié)將在下面進(jìn)行更為詳盡的說明。PGC-1 α為PPAR Y輔激活因子，與在棕色脂肪中適應(yīng)性生熱有關(guān)。兩個結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白PGC-1 β和PARC已經(jīng)得到克隆并且表現(xiàn)出參與調(diào)節(jié)能量代謝途徑。PGC-1 α的組織特異性且誘導(dǎo)型表達(dá)提示其參與細(xì)胞能量生成代謝過程(包括線粒體的生物發(fā)生和氧化、肝糖原異生以及骨骼肌葡萄糖攝取)的動態(tài)調(diào)節(jié)。PGC-1 α在強(qiáng)氧化作用的組織(例如心臟、骨骼肌、棕色脂肪和肝臟)中選擇性地表達(dá)。心臟中PGC-1a的表達(dá)在出生時急劇增加。這與從葡萄糖代謝到脂肪氧化的圍產(chǎn)期轉(zhuǎn)換相吻合。還已經(jīng)知道PGC-1 α的活性和表達(dá)水平受冷暴露、禁食以及鍛煉(已知促進(jìn)氧化代謝的刺激)的誘導(dǎo)。培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中PGC-1的被迫表達(dá)誘導(dǎo)參與多重線粒體能量轉(zhuǎn)換/能量產(chǎn)生途徑的核與線粒體基因的表達(dá)，增加細(xì)胞線粒體數(shù)量并且刺激偶聯(lián)的呼吸作用。與這些刺激相關(guān)的信號傳導(dǎo)途徑(包括P38MAP激酶、β -腎上腺素能/cAMP、一氧化氮、AMP激酶和Ca2-鈣調(diào)蛋白激酶)通過增加PGC-1 α表達(dá)或通過其反式激活功能激活PGC-1 α和其下游靶基因。這些代謝和結(jié)構(gòu)的改變可導(dǎo)致擴(kuò)張性心肌病和心臟的舒張功能障礙。有趣的是，線粒體增殖是可逆的并且心肌病可以通過轉(zhuǎn)基因表達(dá)的減少得到補(bǔ)救。這表明除了通過PPAR作用為細(xì)胞脂肪酸代謝的激活因子，PGC-1 α與線粒體生物發(fā)生相關(guān)。因此，PGC-1 α表現(xiàn)出作用為氧化能量代謝的主要調(diào)節(jié)因子并響應(yīng)細(xì)胞能量狀況的變化。新出現(xiàn)證據(jù)表明孤兒核受體的雌激素相關(guān)受體(ERR)家族作用為心臟和骨骼肌能量代謝的PGC-1-活化調(diào)節(jié)因子。ERR家族有三個成員:ERRa、ERR0、和ERRy。在主要依賴于線粒體氧化代謝以生成ATP的成年組織(例如心臟和慢收縮骨骼肌)中ERR a和ERR Y的表達(dá)升高。出生后在心臟中ERRa的表達(dá)急劇增加，伴隨參與細(xì)胞脂肪酸攝入和線粒體氧化的酶的全面上調(diào)。近來已將ERRa和ERR Y確定為輔激活因子PGC-1家族的新配偶體。這種在ERR同種型和PGC-1 a之間功能上的關(guān)聯(lián)激發(fā)了對ERR在能量代謝中作用的興趣。ERRa基因的缺失揭示了 ERRa在脂質(zhì)代謝的組成型調(diào)節(jié)中的組織特異性作用。在ERRai小鼠中白色脂肪質(zhì)量的減少與脂肪細(xì)胞大小和脂質(zhì)合成速率的減少一致。相反地，ERR a很可能在心臟中的脂質(zhì)分解代謝中起作用，與其和PGC-1 a的功能相互作用相一致。不表現(xiàn)出明顯的心臟表型的ERR α-/-小鼠顯示出心臟PGC-1 a和ERR Y表達(dá)的代償性增加。這些結(jié)果表明ERR同種型促成心臟中脂肪酸代謝基因的組成型表達(dá)。然而基因表達(dá)改變引起的代謝上的影響尚未為人所知。正使用過量表達(dá)ERRa的心肌細(xì)胞中的基因表達(dá)分析鑒定心臟ERR a靶基因。ERRa激活了參與能量生成途徑包括細(xì)胞脂肪酸攝取(LPL、⑶36/FAT、H-FABP、FACS-1)、β -氧化(MCAD、VLCAD, LCHAD)以及線粒體電子傳遞/氧化磷酸化(細(xì)胞色素C、C0XIV、C0XVII1、NADH泛醌脫氫酶、黃素蛋白-泛醌氧化還原酶、ATP合酶β)的基因。ERRa也增加心肌細(xì)胞中棕櫚酸的氧化速率。ERRa對β-氧化酶基因的活化涉及PPAR α信號傳導(dǎo)途徑。ERRa直接激活PPAR a基因表達(dá)，并且在來自于PPAR a +小鼠的細(xì)胞中ERR a介導(dǎo)的對MCAD和M-CPT I的調(diào)節(jié)被消除。目前還已知道ERR a參與PGC-1 a調(diào)節(jié)線粒體生物發(fā)生。已知其通過調(diào)節(jié)Gapba基因(編碼NRF-2復(fù)合物的一個亞基并且直接在轉(zhuǎn)錄水平上激活參與線粒體氧化代謝的基因)介導(dǎo)PGC-1 α活化NRF途徑。ERRa和其輔激活因子PGC-1a激活MCAD、細(xì)胞色 素c和ATP合酶β基因啟動子。綜合起來這些結(jié)果將ERR α確定為通過參與PGC-1調(diào)節(jié)路徑對心臟氧化能量代謝的調(diào)節(jié)因子。然而，在心臟中ERR的精確生物學(xué)作用尚未確定。核受體ERR Y (雌激素相關(guān)受體Y )在心臟、骨骼肌、腎臟和腦以及發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)。哺乳動物細(xì)胞中輔激活因子PGC-1 a和PGC-1 β的表達(dá)有力地增強(qiáng)了由ERR Y引起的轉(zhuǎn)錄激活。孤兒受體的組成型活化功能2(AF-2)對于協(xié)同增強(qiáng)至關(guān)重要。功能性受體截短分析已經(jīng)用于鑒定額外的氨基末端活化功能，這對于ERR Y 2同種型和PGC-1 a是特異性的。體外實(shí)驗(yàn)表明ERR Y與這兩種輔激活因子均有直接相互作用。這些發(fā)現(xiàn)與PGC-1 a和PGC-1 β作為對ERR Y的組織特異性輔激活因子的不同調(diào)節(jié)功能的假設(shè)相吻合。不過需要更多的研究進(jìn)一步定義這些功能。在轉(zhuǎn)基因小鼠中PGC-1的心臟特異性過表達(dá)導(dǎo)致心肌細(xì)胞中線粒體失控增殖，致使肌節(jié)結(jié)構(gòu)喪失和擴(kuò)張性心肌病。因此，PGC-1是在對能量需求的響應(yīng)中控制心臟線粒體數(shù)量和功能的重要調(diào)節(jié)分子。即使不是所有的，大多數(shù)這些調(diào)節(jié)途徑涉及信號傳導(dǎo)途徑中中間體的磷酸化。對磷酸化的抑制，例如通過多種不同的激酶抑制劑的作用，影響這些信號傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致脂肪酸代謝的改變，其可引起器官毒性，包括心臟毒性。許多新的抗癌藥物為激酶抑制劑并且伴有毒性。因此，需要方法以鑒定藥物是否伴有毒性作用，以及該毒性作用是否可能在患者體內(nèi)發(fā)生。還需要方法在維持其對抗磷酸化的受體靶的效力同時避免這些抑制劑的毒性作用。概述公開了診斷毒性特別是心臟毒性是否可能在選擇用多種藥物(例如酪氨酸激酶抑制劑或者erbB抑制劑)進(jìn)行治療的患者中發(fā)生的方法。此外還公開了評估一種候選藥物是否可能具有毒性或者心臟毒性作用的方法。在一種方法中，可分析脂質(zhì)例如甘油三酯和膽固醇以確定是否存在脂肪酸氧化紊亂。在另一種方法中，可測定負(fù)責(zé)所觀察到的脂肪酸氧化的酶(例如MCAD)。關(guān)于脂質(zhì)水平，認(rèn)為在正常細(xì)胞中AMP活化的蛋白激酶的活化可導(dǎo)致脂質(zhì)水平的特征性減少，以及糖酵解的和較短碳鏈中間產(chǎn)物(例如C2至C6碳中間產(chǎn)物)的相應(yīng)增加。對于本公開內(nèi)容的目的而言，可將與正常細(xì)胞中的特征性脂質(zhì)減少的任何統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著偏差視為脂肪酸氧化紊亂。類似地，對于本公開內(nèi)容的目的而言，對于參與這些代謝途徑的酶，這些酶的活性或水平的量相對于正常細(xì)胞的任何統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著改變(通過Western、Northern.PCR或者其它技術(shù)測量)可視為脂肪酸氧化紊亂。脂肪酸氧化紊亂的診斷可用于預(yù)測增加的毒性風(fēng)險(xiǎn)并且可能作為藥物使用的禁忌指示?；蛘?，如果一種藥物用在患有脂肪酸氧化紊亂的患者身上，可使用所述方法指示密切關(guān)注患者心臟功能的必要性?；蛘呖梢酝ㄟ^諸如正電子發(fā)射體層攝影術(shù)的已知方法測量葡萄糖攝取。對于施用酪氨酸激酶抑制劑藥物時葡萄糖攝取不減少或不減少至與正常非癌細(xì)胞相同程度的情況下，則該藥物治療可能對于非癌細(xì)胞有毒?；蛘?，在暴露于酪氨酸激酶抑制劑時，如果ATP水平的減少超過在正常非癌細(xì)胞中，則預(yù)示該酪氨酸激酶抑制劑有毒。另一種用于預(yù)測選擇用藥物(例如酪氨酸激酶抑制劑，特別是erbB抑制劑)治療的患者是否具有心臟毒性的方法是評估患者體內(nèi)TNFa的水平(無論在腫瘤或血液或在二者中)。TNFa的水平可以用于預(yù)測患者是否可能由于藥物(特別是赫賽汀)治療導(dǎo)致具有與心臟毒性相關(guān)的不良事件。此外還公開了施用激活A(yù)MP活化的蛋白激酶(AMPK)的藥物(例如某些酪氨酸激酶抑制劑)以為了美容原因或體重減輕而減少患者的脂質(zhì)和脂肪的方法。該方法基于驚人的發(fā)現(xiàn)一 AMP活化的蛋白激酶的激活因子導(dǎo)致細(xì)胞代謝轉(zhuǎn)換，從而將脂質(zhì)氧化為較少碳的中間產(chǎn)物。該代謝轉(zhuǎn)換導(dǎo)致受處理細(xì)胞脂質(zhì)含量的驚人減少。以足以激活A(yù)MP活化的蛋白激酶的量施用AMP活化的蛋白激酶的激活因子可用于使細(xì)胞去掉一部分其脂質(zhì)含量。已知有許多向細(xì)胞施用此類化合物的方法并可以使用?？墒褂镁植炕蛘呷硎┯??？赏ㄟ^注射、通過皮膚貼劑或軟膏或洗液進(jìn)行局部施用。此外還公開一種方法用于將AMP活化的蛋白激酶的激活因子施用于患者，或者將其包含在一種介質(zhì)中與器官溫育，使用的量足以保護(hù)器官例如心肌和/或腦細(xì)胞免于急性窘迫(acute distress),所述急性窘迫通常會由創(chuàng)傷諸如缺血、細(xì)胞因子釋放、葡萄糖剝奪和在診斷出這類情況的細(xì)胞和器官中導(dǎo)致代謝壓力的類似事件引起。還可以使用雙激酶抑制劑，特別是導(dǎo)致AMP活化的蛋白激酶活性增加的酪氨酸激酶抑制劑。優(yōu)選地如詳述中進(jìn)一步所說明的，這類激酶抑制劑對于其靶將是特異性的。已知并且可使用許多施用方法。例如該藥物可包含在溶液中以對器官進(jìn)行灌注或可進(jìn)行全身施用。
此外還公開一種方法用于保存器官用來移植。該方法涉及制備含有AMPK激活因子的保存溶液并且使器官與該保存溶液接觸。該保存溶液可以是任何添加足夠量AMPK激活因子以提供對器官的改進(jìn)保護(hù)的已知保存溶液。在此描述了另外的特點(diǎn)和長處，并將由以下詳述和附圖清楚地說明。附圖簡述

圖1為在Au565細(xì)胞中受赫賽汀處理調(diào)節(jié)的基因列表。圖2為用NDF或赫賽汀處理并且進(jìn)行脂質(zhì)染色的Au_565細(xì)胞的照片。
圖3為用GW-2974處理并且進(jìn)行脂質(zhì)染色的Au_565細(xì)胞的照片。圖4為在不同條件下生長并且進(jìn)行脂質(zhì)染色的原代人心肌細(xì)胞的照片。圖5為顯示在不同條件下檢測脂質(zhì)呈陽性人心肌細(xì)胞的百分比的條形圖。圖6為MDA-MB-468細(xì)胞用GW-2974處理并通過Fluoro_4檢測胞內(nèi)Ca的照片。圖7A為顯示某些酪氨酸激酶抑制劑對于p_eEF2和p-AMPKa表達(dá)的影響的Western印跡照片。圖7B為顯示不同化合物存在下Au565細(xì)胞中的p_eEF2表達(dá)的染色細(xì)胞照片。圖8為經(jīng)過或不經(jīng)過不同激酶抑制劑處理的心肌細(xì)胞中ERR α和MCAD的照片。圖9為顯示用不同類型erbB抑制劑和TNFa組合處理的HMC的生長抑制的條形圖。圖10為用TNF a、GW2974或者赫賽汀(或者組合)處理后探測NF- κ B的HMC的Western 印跡。詳述一方面，本 公開是基于發(fā)現(xiàn)藥物(例如酪氨酸激酶抑制劑，如赫賽汀和拉帕替尼(lapatinib, Tykerb))影響與脂質(zhì)代謝途徑相關(guān)的基因的表達(dá)并且強(qiáng)烈影響細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的量。用本發(fā)明的激酶抑制劑對其它方面正常的細(xì)胞或具有正常蛋白質(zhì)酪氨酸激酶調(diào)節(jié)的細(xì)胞進(jìn)行處理，通過增加或減少所述細(xì)胞氧化脂肪酸的能力而影響脂肪酸代謝。當(dāng)培養(yǎng)生長的正常脂肪細(xì)胞暴露于例如GW2974、GW572016的激酶抑制劑時，所述細(xì)胞中儲存的脂質(zhì)迅速消失。該觀察結(jié)果也在心臟細(xì)胞中觀察到?？墒褂糜图tO脂質(zhì)染色進(jìn)行該類研究。因此，用拉帕替尼(tykerb)和其它Her 1/Her2酪氨酸激酶抑制劑處理致使該類細(xì)胞丟失脂肪,這與降低的脂質(zhì)合成速率和/或增加的脂質(zhì)氧化速率相吻合。用其它藥物(例如赫賽汀)，NDF脂質(zhì)含量表現(xiàn)出增加。還已經(jīng)知道許多激酶抑制劑可用作化療劑。在一些患者中這些藥物產(chǎn)生心臟毒性。本公開基于可以將脂肪酸代謝的缺陷與心臟毒性相聯(lián)系的驚人發(fā)現(xiàn)。因此，在脂肪酸代謝方面具有特定功能障礙或者血液中TNFa水平高、并且經(jīng)受激酶抑制劑治療的患者，用例如erbB酪氨酸激酶抑制劑的激酶抑制劑治療后，更有可能遭受心臟功能失常例如心肌病。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織或血清中具有高水平的TNF α或其下游存活因子NF- κ B的患者通常對赫賽汀有更好的反應(yīng)。該發(fā)現(xiàn)引出了新方法的開發(fā)，用于預(yù)測患者在用影響某些細(xì)胞蛋白質(zhì)磷酸化狀態(tài)的藥物(包括激酶抑制劑，單獨(dú)或與其它活性劑聯(lián)合使用)治療時是否將遭受心臟毒性。公開一種方法用于分析患者的脂質(zhì)包括甘油三酯及膽固醇和/或脂質(zhì)代謝酶例如尤其是MCAD。這類分析的結(jié)果可用于預(yù)測何時可能由激酶抑制劑治療引起心臟毒性并且提供對經(jīng)受藥物(例如激酶抑制劑，包括赫賽汀、GW572016或者其它erbB抑制劑)治療的患者應(yīng)該密切監(jiān)測其心臟功能的早期指示。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)5- ‘AMP-活化的蛋白激酶(已顯示它在其它組織中使乙酰輔酶A羧化酶磷酸化并且失活)的活性在缺血末期顯著增加，并且在再灌注的過程中保持升高。在缺血過程中5’-AMP的累積導(dǎo)致AMP活化的蛋白激酶的活化，在再灌注過程中AMP活化的蛋白激酶使乙酰輔酶A羧化酶磷酸化并且失活。隨后的丙二酰輔酶A水平的降低可導(dǎo)致在缺血心臟的再灌注過程中脂肪酸氧化速率的增加。
對于心臟毒性，已知有多種脂肪酸氧化紊亂并且在下面表I中列出。如果在患者中檢測出這樣一種紊亂，可以提供激酶抑制劑可對心臟有毒的指示。表I
酰基輔酶A脫氫酶缺陷?；o酶A脫氫酶，短鏈(SCAD)
?；o酶A脫氫酶，中鏈(MCAD)
酰基輔酶A脫氫酶，長鏈(LCAD)
?；o酶A脫氫酶，極長鏈(VLCAD)
2-烯酰輔酶A水合酶缺陷L-3-擇酰輔酶A脫氫酶缺陷
L-3-羥酰輔酶A脫氫酶，短鏈(SCHAD)
三官能蛋白質(zhì):長鏈FA (LCHAD)α亞基(HADHA)β亞基(HADHB)
3-酮脂酰輔酶A硫解酶缺陷
3-酮脂酰輔酶A硫解酶， 中鏈(MCKAT)
三官能蛋白質(zhì)
α -曱基?；o酶A消旋酶(AMACR)缺陷肉堿-醜基肉堿移位酶缺陷:3p2L2，4-二晞酰輔酶A還原酶缺陷:8q21電子傳遞黃素蛋白(ETF)缺陷:15q23魚鱗癖狀紅皮病(NCIE2): CGI58基因;3p21三官能蛋白質(zhì)缺陷:亞基A和B酪氨酸血癥1°肉堿代謝紊亂脂肪酸和肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)途徑脂肪酸氧化途徑脂質(zhì)紊亂
線粒體:生化異常
過氧化物酶體紊亂這類紊亂可以通過任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行檢測。例如，在某些紊亂中可將脂肪酸飼喂給個體并且追蹤其代謝?；蛘撸?，可以測定酶水平，如通過Western印跡，或者對某些基因產(chǎn)物可以分析mRNA水平。任何可檢測到的減少表明存在脂肪酸氧化紊亂，并且用酪氨酸激酶抑制劑治療可能對正常細(xì)胞和器官有毒。在一種方法中，可對作為用激酶抑制劑治療候選人的患者進(jìn)行這些疾病的篩選以確定他們是否有可能遭受心肌細(xì)胞毒性。例如可對培養(yǎng)生長的心肌細(xì)胞中的生物大分子進(jìn)行測定以確定施用候選藥物如何影響這些大分子的水平。在一種方法中，可將人心肌細(xì)胞培養(yǎng)生長并且可在候選藥物存在的情況下對磷酸化的AMP活化的蛋白激酶的水平進(jìn)行監(jiān)測。這可以通過檢測磷酸化的AMP活化的蛋白激酶的Western印跡法進(jìn)行測定。并非對本發(fā)明進(jìn)行限制，相信在應(yīng)激條件(例如缺氧、缺血、葡萄糖剝奪和饑餓)下，細(xì)胞內(nèi)AMP: ATP比例的增加變構(gòu)激活A(yù)MP活化的蛋白激酶(AMPK)，這是一種意圖保持細(xì)胞能量平衡的反應(yīng)。最初發(fā)現(xiàn)AMP活化的蛋白激酶抑制乙酰輔酶A羧化酶(ACC)和3 —羥基一 3 -甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA還原酶，HMGR)的制備物。AMPK的活化被認(rèn)為起始了一系列下游磷酸化事件，使細(xì)胞從活躍的ATP消耗(例如脂肪酸、膽固醇和蛋白質(zhì)的生物合成)轉(zhuǎn)換為ATP生成(例如脂肪酸和葡萄糖氧化)。應(yīng)激誘導(dǎo)的AMPK活化被認(rèn)為是在一個或多個上游AMPK激酶(AMPKK)對其α亞基上172位的蘇氨酸的磷酸化之后發(fā)生，所述上游AMPK激酶包括鈣調(diào)蛋白依賴性激酶激酶β (CAMKK β)(一種鈣激活的蛋白激酶)和LKBl (由Peutz-Jegher綜合征腫瘤抑制基因編碼的絲氨酸/蘇氨酸激酶)。相信在骨骼肌和心臟中AMPK的活化導(dǎo)致對乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的磷酸化和抑制，認(rèn)為這進(jìn)而又減少了丙二酰輔酶A (其自身為肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶I (CPT I)的抑制劑)的水平。認(rèn)為CPTl的去抑制導(dǎo)致了伴隨的脂肪酸β_氧化的增加，這被認(rèn)為引起了線粒體生成ATP增加。應(yīng)激誘導(dǎo)的AMPK活化還被認(rèn)為通過抑制mTOR并且直接調(diào)節(jié)eEF2 (已知與心臟保護(hù)相關(guān)的翻譯延伸因子)來抑制蛋白 質(zhì)合成。重要的是，線粒體功能的改變被認(rèn)為可引起由伊馬替尼(imatinib)所致的心肌細(xì)胞死亡。另外，通過AMPK介導(dǎo)的TSC2磷酸化對帽依賴性翻譯的抑制被認(rèn)為在響應(yīng)ATP耗盡的細(xì)胞存活中極其重要。AMPK活化后增加的ATP生物合成而非消耗，可能還保護(hù)心肌細(xì)胞免于缺血性損傷。已發(fā)現(xiàn)可激活A(yù)MPK及其下游底物的分子例如GW2974(—種強(qiáng)有效的小分子HER2/EGFR酪氨酸激酶抑制劑，具有類似于拉帕替尼的活性譜)，刺激脂肪酸氧化，這進(jìn)而又增加在表達(dá)HER2的人心肌細(xì)胞中ATP的生成，形成對由TNF α (一種在心衰中檢測到的已知細(xì)胞因子)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的保護(hù)。相反地,不活化AMPK的分子例如曲妥珠單抗(trastuzumab )導(dǎo)致響應(yīng)TNF α的增加的心肌細(xì)胞死亡。對于AMPK和隨之的能量生成的特異性HER2-靶向療法的效果可以預(yù)測心肌病相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)，并且提供一種新的HER2-引導(dǎo)的治療策略，以保護(hù)心肌在急性缺血損傷之后免于TNFa或其它促細(xì)胞凋亡刺激物的殺傷效應(yīng)。另外，酪氨酸激酶抑制劑可用于減少細(xì)胞中的脂肪，特別是其它方面正?；驘o蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性介導(dǎo)的疾病的細(xì)胞。對于這個目標(biāo)，哺乳動物或組織的至少一部分可用激酶抑制劑處理，從而減少細(xì)胞中脂類的量?？墒褂萌魏魏线m的激酶抑制劑。確定合適的抑制劑的方法是為人所熟知的。例如，脂肪細(xì)胞的樣品可在存在和缺乏激酶抑制劑的條件下生長，并且以已知方法用油紅O染色以確定該激酶抑制劑是否導(dǎo)致儲存脂肪的減少。導(dǎo)致可觀察到的脂肪儲存減少的激酶抑制劑適合于本發(fā)明。適合于本發(fā)明的例示性激酶抑制劑包括erbB抑制劑，特別包括GW2974、GW572016等。下面的表II顯示了用GW2974處理所獲得的脂類含量的減少。Au565在本領(lǐng)域已知的正常條件下生長，并用GW2974(25 μ Μ)處理兩天。收集細(xì)胞、清洗并在水中超聲波處理(200 μ L水中2，000，OOO個細(xì)胞)。將細(xì)胞旋轉(zhuǎn)離心下來并且通過對胞內(nèi)代謝物的MS/MS檢測?；鈮A(線粒體脂肪酸氧化的副產(chǎn)物)。表II
醜基肉堿(PfflOI蛋白)
C18:1C16C2 對照(細(xì)胞沉淀)8 564.09148.54 GW2974 (細(xì)胞沉淀)4.10.83258.88在一種方法中，細(xì)胞可用合適的激酶抑制劑處理以減少脂肪 儲量。該方法可包括以下步驟:用足量合適的酪氨酸激酶抑制劑接觸細(xì)胞以使細(xì)胞除去其自身中一定量并且優(yōu)選大部分或更優(yōu)選幾乎所有其過剩儲存脂類。所述細(xì)胞可處于體外細(xì)胞培養(yǎng)中或位于個體中。當(dāng)用于無疾病或無蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性相關(guān)疾病的細(xì)胞時，本方法特別有效。還公開將激酶抑制劑(例如酪氨酸激酶抑制劑或者雙重酪氨酸激酶抑制劑)施用于患者的方法，例如在心臟再灌注期間或心臟病發(fā)作期間，以抵消脂肪酸氧化效應(yīng)并且保護(hù)心肌和/或腦細(xì)胞。該處理可用于保護(hù)心臟細(xì)胞、腦細(xì)胞和來源于其它組織和器官的細(xì)胞，免于由缺血、細(xì)胞因子釋放、葡萄糖剝奪或其它在代謝上脅迫這類細(xì)胞的病癥所造成的急性窘迫。優(yōu)選所述激酶抑制劑是特異性的，在于它們導(dǎo)致代謝活性轉(zhuǎn)換并且不影響無關(guān)的革G。各種不同的激酶抑制劑的特異性可通過Fabian等，A small molecule-kinaseinteraction map for clinical kinase inhibitors，Nature Biotechnology 23，p.329(通過參考文獻(xiàn)引用并入)描述的方法進(jìn)行測定。相信代謝活性的轉(zhuǎn)換是通過AMP活化的蛋白激酶活性的增加帶來的?？蓪⒒钚詣┙?jīng)口施用、通過注射或通過皮膚貼劑、軟膏或洗劑局部施用給個體，或者可不經(jīng)腸道施用，只要其以足夠的量到達(dá)目標(biāo)靶細(xì)胞以發(fā)揮其減少脂類的效用。例如優(yōu)選在儲存脂質(zhì)的組織例如脂肪組織局部施用AMP活化的蛋白激酶的激活因子以使脂質(zhì)含量減少。可將其全身施用給需要治療代謝性應(yīng)激、心臟病發(fā)作、缺血等的患者?？蓪MP活化的蛋白激酶的激活因子以鹽類或溶劑化物或者游離化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行施用，然而，優(yōu)選以藥物制劑形式施用該抑制劑。制劑除活性劑外可包含一種或多種藥用載體、稀釋劑或賦形劑。藥物制劑可以單位劑量形式呈現(xiàn)，包含預(yù)先確定量的活性成分/每單位劑量。如此一個單位可根據(jù)施用途徑和患者的年齡、體重和狀態(tài)包含例如0.5mg至Ig,優(yōu)選70mg至700mg,更優(yōu)選5mg至IOOmg的活性劑。例如在小鼠中，饑餓期間可施用100mg/kg的GW2974以保護(hù)心臟。藥物制劑可適合以任何適宜途徑施用，例如經(jīng)口(包括口含或舌下)、直腸、鼻、局部(包括口含、舌下或透皮)、陰道或非腸道(包括皮下、肌肉、靜脈內(nèi)或皮內(nèi))途徑。這樣的制齊阿通過制藥領(lǐng)域已知的任何方法制備，例如通過將活性成分與載體或賦形劑相結(jié)合。適用于口服的藥物制劑可以采取的形式為:膠囊或片劑；粉劑或顆粒；在水性或非水性液體中的溶液或懸液；可食用的泡沫或攪拌糊(whip);或水包油液體乳劑或者油包水液體乳劑以及在脂質(zhì)體中。用 于透皮施用的藥物制劑可呈現(xiàn)為不連續(xù)貼劑，旨在與受治者的皮膚保持長時間的緊密接觸。可以通過已知方法以離子滲入療法從貼劑中遞送活性成分。用于局部施用的藥物制劑可配制為軟膏、乳霜、懸液劑、洗劑、粉劑、溶液劑、糊劑、凝膠、噴霧劑、氣霧劑或油劑。對于外部組織的治療，制劑可以局部用的軟膏或乳霜形式應(yīng)用。當(dāng)配制為軟膏時，活性劑可以和石蠟質(zhì)或者可與水混溶的軟膏基質(zhì)一起使用?；蛘撸钚詣┻€可以與水包油乳霜基質(zhì)或油包水基質(zhì)配制在乳霜中。優(yōu)選地這類軟膏可使活性劑滲透入皮膚并與靶細(xì)胞和組織接觸，特別在脂肪蓄積的組織和器官中對于脂肪進(jìn)行改善。適于在口中局部施用的藥物制劑包括糖錠、錠劑和漱口水。通過吸入施用的藥物制劑包括精細(xì)顆粒塵劑或霧劑，可通過多種類型已計(jì)量劑量的加壓氣霧劑、噴霧器或吹入器的方式產(chǎn)生。用于陰道施用的藥物制劑可呈現(xiàn)為子宮托、棉塞條、乳膏、凝膠、糊劑、泡沫或者噴霧制劑。非腸道施用的藥物制劑可以包括水性和非水性的無菌注射溶液，其可進(jìn)一步包括例如生育酚的抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使制劑與目標(biāo)受治者血液等滲的溶質(zhì)；以及水性和非水性的無菌懸液劑，其可包括助懸劑和增稠劑。制劑可呈現(xiàn)于單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿瓶和小瓶，并且可在冷凍干燥(凍干)條件下保存，只需要在使用前即刻加入無菌的液體載體例如注射用水。臨時注射溶液和懸液可從無菌粉劑、顆粒和片劑制備。優(yōu)選的單位劑量制劑為含有活性成分的每日劑量或亞劑量，或者適當(dāng)?shù)牟糠至?。?yīng)當(dāng)了解的是除了上述特別提到的成分外，制劑還可包括關(guān)系到所討論制劑類型的本領(lǐng)域常規(guī)的其它試劑，例如適合于口服的制劑可包括調(diào)味劑。需要用本發(fā)明的化合物、鹽或溶劑化物進(jìn)行治療的動物通常為哺乳動物，例如人類。本發(fā)明的活性劑、鹽或溶劑化物的治療有效量將取決于多種因素，包括例如動物的年齡和體重、需要治療的情況的嚴(yán)重度、制劑的性質(zhì)和施用途徑，并且最終在于主治醫(yī)生或獸醫(yī)的判斷力。不過本發(fā)明化合物對于毒性治療的有效量通常在受試者(哺乳動物)每天每公斤體重0.1至500mg的范圍內(nèi)，更通常在每天I 一 200mg/kg體重范圍內(nèi)。因此對于一個70公斤的成年哺乳動物，每天的實(shí)際用量通常為70至700mg，并且該量可以每天單劑量給予或以每天任何數(shù)目的亞劑量給予以使總?cè)談┝肯嗤?。本發(fā)明的鹽或溶劑化物的有效量可以作為化合物本身的有效量的比例確定。本發(fā)明的化合物及其鹽和溶劑化物可單獨(dú)或與其它治療劑聯(lián)合使用。從而根據(jù)本發(fā)明的聯(lián)合療法包括施用至少一種本發(fā)明的AMP活化的蛋白激酶的激活因子或其藥用鹽或溶劑化物，以及至少一種其它藥學(xué)活性劑，例如癌癥治療劑。組合的活性劑可以一起或者分別施用，并且當(dāng)分別施用時可同時或以任何順序序貫施用。本發(fā)明的激酶抑制劑和其它藥學(xué)活性劑的量以及相關(guān)的給藥時機(jī)為達(dá)到期望的聯(lián)合治療效果目的進(jìn)行選擇。實(shí)施例1以下實(shí)施例展示了在Au565細(xì)胞的體外細(xì)胞培養(yǎng)物中受到赫賽汀處理影響的基因的鑒定。Au565細(xì)胞在正常條件下生長并且用赫賽汀處理或不做處理。將細(xì)胞沉淀，用液氮快速冷凍并且使用標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行微陣列分析。從由細(xì)胞沉淀物分離的RNA制備Cy3和Cy5標(biāo)記的cDNA。表III顯示參與脂質(zhì)代謝的基因。受到上調(diào)或下調(diào)的參與其它途徑的基因也顯示于圖1中。表III通過微陣列分析不使用或使用赫賽汀處理的Au565細(xì)胞代謝基因的改變
權(quán)利要求
1.確定藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的體外方法，所述方法包括:鑒定細(xì)胞是否響應(yīng)使用藥物的處理而氧化脂肪酸，其中如果細(xì)胞被鑒定為不響應(yīng)使用所述藥物的處理而氧化脂肪酸，那么確定所述藥物對細(xì)胞是有毒的；或者，其中如果細(xì)胞被鑒定為響應(yīng)使用所述藥物的處理而氧化脂肪酸，那么確定所述藥物對細(xì)胞是無毒的。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述毒性是心臟毒性。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是心肌細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述藥物是抗癌藥物。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述抗癌藥物是酪氨酸激酶抑制劑。
6.確定藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的體外方法，所述方法包括: a)將細(xì)胞與藥物接觸；和 b)分析所述細(xì)胞的脂肪酸氧化， 其中如果細(xì)胞不響應(yīng)與所述藥物的接觸而氧化脂肪酸，那么確定所述藥物是有毒的；或者，其中如果細(xì)胞響應(yīng)與所述藥物的接觸而氧化脂肪酸，那么確定所述藥物是無毒的。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述毒性是心臟毒性。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述細(xì)胞是心肌細(xì)胞。
9.權(quán)利要求6的方法，其中所述藥物是抗癌藥物。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述抗癌藥物是酪氨酸激酶抑制劑。
11.確定藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的體外方法，所述方法包括:就脂肪酸氧化紊亂分析細(xì)胞，其中如果細(xì)胞具有脂肪酸氧化紊亂，那么確定所述藥物是有毒的。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述毒性是心臟毒性。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述細(xì)胞是心肌細(xì)胞。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述藥物是抗癌藥物。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述抗癌藥物是酪氨酸激酶抑制劑。
16.確定藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的體外方法，所述方法包括: a)從受試者獲得細(xì)胞，所述受試者被選擇進(jìn)行使用所述藥物的治療； b)就脂肪酸氧化紊亂分析所述細(xì)胞；和 c)確定在所述細(xì)胞中是否存在脂肪酸氧化紊亂， 其中脂肪酸氧化紊亂的存在預(yù)測，所述藥物是有毒的；并且脂肪酸氧化紊亂的不存在預(yù)測，所述藥物是無毒的。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述毒性是心臟毒性。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述細(xì)胞是心肌細(xì)胞。
19.權(quán)利要求16的方法，其中所述藥物是抗癌藥物。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述抗癌藥物是酪氨酸激酶抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了確定器官毒性特別是心臟毒性是否將在選擇用各種激酶抑制劑如酪氨酸激酶抑制劑更特別是erbB抑制劑如赫賽汀治療的患者中發(fā)生的方法。此外，還公開了確定潛在藥物是否可能產(chǎn)生心臟毒性效應(yīng)的方法。所述方法涉及分析脂質(zhì)水平或者脂肪酸氧化酶、pAMP活化的蛋白激酶的表達(dá)、葡萄糖攝取，以確定是否存在脂肪酸氧化紊亂。鑒定脂肪酸氧化紊亂可用作為毒性特別是心臟毒性的預(yù)測物，和用作為如果施用諸如酪氨酸激酶抑制劑的藥物應(yīng)小心監(jiān)測器官功能的指示。還公開了保護(hù)器官免于代謝性應(yīng)激和處理細(xì)胞如脂肪細(xì)胞以減少其脂質(zhì)含量的方法。
文檔編號G01N33/50GK103217520SQ20131013682
公開日2013年7月24日 申請日期2007年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月27日
發(fā)明者S·S·巴克斯 申請人:靶向分子診斷有限責(zé)任公司