專利名稱：一種利用金納米團簇測定糜蛋白酶活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定糜蛋白酶活性的方法，特別涉及一種利用金納米團簇測定糜蛋白酶活性的方法。
背景技術(shù)：
蛋白酶是水解蛋白質(zhì)、肽鍵的一類酶的總稱，參與了一系列生理和病理過程。許多疾病包括癌癥、中風、感染、風濕性關(guān)節(jié)炎和炎癥等都會影響到蛋白酶的正?；钚浴Ｒ虼?，通過蛋白酶活性的檢測對疾病的診斷具有非常重要的意義。在目前采用的蛋白酶活性測量的方法中，熒光方法具有準確、快速、簡單的優(yōu)勢。這些熒光方法的檢測主要是采用熒光共振能量傳遞(FRET)技術(shù)，選用的熒光底物一般是標記有熒光染料的多肽，因此需要合成多肽和昂貴的熒光標記，檢測成本較高。金納米團簇是由幾個到幾十個金原子組成核心，有機單分子或者蛋白質(zhì)等作為保護基團組合而成的分子級聚集體。金納米團簇作為一類新型納米材料具有獨特的光學(xué)特性，在催化、生物傳感和生物成像上具有廣泛的應(yīng)用。金納米團簇與金納米顆粒的性質(zhì)明顯不同，金納米團簇尺寸與電子的費米波長(〈lnm)相當，由于其尺寸太小而不足以支撐其產(chǎn)生像金納米顆粒一樣的表面等離子體共振。金納米團簇具有一些特殊的光學(xué)特性，如具有依賴與粒子粒徑大小的熒光性質(zhì)等。目前，金納米團簇的制備方法主要是通過一些帶有巰基的高分子、肽鏈、蛋白質(zhì)和DNA來還原金前驅(qū)體。其中，采用蛋白質(zhì)模板合成的金納米團簇具有好的生物相容性和水溶性。采用牛血清白蛋白(BSA)合成金納米團簇具有簡單、綠色、“一鍋煮”的優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用金納米團簇的新用途，具體為金納米團簇在測定糜蛋白酶活性中應(yīng)用。本發(fā)明還保護金納米團簇在測定待測樣品中糜蛋白酶含量中的應(yīng)用。本發(fā)明的再一個目的是提供一種利用金納米團簇測定待測樣品中糜蛋白酶含量的方法。本發(fā)明所提供的利用金納米團簇測定待測樣品中糜蛋白酶含量的方法，具體可包括如下步驟:(al)將糜蛋白酶標準品或待測樣品與金納米團簇混合，形成實驗反應(yīng)體系；同時設(shè)置與所述實驗反應(yīng)體系相比缺少所述糜蛋白酶標準品或所述待測樣品的空白反應(yīng)體系；將所述實驗反應(yīng)體系和所述空白反應(yīng)體系在同一條件下進行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后分別測定所述實驗反應(yīng)體系和所述空白反應(yīng)體系的熒光強度，計算得到所述實驗反應(yīng)體系和所述空白反應(yīng)體系的熒光強度差值；(a2)根據(jù)步驟(al)得到的所述糜蛋白酶標準品的所述熒光強度差值繪制標準曲線，將所述待測樣品的所述熒光強度差值代入所述標準曲線，從而得到所述待測樣品中糜蛋白酶的含量。在上述方法中，步驟(a2)中，所述根據(jù)步驟(al)得到的所述糜蛋白酶標準品的熒光強度差值繪制標準曲線，是以所述糜蛋白酶標準品的所述熒光強度差值為縱坐標，以所述糜蛋白酶標準品在含有所述糜蛋白酶標準品的所述實驗反應(yīng)體系中的終濃度為橫坐標，繪制的標準曲線。 在上述方法中，所述實驗反應(yīng)體系和所述空白反應(yīng)體系的熒光強度差值為反應(yīng)后所述空白反應(yīng)體系的熒光強度減去反應(yīng)后所述實驗反應(yīng)體系的熒光強度。在上述方法中，所述糜蛋白酶標準品可為系列濃度的糜蛋白酶標準品溶液，如濃度依次為 50ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、2500ng/ml、5000ng/ml、25000ng/ml、50000ng/ml、250000ng/ml(相當于 0.05U/mL、0.25U/mL、0.5U/mL、2.5U/mL、5U/mL、25U/mL、50U/mL、250U/mL)的糜蛋白酶標準品溶液；所述糜蛋白酶標準品溶液的溶劑可為pH7 8.5的緩沖體系，在本發(fā)明的一個實施例中，所述糜蛋白酶標準品溶液的溶劑具體為50mM NH4HCOyK溶液。在上述方法中，所述反應(yīng)的溫度可為35_40°C ;所述反應(yīng)的pH可為7-8.5 ;所述反應(yīng)的時間可為50min-70min。在本發(fā)明的一個實施例中，所述反應(yīng)的溫度具體為37°C，所述反應(yīng)的pH具體為7.8,所述反應(yīng)的時間具體為Ih。在本發(fā)明的一個實施例中，所述反應(yīng)的液體環(huán)境可為50mM NH4HCO3水溶液。在上述方法中，所述待測樣品中含有糜蛋白酶，且同時不含有可降解所述金納米團簇包裹蛋白(如BSA)的其他蛋白酶。在本發(fā)明的一個實施例中，所述待測樣品為用糜蛋白酶標準品配制的溶液，具體為將糜蛋白酶標準品溶于50mM NH4HCO3水溶液中得到的溶液；該溶液中糜蛋白酶的濃度為750ng/ml (即0.75U/mL)。在上述方法中，各所述反應(yīng)體系中，所述糜蛋白酶和所述金納米團簇的反應(yīng)配比為(0.003U-15U):24nmol，其中所述金納米團簇的含量以其保護基團BSA的含量計算。具體的，在本發(fā)明中，含有所述糜蛋白酶標準品的所述實驗反應(yīng)體系的組成具體如下:終濃度為(0.01-50) U/mL的所述糜蛋白酶標準品，終濃度為80 μ M的所述金納米團簇；所述糜蛋白酶標準品和所述金納米團簇均溶于50mM NH4HCO3水溶液(pH7.8)中，其中所述金納米團簇的含量以其保護基團BSA的含量計算。含有所述待測樣品的所述實驗反應(yīng)體系的組成具體如下:含有終濃度為150ng/mL總蛋白的所述待測樣品，終濃度為80 μ M的所述金納米團簇；所述待測樣品和所述金納米團簇均溶于50mM NH4HCO3水溶液(pH7.8)中，其中所述金納米團簇的含量以其保護基團BSA的含量計算。所述空白體系的組成具體如下:終濃度為80 μ M的所述金納米團簇；所述金納米團簇均溶于50mM NH4HCO3水溶液(pH7.8)中，其中所述金納米團簇的含量以其保護基團BSA的含量計算。在上述應(yīng)用或方法中，所述金納米團簇的保護基團為蛋白質(zhì)(如BSA)。 本發(fā)明還保護金納米團簇在監(jiān)測糜蛋白酶水解底物蛋白中的應(yīng)用。本發(fā)明的又一個目的是提供一種利用金納米團簇檢測不同反應(yīng)體系中糜蛋白酶對底物蛋白進行水解的反應(yīng)速率快慢的方法。本發(fā)明所提供的利用金納米團簇檢測不同反應(yīng)體系中糜蛋白酶對底物蛋白進行水解的反應(yīng)速率快慢的方法，具體可包括如下步驟:
(bl)將以底物蛋白作為保護基團的金納米團簇與糜蛋白酶進行反應(yīng)，形成不同的反應(yīng)體系，反應(yīng)過程中實時監(jiān)測各反應(yīng)體系的熒光強度；(b2)根據(jù)步驟(bl)中實時監(jiān)測到的各反應(yīng)體系的熒光強度，按照如下方法確定所述不同反應(yīng)體系中糜蛋白酶對底物蛋白進行水解的反應(yīng)速率快慢:所述反應(yīng)體系的熒光強度降低越快則相應(yīng)反應(yīng)體系中糜蛋白酶對所述底物蛋白進行水解的反應(yīng)速率越快；所述反應(yīng)體系的熒光強度降低越慢則相應(yīng)反應(yīng)體系中糜蛋白酶對所述底物蛋白進行水解的反應(yīng)速率越慢。在上述方法中，所述反應(yīng)的溫度可為35-40°C;所述反應(yīng)的pH可為7-8.5。在本發(fā)明的一個實施例中，所述反應(yīng)的溫度具體為37°C,所述反應(yīng)的pH具體為7.8。在本發(fā)明的一個實施例中，所述反應(yīng)的液體環(huán)境可為50mM NH4HCO3水溶液。在上述方法中，各所述反應(yīng)體系中，所述糜蛋白酶和所述金納米團簇的反應(yīng)配比為(0.6U-6U):24nmol，其中所述金納米團簇的含量以其保護基團BSA的含量計算。具體的，在本發(fā)明中，上述方法中所述不同的反應(yīng)體系的組成具體如下:終濃度為
2、10或20U/mL的所述糜蛋白酶標準品，終濃度為80 μ M的所述金納米團簇；所述糜蛋白酶標準品和所述金納米團簇均溶于50mM NH4HCO3水溶液(pH7.8)中，其中所述金納米團簇的含量以其保護基團BSA的含量計算。本發(fā)明的還一個目的是提供一種利用金納米團簇監(jiān)測糜蛋白酶對底物蛋白進行水解的反應(yīng)是否結(jié)束的方法。本發(fā)明所提供的利用金納米團簇檢測糜蛋白酶對底物蛋白進行水解的反應(yīng)是否結(jié)束的方法，具體可包括如下步驟:(Cl)將以底物蛋白作為保護基團的金納米團簇與糜蛋白酶進行反應(yīng)，反應(yīng)過程中實時監(jiān)測反應(yīng)體系的熒光強度；(c2)根據(jù)步驟(Cl)中實時監(jiān)測到的所述反應(yīng)體系的熒光強度，按照如下方法確定所述糜蛋白酶對所述底物蛋白進行水解的反應(yīng)是否結(jié)束:若所述反應(yīng)體系的熒光強度隨著反應(yīng)的進行不再降低，則所述糜蛋白酶對所述底物蛋白進行水解的反應(yīng)結(jié)束；若所述反應(yīng)體系的熒光強度隨著反應(yīng)的進行一直在降低，則所述糜蛋白酶對所述底物蛋白進行水解的反應(yīng)尚未結(jié)束。在上述方法中，所述反應(yīng)的溫度可為35-40°C;所述反應(yīng)的pH可為7-8.5。在本發(fā)明的一個實施例中，所述反應(yīng)的溫度具體為37°C,所述反應(yīng)的pH具體為7.8。在本發(fā)明的一個實施例中，所述反應(yīng)的液體環(huán)境可為50mM NH4HCO3水溶液。在上述方法中，各所述反應(yīng)體系中，所述糜蛋白酶和所述金納米團簇的反應(yīng)配比為(0.6U-6U):24nmol，其中所述金納米團簇的含量以其保護基團BSA的含量計算。具體的，在本發(fā)明中，上述方法中所述反應(yīng)體系的組成具體如下:終濃度為2、10或20U/mL的所述糜蛋白酶標準品，終濃度為80 μ M的所述金納米團簇；所述糜蛋白酶標準品和所述金納米團簇均溶于50mM NH4HCO3水溶液(pH7.8)中，其中所述金納米團簇的含量以其保護基團BSA的含量計算。在以上各應(yīng)用和各方法中，所述蛋白質(zhì)均可為牛血清白蛋白(BSA);所述底物蛋白均可為牛血清白蛋白(BSA)。具體的，所述金納米團簇中金原子與牛血清白蛋白的配比為IOmmol:30g。每個所述金納米團簇包含25個金原子。更加具體的，在本發(fā)明的一個實施例中，所述金納米團簇是按照包括如下步驟的方法制備得到:將等體積(如5mL)的IOmM HAuCl4水溶液與30mg/mL牛血清白蛋白水溶液于37°C反應(yīng)5min ;再向反應(yīng)體系中加入1/20體積(如0.5mL)的IM NaOH水溶液于37°C反應(yīng)12h，從反應(yīng)產(chǎn)物中獲得所述金納米團簇。在上述各方法中，所述熒光強度均是在激發(fā)波長365nm，檢測波長640nm，入射狹縫10納米，出射狹縫10納米的條件下檢測得到的。本發(fā)明無需對糜蛋白酶作用底物進行熒光標記，能夠?qū)崟r檢測糜蛋白酶對底物蛋白的水解過程，同時能夠高靈敏的測定待測樣品中糜蛋白酶的含量。


圖1為金納米團簇測定糜 蛋白酶活性的過程。圖2為實施例1中制備的金納米團簇的熒光吸收光譜和發(fā)射光譜。圖3為37°C下BSA包裹的金納米團簇被不同濃度糜蛋白酶水解后熒光強度隨時間變化曲線。圖4為利用BSA包裹的金納米團簇檢測糜蛋白酶的濃度與熒光強度變化值的關(guān)系(標準曲線)。
具體實施例方式本發(fā)明中，利用金納米團簇測定糜蛋白酶活性的過程如圖1所示，其原理在于:在金納米團簇的合成過程中，牛血清白蛋白(BSA)上的酪氨酸的酚羥基和半胱氨酸的巰基在堿性條件下具還原性，將Au3+還原成Au°，而BSA對金納米團簇的包裹和穩(wěn)定則是通過半胱氨酸殘基與Au形成的Au-S鍵實現(xiàn)的，因此，當在糜蛋白酶作用下，BSA被水解，其結(jié)構(gòu)受到破壞，則會影響金納米團簇的熒光強度。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中的定量實驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。牛血清白蛋白(BSA):購自Amresco公司，其產(chǎn)品目錄號為0332。糜蛋白酶標準品:購自Amresco公司，其產(chǎn)品目錄號為0164。該糜蛋白酶標準品的酶活為1000U/mg。其中，糜蛋白酶的酶活定義為:在測定條件(251:; !1值7.0)下，一分鐘轉(zhuǎn)化I μ mol底物所需要的酶量，即為一個活力單位(即1U)。實施例1、金納米團簇的制備及表征一、BSA包裹的納米金團簇的制備往5mL IOmM HAuCl4水溶液中在37 °C條件下邊磁力攪拌邊加入5mL 30mg/mL牛血清白蛋白(BSA)水溶液反應(yīng)5分鐘，后加入0.5mL IM NaOH水溶液，在37°C下反應(yīng)12小時，得到的深棕色溶液。用二次蒸餾水透析48小時，去除雜質(zhì)。最終得到的BSA包裹的金納米團簇，保存在4度備用。二、BSA包裹的納米金團簇的表征用熒光光譜儀(PerkinElmer Model LS-55)測定步驟一制備得到的BSA包裹的金納米團簇的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。測定結(jié)果如圖2。由圖可知，步驟一制備得到的BSA包裹的金納米團簇的發(fā)射峰在640nm，且熒光發(fā)射較強。這說明步驟一制備得到的是金團簇而不是尺寸較大熒光很弱的金顆粒；另外，發(fā)射峰位置與組成金納米團簇的金原子數(shù)量有關(guān)，在640nm這個位置的發(fā)射峰說明每個金納米團簇大約包含25個金原子(參考文獻:Jianping Xie, YuangangZheng,Jackie Y.Ying.Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent GoldNanoclusters.J.AM.CHEM.SOC.，2009，131，888-889.)。實施例2、金納米團簇監(jiān)測糜蛋白酶水解過程本實施例將詳述如何利用實施例1制備得到的BSA包裹的金納米團簇檢測糜蛋白酶的水解過程。1、將實施例1制備得到的BSA包裹的金納米團簇溶于50mM NH4HCO3水溶液(pH=7.8)中，得到溶液I。溶液I中，實施例1制備得到的BSA包裹的金納米團簇的濃度為0.1mM (以BSA含量計)。2、取 60 μ I 系列濃度(0.lmg/mL、0.05mg/mL、0.01mg/mL ;將質(zhì)量轉(zhuǎn)換為酶活單位，依次為100U/mL、50U/mL、10U/mL )的糜蛋白酶標準品(溶于50mM NH4HCO3水溶液，pH=7.8)分別加入到預(yù)先制備的240 μ I溶液I中，立即混勻加入比色皿中，用熒光光譜儀(PerkinElmer Model LS-55)在37°C下實時監(jiān)測反應(yīng)混合物的熒光強度隨時間的變化，激發(fā)波長為365nm，檢測波長為640nm，入射狹縫10納米，出射狹縫10納米。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。結(jié)果一方面顯示，實施例1制備得到的BSA包裹的金納米團簇熒光強度隨著水解時間的延長而減弱，同時糜蛋白酶初始濃度越高的反應(yīng)體系的熒光信號下降越明顯，詳見圖3。而理論上反應(yīng)體系中糜蛋白酶的初始濃度越高，水解反應(yīng)速率應(yīng)越快。所以根據(jù)以上結(jié)果，可得出如下結(jié)論:熒光信號下降越明顯(熒光強度降低越快)，相應(yīng)反應(yīng)體系中的糜蛋白酶水解反應(yīng)速率越快。結(jié)果另一方面顯示，實施例1制備得到的BSA包裹的金納米團簇的熒光強度隨著水解時間的延長而減弱，且隨著反應(yīng)時間的推移熒光強度基本趨于穩(wěn)定，不再降低，這說明相應(yīng)時間點已沒有肽段繼續(xù)離開金納米團簇表面，即水解反應(yīng)結(jié)束。綜合以上結(jié)果，可見熒光強度隨反應(yīng)時間的變化在一定程度上直接反應(yīng)了糜蛋白酶對底物蛋白BSA的水解反應(yīng)進程。實施例3、金納米團簇檢測待測樣本中糜蛋白酶的含量一、標準曲線的繪制1、將實施例1制備得到的BSA包裹的金納米團簇溶于50mM NH4HCO3水溶液(pH=7.8)中，得到溶液I。溶液I中，實施例1制備得到的BSA包裹的金納米團簇的濃度為0.1mM (以BSA含量計)。2、將 60 μ I 不同濃度(50ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、2500ng/ml、5000ng/ml、25000ng/ml、50000ng/ml、250000ng/ml ;將質(zhì)量轉(zhuǎn)換為酶活單位，依次為 0.05U/mL、0.25U/mL、0.5U/mL、2.5U/mL、5U/mL、25U/mL、50U/mL、250U/mL)的糜蛋白酶標準品(溶于 50mMNH4HCO3水溶液，pH=7.8)分別加入到預(yù)先制備的240 μ I溶液I中，37°C反應(yīng)I小時后，用熒光光譜儀(PerkinElmer Model LS-55)測定反應(yīng)混合物熒光強度，同時測定不加入糜蛋白酶標準品的空白反應(yīng)體系(60 μ I 50mMNH4HC03水溶液(pH=7.8)加入到預(yù)先制備的240 μ I溶液I)在37°C孵育I小時后的熒光強度，激發(fā)波長為365nm，檢測波長為640nm，入射狹縫10納米，出射狹縫10納米。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。3、以反應(yīng)混合物熒光強度的變化值(空白反應(yīng)體系的熒光強度減去反應(yīng)后反應(yīng)混合物熒光強度)為縱坐標，以糜蛋白酶標準品在300μ I反應(yīng)體系中的終濃度(依次為IOng/mL、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、5000ng/ml、10000ng/ml、50000ng/ml)的對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線。結(jié)果圖4所示，金納米團簇熒光強度在與不同濃度糜蛋白酶反應(yīng)I小時后，熒光信號的變化值與糜蛋白酶濃度的對數(shù)成正比，兩者具有良好的線性關(guān)系，其線性方程為:y=-2.33877X+21.40956 (R2=0.99136)。二、待測樣品中糜蛋白酶含量的測定待測樣品:將糜蛋白酶標準品溶于50mM NH4HCO3水溶液(pH=7.8)中，使糜蛋白酶的濃度為 750ng/ml (即 0.75U/mL)。1、將實施例1制備得到的BSA包裹的金納米團簇溶于50mM NH4HCO3水溶液(pH=7.8)中，得到溶液I。溶液I中，實施例1制備得到的BSA包裹的金納米團簇的濃度為0.1mM (以BSA含量計)。2、將60 μ I待測樣品(溶于50mM NH4HCO3水溶液，pH=7.8 )加入到預(yù)先制備的240 μ I溶液I中，37 °C反應(yīng)I小時后，用熒光光譜儀(PerkinElmer Model LS-55)測定反應(yīng)混合物熒光強度，同時測定不加入待測樣品的空白反應(yīng)體系的熒光強度，激發(fā)波長為365nm,檢測波長為640nm，入射狹縫10納米，出射狹縫10納米。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。3、將步驟2所得反應(yīng)混合物的熒光強度變化值(空白反應(yīng)體系的熒光強度減去反應(yīng)后反應(yīng)混合物熒光強度)代入步驟一得到的標準曲線方程中，通過計算得到待測樣品中糜蛋白酶的含量為753.04ng/ml。由于已知糜蛋白酶標準品的酶活為1000U/mg,所以待測樣品中的糜蛋白酶的含量為0.75304U/mL。三、檢測限的測定噪音的確定:在實驗條件下測定空白樣品，得到的數(shù)據(jù)的標準偏差為噪音。噪音數(shù)值乘以3，帶入標準曲線得到檢測限，噪音數(shù)值乘以10，帶入標準曲線得到定量限。具體如下:1、將實施例1制備得到的BSA包裹的金納米團簇溶于50mM NH4HCO3水溶液(pH=7.8)中，得到溶液I。溶液I中，實施例1制備得到的BSA包裹的金納米團簇的濃度為0.1mM (以BSA含量計)。2、將60 μ I濃度為50mM的NH4HCO3水溶液(pH=7.8)加入到預(yù)先制備的240 μ I溶液I中，37°C孵育I小時后，用熒光光譜儀(PerkinElmer Model LS-55)測定混合溶液的熒光強度，激發(fā)波長為365nm，檢測波長為640nm，入射狹縫10納米，出射狹縫10納米。實驗
重復(fù)3次。3、統(tǒng)計步驟2所得的3次重復(fù)實驗，測得的混合溶液的熒光強度值的標準偏差，該標準偏差即為噪音。噪音數(shù)值乘以3，帶入步驟一得到的標準曲線得到檢測限，噪音數(shù)值乘以10，帶入步驟一得到的標準曲線得到定量限。結(jié)果顯示，在信噪比為3的情況下，檢測限為1.4ng/ml (相當于1.4X10_3U/ml)，在信噪比為10的情況下，定量限為5.7ng/ml (相當于5.7X 10_3U/ml)。可見，利用實施例1制備得到的BSA包裹的金納米團簇檢測糜蛋白酶的含量具有較高的靈敏度。
權(quán)利要求
1.金納米團簇在測定糜蛋白酶活性中應(yīng)用。
2.金納米團簇在測定待測樣品中糜蛋白酶含量中的應(yīng)用。
3.一種利用金納米團簇測定待測樣品中糜蛋白酶含量的方法，包括如下步驟: (al)將糜蛋白酶標準品或待測樣品與金納米團簇混合，形成實驗反應(yīng)體系；同時設(shè)置與所述實驗反應(yīng)體系相比缺少所述糜蛋白酶標準品或所述待測樣品的空白反應(yīng)體系；將所述實驗反應(yīng)體系和所述空白反應(yīng)體系在同一條件下進行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后分別測定所述實驗反應(yīng)體系和所述空白反應(yīng)體系的熒光強度，計算得到所述實驗反應(yīng)體系和所述空白反應(yīng)體系的熒光強度差值； (a2)根據(jù)步驟(al)得到的所述糜蛋白酶標準品的所述熒光強度差值繪制標準曲線，將所述待測樣品的所述熒光強度差值代入所述標準曲線，從而得到所述待測樣品中糜蛋白酶的含量。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述反應(yīng)的溫度為35°C-40°C;所述反應(yīng)的PH為7-8.5 ;所述反應(yīng)的時間為50min-70min。
5.金納米團簇在監(jiān)測糜蛋白酶水解底物蛋白中的應(yīng)用。
6.一種利用金納米團簇檢測不同反應(yīng)體系中糜蛋白酶對底物蛋白進行水解的反應(yīng)速率快慢的方法，包括如下步驟: (bl)將以底物蛋白作為保護基團的金納米團簇與糜蛋白酶進行反應(yīng)，形成不同的反應(yīng)體系，反應(yīng)過程中實時監(jiān)測各反應(yīng)體系的熒光強度； (b2)根據(jù)步驟(bl)中實時監(jiān)測到的各反應(yīng)體系的熒光強度，按照如下方法確定所述不同反應(yīng)體系中糜蛋白酶對底物蛋白進行水解的反應(yīng)速率快慢:所述反應(yīng)體系的熒光強度降低越快則相應(yīng)反應(yīng)體系中糜蛋白酶對所述底物蛋白進行水解的反應(yīng)速率越快；所述反應(yīng)體系的熒光強度降低越慢則相應(yīng)反應(yīng)體系中糜蛋白酶對所述底物蛋白進行水解的反應(yīng)速率越慢。
7.一種利用金納米團簇檢測糜蛋白酶對底物蛋白進行水解的反應(yīng)是否結(jié)束的方法，包括如下步驟: (Cl)將以底物蛋白作為保護基團的金納米團簇與糜蛋白酶進行反應(yīng)，反應(yīng)過程中實時監(jiān)測反應(yīng)體系的熒光強度； (c2)根據(jù)步驟(Cl)中實時監(jiān)測到的所述反應(yīng)體系的熒光強度，按照如下方法確定所述糜蛋白酶對所述底物蛋白進行水解的反應(yīng)是否結(jié)束:若所述反應(yīng)體系的熒光強度隨著反應(yīng)的進行不再降低，則所述糜蛋白酶對所述底物蛋白進行水解的反應(yīng)結(jié)束；若所述反應(yīng)體系的熒光強度隨著反應(yīng)的進行一直在降低，則所述糜蛋白酶對所述底物蛋白進行水解的反應(yīng)尚未結(jié)束。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于:所述反應(yīng)的溫度為35°C-40°C;所述反應(yīng)的pH為7-8.5。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的應(yīng)用或方法，其特征在于:所述金納米團簇的保護基團為蛋白質(zhì)；所述蛋白質(zhì)具體為牛血清白蛋白；所述底物蛋白為牛血清白蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一所述的應(yīng)用或方法，其特征在于:所述金納米團簇中金原子與牛血清白蛋白的配比為IOmmol:30g。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用金納米團簇測定糜蛋白酶活性的方法。該方法主要體現(xiàn)在利用金納米團簇測定待測樣品中糜蛋白酶含量，具體包括如下步驟(a1)將糜蛋白酶標準品和待測樣品分別與金納米團簇進行反應(yīng)，分別測定反應(yīng)體系在反應(yīng)前后的熒光強度，得到反應(yīng)前后熒光強度的變化值；(a2)根據(jù)所述糜蛋白酶標準品的反應(yīng)體系的反應(yīng)前后熒光強度的變化值繪制標準曲線，將所述待測樣品的反應(yīng)體系的反應(yīng)前后熒光強度的變化值代入所述標準曲線，從而得到所述待測樣品中糜蛋白酶的含量。實驗證明，本發(fā)明無需對糜蛋白酶作用底物進行熒光標記，能夠?qū)崟r檢測糜蛋白酶對底物蛋白的水解過程，同時能夠高靈敏的測定待測樣品中糜蛋白酶的含量。
文檔編號G01N21/64GK103196883SQ20131013687
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月19日
發(fā)明者方曉紅, 張佳婧, 張振, 陳春英 申請人:中國科學(xué)院化學(xué)研究所