一種基于點(diǎn)擊反應(yīng)的還原糖定量檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種基于點(diǎn)擊反應(yīng)的還原糖定量檢測方法。本發(fā)明利用巰基丙酸修飾納米金，進(jìn)而通過酰胺反應(yīng)分別固定炔基、疊氮基；以葡萄糖為目標(biāo)檢測物，利用葡萄糖的還原性將二價(jià)銅還原為一價(jià)銅，后者充當(dāng)點(diǎn)擊反應(yīng)的催化劑，促使炔基與疊氮基之間發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)，從而改變納米金間距，使納米金聚集變色。根據(jù)納米金的聚集程度，判斷催化劑一價(jià)銅的含量，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品中還原糖的定量檢測。該方法操作簡單，成本低廉，不需要特殊的儀器設(shè)備，重現(xiàn)性，靈敏度相較于以往還原糖檢測手段有明顯提高，是一種在食品科學(xué)、分析化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中具有廣闊應(yīng)用前景的檢測方法。
【專利說明】一種基于點(diǎn)擊反應(yīng)的還原糖定量檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種基于點(diǎn)擊反應(yīng)的還原糖定量檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近半個(gè)世紀(jì)，關(guān)于還原糖的研究和應(yīng)用己有了很大的發(fā)展，在食品分析、發(fā)酵控制、臨床檢驗(yàn)等方面發(fā)揮著重要的作用。但由于糖類物質(zhì)自身的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性以及研究手段的局限性，使得多年來糖類物質(zhì)的研究明顯落后于蛋白質(zhì)和核酸的研究。葡萄糖作為一種最常見的還原糖，是生物體中許多生化反應(yīng)的指標(biāo)物質(zhì)，具有供給能量、補(bǔ)充血糖、強(qiáng)心利尿、促進(jìn)解毒功能的作用，因此，以葡萄糖為代表的還原糖的快速檢測和識(shí)別對(duì)食品安全、糖生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展具有重要意義。
[0003]納米金(AuNPs)獨(dú)特的高活性、易修飾性、高比表面積以及極強(qiáng)的表面等離子體共振效應(yīng)等特點(diǎn)，使其具有常規(guī)大尺寸材料所不具備的優(yōu)越性能，因此在分析化學(xué)領(lǐng)域得到迅速發(fā)展，并受到了越來越多的重視，成為分析化學(xué)的有力工具。為實(shí)現(xiàn)對(duì)特定物質(zhì)的選擇性檢測，對(duì)AuNPs的表面進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎楋@得尤為重要。由于金能夠和巰基形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵(Au-S)，因此納米金表面很容易通過化學(xué)修飾固定上特異性的識(shí)別基團(tuán)。過去幾年來，以AuNPs為探針的傳感器被廣泛用于檢測核酸、蛋白質(zhì)、病毒、金屬離子、等。當(dāng)納米金用于光學(xué)檢測時(shí)，由于具有良好的光學(xué)和電子學(xué)特性，能夠?qū)崿F(xiàn)信號(hào)的放大，從而提高檢測的靈敏度。
[0004]點(diǎn)擊反應(yīng)(Click-reaction)是由Sharpless等提出的一種新型的組合化學(xué)合成方法，其中最典型的反應(yīng)是通過疊氮化合物與末端炔基通過環(huán)加成反應(yīng)生成1，2，3-三唑，該反應(yīng)條件溫和、高效和高控制性、產(chǎn)物單一，并且具有很好的生物兼容性等特點(diǎn)。這些獨(dú)特的性質(zhì)，對(duì)活體內(nèi)(in vivo)和活體外(in vitro)生物的共軛修飾起到了重要作用。同時(shí)，點(diǎn)擊反應(yīng)還被廣泛應(yīng)用于有機(jī)體中蛋白質(zhì)和DNA的標(biāo)記、功能材料的合成與修飾等。必須指出的是，這種環(huán)加成反應(yīng)在一價(jià)銅催化條件下，反應(yīng)速率能提高IO6倍，因此，使得我們利用點(diǎn)擊反應(yīng)構(gòu)建的還原糖比色傳感器能在不到IOmin完成整個(gè)檢測過程。
[0005]傳統(tǒng)的還原糖檢測手段主要有紅外光譜法、高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用以及各式各樣的酶傳感器，這些檢測手段通常伴隨著繁瑣的樣品前處理，大型儀器以及受過培訓(xùn)的操作人員，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；傳統(tǒng)的比色檢測方法:斐林試劑檢測則需要對(duì)檢測樣品進(jìn)行加熱至沸的處理，同時(shí)檢測靈敏度不高，重復(fù)性差，無法進(jìn)行微量還原糖的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種簡便快速定量檢測微量還原糖的方法。
[0007]本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0008]一種基于點(diǎn)擊反應(yīng)的還原糖定量檢測方法，先用巰基丙酸修飾納米金，然后通過酰胺作用在納米金表面分別固定上炔基和疊氮基，再加入還原糖和新配置的二價(jià)銅，通過還原糖還原二價(jià)銅到一價(jià)銅提供點(diǎn)擊反應(yīng)所需的催化劑，完成疊氮化合物與末端炔基通過環(huán)加成反應(yīng)，從而拉近了納米金之間的距離，引起納米金的聚集變藍(lán)；通過檢測還原糖的吸光度，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中還原糖的定量檢測。
[0009]所述的基于點(diǎn)擊反應(yīng)的還原糖定量檢測方法優(yōu)選包括以下步驟:
[0010](I)用巰基丙酸修飾納米金，然后通過酰胺反應(yīng)在納米金表面分別固定炔基和疊氮官能團(tuán)，得到表面修飾了炔基的功能性納米金溶液和表面修飾了疊氮基的功能性納米金溶液；
[0011](2)將兩種功能性納米金溶液混合，向其中加入一系列濃度的還原糖標(biāo)準(zhǔn)品，再加入新配置的氯化銅溶液，將混合溶液于70°C保溫反應(yīng)IOmin ；
[0012](3)將上述混合溶液通過微孔板檢測系統(tǒng)SpectraMax M3進(jìn)行光學(xué)掃描，得到不同濃度的還原糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液對(duì)應(yīng)的紫外-可見光譜；使用吸光度比值A(chǔ)65(i/52(i作為縱坐標(biāo)，還原糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0013](4)按照上述方法測定樣品的紫外-可見光譜，將其吸光度比值A(chǔ)65(i/52(i帶入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到樣品中還原糖的濃度。
[0014]其中，步驟(I)所述的表面修飾了炔基的功能性納米金溶液和表面修飾了疊氮基的功能性納米金溶液的制備方法:在納米金溶液中加入巰基丙酸，使最終溶液中納米金溶液與巰基丙酸的濃度分別為1.0-2.3nM與0.1-0.5 μ M，靜止l_24h ;在10 μ L濃度分別為4mM和ImM的1-乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)的催化條件下，加入18 μ L20 μ M的炔丙胺或18 μ L20 μ M的1-氨基-11-疊氮_3，6，9-三氧雜十一烷，反應(yīng)l_3h，通過形成酰胺鍵得到表面修飾了炔基或疊氮基的功能性納米金溶液。
[0015]功能性納米金溶液的制備中，巰基丙酸與炔基或疊氮基的摩爾比為1:1。
[0016]所述的還原糖選自葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、木糖或核糖中的任意一種或多種。
[0017]所述的納米金使用檸檬酸鈉還原法制備:(I)稱取HAuCl4.4H20溶于蒸餾水中，然后移取一定量的HAuCl4溶液加入到燒瓶，劇烈攪拌，加熱回流。(2)稱取一定的二水合檸檬酸鈉配成溶液，用容量瓶定容。(3)在沸騰狀態(tài)下，用移液器移取一定體積的檸檬酸鈉溶液，快速的加入到燒瓶中。(4)溶液由無色變?yōu)榛疑俚骄萍t色，繼續(xù)加熱30min，冷卻至室溫。
[0018]有益效果:
[0019]本發(fā)明利用巰基丙酸修飾納米金，進(jìn)而通過酰胺反應(yīng)分別固定炔基、疊氮基；以還原糖為目標(biāo)檢測物，利用還原糖的還原性將二價(jià)銅還原為一價(jià)銅，后者充當(dāng)點(diǎn)擊反應(yīng)的催化劑，促使炔基與疊氮基之間發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)，從而改變納米金間距，使納米金聚集變色。根據(jù)納米金的聚集程度，判斷催化劑一價(jià)銅的含量，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品中還原糖的定量檢測。該方法操作簡單，成本低廉，不需要特殊的儀器設(shè)備，重現(xiàn)性，靈敏度相較于以往還原糖檢測手段有明顯提高，是一種在食品科學(xué)、分析化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中具有廣闊應(yīng)用前景的檢測方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢在于:
[0020]1、本發(fā)明操作簡單，相對(duì)于傳統(tǒng)的斐林試劑檢測和蒽酮檢測，本發(fā)明的方便快速，無需任何受訓(xùn)的技術(shù)人員，具有很好的普遍適用性。
[0021]2、本發(fā)明快速高效，整個(gè)檢測過程在IOmin之內(nèi)就能完成，大大減少了檢測時(shí)間
和工作量。[0022]3、本發(fā)明實(shí)現(xiàn)可視化檢測，通過觀察納米金溶液由紅變藍(lán)的速度和程度，來可視化辨別樣品中還原糖的多少。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明的方案原理圖；
[0024]圖2為納米金表面不同巰基丙酸和炔基/疊氮基的修飾比；
[0025]圖3為不同濃度葡萄糖條件下對(duì)應(yīng)的紫外可見光譜；
[0026]圖4為不同葡萄糖濃度時(shí)的吸光度之比；
[0027]圖5功能化的納米金溶液中只有還原糖沒有氯化銅提供催化劑來源和有催化劑來源沒有還原糖時(shí)的紫外可見光譜。內(nèi)嵌圖中的A、B、C分別與紫外光譜a、b、c 一一對(duì)應(yīng)。裸納米金呈現(xiàn)酒紅色A，其對(duì)應(yīng) 的紫外吸收光譜在520nm處有最大吸收峰a ;含糖以及修飾過炔基和疊氮基的納米金混合溶液在沒有二價(jià)銅時(shí)，無法發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng)，溶液仍舊呈酒紅色B，吸收峰基本不變；體系中既含有還原糖又有催化銅源時(shí)，還原糖還原二價(jià)銅從而提供一價(jià)銅，使得點(diǎn)擊反應(yīng)得以完成，納米金發(fā)生聚集呈藍(lán)紫色C，溶液在520nm處的紫外吸收峰有所下降，650nm有新峰；
[0028]圖6為定量糖條件下，點(diǎn)擊反應(yīng)在各個(gè)溫度下的反應(yīng)效率；隨著反應(yīng)溫度的升高，點(diǎn)擊反應(yīng)的效率提高，當(dāng)溫度達(dá)到70°C時(shí)，反應(yīng)效率基本趨于穩(wěn)定；
[0029]圖7為定量糖條件下，點(diǎn)擊反應(yīng)程度隨時(shí)間的變化；隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，反應(yīng)不斷進(jìn)行，當(dāng)時(shí)間達(dá)到9min時(shí),反應(yīng)達(dá)到飽和；
[0030]圖8為不同還原糖條件下的吸光度的比值；
【具體實(shí)施方式】
[0031]實(shí)施例1
[0032]納米金的制備與表征
[0033]所有玻璃儀器都需要使用王水浸泡以出去玻璃容器中殘留的還原性物質(zhì)。首先，在250mL固定好的三口燒瓶中加入IOOmL去離子水，準(zhǔn)確稱取HAuCl4.4H200.0123 μ L溶于其中。劇烈攪拌，加熱回流。再準(zhǔn)確稱取檸檬酸鈉0.2849g于25mL容量瓶中定容。水浴加熱到50°C后用移液器準(zhǔn)確移取一定體積的檸檬酸鈉溶液快速加入燒瓶中。溶液由無色變?yōu)闇\藍(lán)色再到紫色最后成為酒紅色后，繼續(xù)加熱IOmin后停止加熱，繼續(xù)攪拌IOmin后冷卻到室溫即制得所需13±2.5nm金膠。納米金的直徑最后利用投射電子顯微鏡(JEOLJEM-200CX, Japan)確定。
[0034]納米金表面修飾炔基或疊氮化
[0035]首先，取50 μ M的巰基丙酸7 μ L加入800 μ L納米金溶液，充分震蕩，靜置14h ;加入18,8.7,5.8,4.4、3.5 μ L濃度為20 μ M的1-氨基-11-疊氮-3，6，9-三氧雜十一烷或炔丙胺。通過圖2可以看出，當(dāng)加入18 μ L濃度為20 μ M的1-氨基_11_疊氮-3，6, 9_ 二氧雜十一烷或炔丙胺時(shí)，納米金表面修飾的巰基丙酸與炔基或者疊氮基的配比為1:1，對(duì)葡萄糖想響應(yīng)越大，所以本發(fā)明的最適修飾量為1:1。
[0036]葡萄糖的檢測
[0037]將上述最佳條件下制備的表面修飾了炔基的功能性納米金溶液和表面修飾了疊氮基的功能性納米金溶液混合，向混合溶液中分別加入50 μ L0.002,0.006,0.025,0.045、
0.06,0.07,0.09和0.1 μ M不同濃度的葡萄糖溶液，然后再加入10 μ L新配置的0.1mM氯化銅溶液，70°C保溫IOmin后檢測溶液中的紫外可見光譜，得到不同濃度葡萄糖對(duì)應(yīng)的紫外可見光譜(圖3)。然后使用吸光度比值A(chǔ)65(i/52(i作為縱坐標(biāo)，糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制糖物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=3.31821x+0.33148，R2=0.99816。
[0038]未知樣的檢測
[0039]在炔基化和疊氮化的納米金混合溶液中加入50 μ L未知樣品，然后再加入10 μ L新配置的0.1mM氯化銅溶液，IOmin后檢測溶液中的紫外可見光譜，得到Α65(ι/52(ι值帶入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算還原糖含量。同時(shí)，用手工斐林試劑法同時(shí)測定未知樣中的還原糖含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，以未知樣中還原糖的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)進(jìn)行對(duì)比，本法得到的結(jié)果為13.13%，而通過手工斐林試劑法測得的百分含量為12.68%，表面本法檢測還原糖的準(zhǔn)確度高。
[0040]實(shí)施例2
[0041]發(fā)明方案的可行性驗(yàn)證
[0042]在400 μ L修飾了炔基和疊氮基的納米金混合溶液中分別加入50 μ L濃度為ImM的葡萄糖沒有氯化銅提供催化劑來源和有10 μ L的0.1mM催化劑來源沒有葡萄糖的樣品，調(diào)節(jié)溫度為70°C，放置IOmin后，用紫外可見分光光度計(jì)掃描(圖5)。有圖5可見:裸納米金(A)呈現(xiàn)酒紅色，其對(duì)應(yīng)的紫外吸收光譜(a)在520nm處有最大吸收峰；含糖以及修飾過炔基和疊氮基的納米金混合溶液(B)在沒有二價(jià)銅時(shí)，無法發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng)，溶液仍舊呈酒紅色，吸收峰基本不變；體系中既含有還原糖又有催化銅源(C)時(shí)，還原糖還原二價(jià)銅從而提供一價(jià)銅，使得點(diǎn)擊反應(yīng)得以完成，納米金發(fā)生聚集呈藍(lán)紫色，溶液在520nm處的紫外吸收峰有所下降，650nm有新峰。
[0043]溫度的影響
[0044]在含有50 μ L的0.1 μ M葡萄糖的功能性納米金混合溶液中加入10 μ L新制氯化銅，放入水浴鍋，分別在20、30、40、50、60、70、80、90和100 V條件下反應(yīng)，放置IOmin后，用紫外可見分光光度計(jì)掃描，結(jié)果見圖6，由圖6可見反應(yīng)的最佳溫度為70°C。
[0045]時(shí)間的影響
[0046]在含有50 μ L的0.1 μ M葡萄糖的功能性納米金混合溶液中加入10 μ L新制氯化銅，調(diào)節(jié)溫度為70°C，分別在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和15min時(shí)檢測其吸光度，結(jié)果見圖7，由圖6可見反應(yīng)的最佳時(shí)間為lOmin。
[0047]實(shí)施例3
[0048]在400 μ L修飾了炔基和疊氮基的納米金混合溶液中分別加入50 μ L濃度為ImM的蔗糖、果糖、木糖，調(diào)節(jié)溫度為70°C，放置IOmin后，用紫外可見分光光度計(jì)掃描，各還原
MA6507520 值見圖 8。
[0049]本發(fā)明提出了一種新的、簡便的可視化檢測還原糖的方法。通過對(duì)其最適條件等的研究，發(fā)現(xiàn)該發(fā)明能快速、靈敏地的檢測，整個(gè)檢測過程在IOmin以內(nèi)完成，同時(shí)，本發(fā)明所涉及到的物質(zhì)價(jià)格便宜，操作簡單，為其實(shí)際應(yīng)用檢測奠定了重要的基礎(chǔ)。
【權(quán)利要求】
1.一種基于點(diǎn)擊反應(yīng)的還原糖定量檢測方法，其特征在于先用巰基丙酸修飾納米金，然后通過酰胺作用在納米金表面分別固定上炔基和疊氮基，再加入還原糖和新配置的二價(jià)銅，通過還原糖還原二價(jià)銅到一價(jià)銅提供點(diǎn)擊反應(yīng)所需的催化劑，完成疊氮化合物與末端炔基通過環(huán)加成反應(yīng)，從而拉近了納米金之間的距離，引起納米金的聚集變藍(lán)；通過檢測還原糖的吸光度，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中還原糖的定量檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于點(diǎn)擊反應(yīng)的還原糖定量檢測方法，其特征在于包括以下步驟: (1)用巰基丙酸修飾納米金，然后通過酰胺反應(yīng)在納米金表面分別固定炔基和疊氮官能團(tuán)，得到表面修飾了炔基的功能性納米金溶液和表面修飾了疊氮基的功能性納米金溶液； (2)將兩種功能性納米金溶液混合，向其中加入一系列濃度的還原糖標(biāo)準(zhǔn)品，再加入新配置的氯化銅溶液，將混合溶液于70°C保溫反應(yīng)IOmin ； (3)將上述混合溶液通過微孔板檢測系統(tǒng)SpectraMaxM3進(jìn)行光學(xué)掃描，得到不同濃度的還原糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液對(duì)應(yīng)的紫外-可見光譜；使用吸光度比值A(chǔ)650/520作為縱坐標(biāo)，還原糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； (4)按照上述方法測定樣品的紫外-可見光譜，將其吸光度比值A(chǔ)650/520帶入所述標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到樣品中還原糖的濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于點(diǎn)擊反應(yīng)的還原糖定量檢測方法，其特征在于步驟(I)所述的表面修飾了炔基的功能性納米金溶液和表面修飾了疊氮基的功能性納米金溶液得的制備方法為:在納米金溶液中加入巰基丙酸，使最終溶液中納米金溶液與巰基丙酸的濃度分別為1.0-2.3nM與0.1-0.5 μ M，靜止l_24h ;在10 μ L濃度為4mM和ImM的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺的催化條件下，加入18 μ L20 μ M的炔丙胺或18 μ L20 μ M的1-氨基-11-疊氮-3，6，9-三氧雜十一烷，反應(yīng)l_3h，通過形成酰胺鍵得到表面修飾了炔基的功能性納米金溶液和表面修飾了疊氮基的功能性納米金溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于點(diǎn)擊反應(yīng)的還原糖定量檢測方法，其特征在于巰基丙酸與炔基或疊氮基的摩爾比為1:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于點(diǎn)擊反應(yīng)的還原糖定量檢測方法，其特征在于所述的還原糖選自葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、木糖或核糖中的任意一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于點(diǎn)擊反應(yīng)的還原糖定量檢測方法，其特征在于所述的納米金使用檸檬酸鈉還原法制備。
【文檔編號(hào)】G01N21/33GK103454268SQ201310139246
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年4月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月19日
【發(fā)明者】黃和, 李燕萍, 江凌, 田丹碧, 李霜 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)