一種聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)藥物的修飾位點(diǎn)的測定方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于藥物分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言涉及一種聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)藥物的修飾位點(diǎn)的測定方法，其中所述修飾位點(diǎn)為氨基修飾位點(diǎn)，所述氨基選自多肽鏈N末端的α氨基或多肽鏈中賴氨酸殘基的ε氨基。本測定方法操作簡單，適應(yīng)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可廣泛用于聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)藥物中氨基修飾位點(diǎn)的確證，從而充分滿足質(zhì)量控制的要求。
【專利說明】一種聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)藥物的修飾位點(diǎn)的測定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言涉及一種聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)藥物的 修飾位點(diǎn)的測定方法，其中所述修飾位點(diǎn)為氨基修飾位點(diǎn)。

【背景技術(shù)】
[0002] 聚乙二醇化技術(shù)（PEGylation)是20世紀(jì)70年代后期逐漸發(fā)展起來的一種熱門 技術(shù)，是用水溶性聚合物修飾藥用物質(zhì)的方法之一，它可以解決化合物、蛋白和多肽等物質(zhì) 在臨床應(yīng)用過程中存在的許多問題。研究證實(shí)，通過用聚乙二醇（PEG)來修飾蛋白質(zhì)表面 的氨基酸殘基可以有效提高血漿半衰期，減少給藥次數(shù)，還可以降低蛋白質(zhì)的免疫原性。過 去三十年，聚乙二醇化技術(shù)發(fā)展迅速，目前已有十余種聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)藥物上市，此 外還有多種聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)藥物處于臨床研究階段。
[0003] 早期的聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)藥物（如聚乙二醇腺苷脫氨酶、聚乙二醇天門冬酰 胺酶）采用分子量為5kDa的聚乙二醇對目標(biāo)蛋白進(jìn)行多位點(diǎn)修飾，因此，早期開發(fā)的產(chǎn)品 一般為多修飾的混合物，其中修飾位點(diǎn)的測定較為困難。
[0004] 隨著聚乙二醇化技術(shù)的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了針對游離氨基（包括N末端的游離α氨 基和賴氨酸側(cè)鏈的ε氨基）進(jìn)行修飾的聚乙二醇琥珀酰亞胺酯修飾法，例如羅氏的派羅 欣、先靈葆雅的佩樂能均為此種修飾的成功應(yīng)用實(shí)例，盡管制品為單修飾制品，但是制品中 仍存在多種位置異構(gòu)體，而不同的位置異構(gòu)體可能在理化性質(zhì)、藥理活性與安全性特征方 法存在較大差異，因此需對修飾位點(diǎn)進(jìn)行測定，兩家公司均采用了液質(zhì)聯(lián)用測定法對修飾 位點(diǎn)進(jìn)行測定，該法的主要步驟是：采用酶切液對未修飾的干擾素及修飾后的干擾素進(jìn)行 酶切，然后比較修飾前后干擾素液質(zhì)圖中發(fā)生改變的肽段，從而間接推測修飾位點(diǎn)。由于 聚乙二醇修飾后存在較大的空間位阻作用，使得酶切液難以充分酶切，難以獲得與理論完 全一致的修飾液質(zhì)圖，導(dǎo)致修飾位點(diǎn)難以判斷。此外，該測定方法對樣品純度要求較高，需 95%以上的樣品純度才能獲得較理想的結(jié)果，因此，該方法在適用性和準(zhǔn)確性方法仍不能滿 足要求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)藥物的修飾位點(diǎn)的測定方法，其中修飾位 點(diǎn)為氨基，所述方法包括以下步驟： (1) 以聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)藥物的位置異構(gòu)體為原料，制備均一化修飾的多肽片段， 其中所述多肽片段與聚乙二醇共價(jià)連接，且具有3-50個氨基酸殘基； (2) 采用Edman降解法測定步驟（1)中的均一化修飾的多肽片段的氨基酸序列； (3) 將步驟（2)中的氨基酸序列對應(yīng)至相應(yīng)的蛋白質(zhì)藥物序列，若步驟（2)中出現(xiàn)兩個 或多個無法正常測出的氨基酸，那么除半胱氨酸外的那個氨基酸所對應(yīng)的位點(diǎn)即為修飾位 點(diǎn)；若步驟（2)中僅出現(xiàn)一個無法正常測出的氨基酸，那么該氨基酸所對應(yīng)的位點(diǎn)即為修 飾位點(diǎn)。
[0006] 其中步驟（1)的多肽片段優(yōu)選具有3-30個氨基酸殘基；更優(yōu)選的，步驟（1)的多 肽片段具有3-20個氨基酸殘基；最優(yōu)選的，步驟（1)的多肽片段具有4-15個氨基酸殘基。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)藥物的氨基酸序列較短時(shí)，也可以聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)藥物的位置異構(gòu)體直接 作為均一化修飾的多肽片段直接投入步驟（2)的Edman降解。
[0007] 其中步驟（2)中經(jīng)過Edman降解獲得的PTH氨基酸由柱前衍生的高效液相色譜進(jìn) 行分析。
[0008] 其中步驟（3)中無法正常測出的氨基酸指，在柱前衍生的高效液相色譜圖中無明 顯氨基酸衍生物信號被檢出的氨基酸。
[0009] 術(shù)語"蛋白質(zhì)藥物"指具有醫(yī)藥用途的蛋白質(zhì)，其包括但不限于腺苷脫氨酶、天門 冬酰胺酶、干擾素（例如干擾素 a -2a、a _2b等）、粒細(xì)胞集落刺激因子、促紅細(xì)胞生成素、 尿酸酶、凝血因子（例如因子VII、因子VIII等）、胰島素、胰島血糖素樣肽-1、白細(xì)胞介 素、生長因子受體拮抗劑、胸腺肽、降纖酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶、蛇毒凝血酶、抑肽酶、 抗體。這些蛋白質(zhì)可從其天然來源處（例如人）經(jīng)由分離、提純而獲得，亦可通過固相化學(xué) 合成技術(shù)或重組DNA技術(shù)進(jìn)行制備。獲得這些蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域公知的，技術(shù)人員可 根據(jù)具體情況（例如多肽序列的長短、產(chǎn)率等）選擇適宜的方法。
[0010] 術(shù)語"聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)藥物"指蛋白質(zhì)與聚乙二醇在適宜的反應(yīng)條件下得 到的修飾產(chǎn)物，其中聚乙二醇與蛋白質(zhì)可以多種摩爾比進(jìn)行反應(yīng)，從而得到單修飾或多修 飾的產(chǎn)物。本文使用的"聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)藥物"為單修飾的產(chǎn)物，其包括但不限于： 聚乙二醇腺苷脫氨酶、聚乙二醇天門冬酰胺酶、聚乙二醇干擾素、聚乙二醇人粒細(xì)胞集落刺 激因子（pegfilgrastim)、聚乙二醇人GH受體拮抗劑（pegvisomant)、聚乙二醇促紅細(xì)胞生 成素、聚乙二醇尿酸酶，聚乙二醇降纖酶、聚乙二醇蛇毒凝血酶、聚乙二醇抑肽酶、聚乙二醇 超氧化物歧化酶、聚乙二醇凝血因子VIII，并優(yōu)選為聚乙二醇干擾素，例如聚乙二醇干擾素 ct _2a、ct _2b 等。
[0011] 用于修飾蛋白質(zhì)藥物的聚乙二醇（PEG)可以是直鏈或分枝的PEG，其分子量為約 5, 000道爾頓（5k)到約60, 000道爾頓（60k)(術(shù)語"約"指在PEG中，某些分子具有大于 所陳述的分子量，有些分子具有小于所陳述的分子量）。優(yōu)選地，PEG具有約20k到約50k 的分子量。
[0012] 用于修飾蛋白質(zhì)藥物的PEG優(yōu)選為mPEG (單甲氧基醚PEG)，其包括但不限于 mPEG2-NHS (Y 型 mPEGN-羥基琥珀酰亞胺酯）、mPEG2-ALD (Y 型 mPEG 乙醛）、mPEG2-MAL (Y 型mPEG馬來酰亞胺）、mPEG-SCM (mPEG乙酸NHS酯）、mPEG-SC (mPEG琥珀酰亞胺碳酸酯）、 mPEG-SS (mPEG琥珀酰亞胺琥珀酸酯）、mPEG-NHS (mPEG N-羥基琥珀酰亞胺酯）、mPEG-MAL (mPEG 馬來酰亞胺）、mPEG-NH2 (mPEG 胺）、mPEG-ALD (mPEG 丙醛）、mPEG-SPA (mPEG 琥珀 酰亞胺丙酸酸酯）、mPEG-SBA (mPEG琥珀酰亞胺丁酸酯）、mPEG-BTC (mPEG苯并三唑碳酸 醋）等。
[0013] 術(shù)語"修飾位點(diǎn)"指蛋白質(zhì)表面上與聚乙二醇通過共價(jià)鍵連接的官能團(tuán)，其為氨 基，所述氨基選自多肽鏈N末端的α氨基或多肽鏈中賴氨酸殘基的ε氨基，更優(yōu)選的，所 述氨基為多肽鏈中賴氨酸殘基的ε氨基。
[0014] 聚乙二醇或其衍生物對蛋白質(zhì)藥物的修飾是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，因蛋白質(zhì)藥物上 可能存在多個修飾位點(diǎn)，所得產(chǎn)物通常為單修飾產(chǎn)物和多修飾產(chǎn)物的混合物，基于分子量 的差異，單修飾產(chǎn)物可以以比較純的方式被分離。
[0015] 術(shù)語"位置異構(gòu)體"指，在聚乙二醇對蛋白質(zhì)進(jìn)行單修飾的過程中，與蛋白質(zhì)上的 多個可修飾位點(diǎn)進(jìn)行反應(yīng)而得到的不同單修飾產(chǎn)物，這些單修飾產(chǎn)物的差別在于修飾位點(diǎn) 不同?；诓煌恢卯悩?gòu)體的電荷性質(zhì)等性質(zhì)的差異，這些位置異構(gòu)體可以以比較純的方 式被分離。例如，CN1711109A中所公開的聚乙二醇干擾素 a -2a的位置異構(gòu)體及分離方法。
[0016] 術(shù)語"均一化修飾的多肽片段"與"均一化修飾片段"可交互使用，指在所述多肽片 段中，修飾位點(diǎn)是實(shí)質(zhì)上相同的。實(shí)質(zhì)上相同指至少80%相同，例如80%、81%、82%、83%、84%、 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同。優(yōu)選 的，實(shí)質(zhì)上相同指至少 90%相同，例如 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100% 相同。均一化程度可通過HPLC測定。
[0017] 本發(fā)明的均一化修飾的多肽片段是以基本純的位置異構(gòu)體為原料，通過多種方法 進(jìn)行制備。一個典型的方法是：通過陽離子交換HPLC法將各修飾位置異構(gòu)體分離，采用蛋 白內(nèi)切酶對各修飾位置異構(gòu)體充分水解后分離獲得。多肽片段不宜過長或過短，過長的多 肽片段會增加 Edman降解的成本，而過短的多肽片段則可能無法對應(yīng)至唯一的蛋白質(zhì)藥物 序列。
[0018] 本測定方法操作簡單，適應(yīng)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可廣泛用于聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)藥 物中氨基修飾位點(diǎn)的確證，從而充分滿足質(zhì)量控制的要求。
[0019] 本文可交互地使用術(shù)語"蛋白質(zhì)藥物"、"蛋白質(zhì)"和"多肽"。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1 :聚乙二醇干擾素 a -2a的離子交換高效液相圖。
[0021] 圖2 :聚乙二醇干擾素 a -2a在分離前和分離后的陽離子交換HPLC圖。其中曲線 "1"是分離前的HPLC圖，曲線"2"、"3"、"4"和"5"分別對應(yīng)于分離后各位置異構(gòu)體的!^〇 圖。
[0022] 圖3 :位置異構(gòu)體1酶切后的SE-HPLC圖。
[0023] 圖4 :各均一化位置異構(gòu)體片段的SDS-PAGE分析。其中條帶"M"是PEG的標(biāo)準(zhǔn) 分子量、條帶"PI "是未酶切的PEG干擾素 a-2a、條帶"PEG"是44kDa的mPEG2-NHS、條帶 "1"、"2"、"3"和"4"分別對應(yīng)于各位置異構(gòu)體的酶切片段。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，然而，本發(fā)明中這些和其他實(shí) 施例僅用于闡明并不限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，對本發(fā)明技術(shù)特征所 作的等同替換，或相應(yīng)的改進(jìn)，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0025] 實(shí)施例1修飾物均一度檢測 (1)材料 44kDa的mPEG2-NHS修飾的干擾素 a -2a (簡稱修飾物） 其中干擾素 a_2a 可參照 Pestka, Arch. Biochem. Biophys. 221，1 (1993)的方法 進(jìn)行制備，干擾素 a -2a的氨基酸序列如下： CDLPQTHSLG SRRTLMLLAQ MRKISLFSCL KDRHDFGFPQ EEFGNQFQKA ETIPVLHEMI QQIFNLFSTK DSSAAWDETL LDKFYTELYQ QLNDLEACVI QGVGVTETPL MKEDSILAVR KYFQRITLYL KEKKYSPCAff EVVRAEIMRS FSLSTNLQES LRSKE 其中44kDa的mPEG2-NHS由北京鍵凱科技有限公司提供，結(jié)構(gòu)式如下所示：

【權(quán)利要求】
1. 一種聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)藥物的修飾位點(diǎn)的測定方法，其中修飾位點(diǎn)為氨基，所 述方法包括以下步驟： (1) 以聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)藥物的位置異構(gòu)體為原料，制備均一化修飾的多肽片段， 其中所述多肽片段與聚乙二醇共價(jià)連接，且具有3-50個氨基酸殘基； (2) 采用Edman降解法測定步驟（1)中的均一化修飾的多肽片段的氨基酸序列； (3) 將步驟（2)中的氨基酸序列對應(yīng)至相應(yīng)的蛋白質(zhì)藥物序列，若步驟（2)中出現(xiàn)兩個 或多個無法正常測出的氨基酸，那么除半胱氨酸外的那個氨基酸所對應(yīng)的位點(diǎn)即為修飾位 點(diǎn)；若步驟（2)中僅出現(xiàn)一個無法正常測出的氨基酸，那么該氨基酸所對應(yīng)的位點(diǎn)即為修 飾位點(diǎn)。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟（1)中的多肽片段具有3-30個氨基酸殘基。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中步驟（1)中的多肽片段具有3-20個氨基酸殘基。
4. 權(quán)利要求3的方法，其中步驟（1)中的多肽片段具有4-15個氨基酸殘基。
5. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)藥物選自聚乙二醇腺苷 脫氨酶、聚乙二醇天門冬酰胺酶、聚乙二醇干擾素、聚乙二醇人粒細(xì)胞集落刺激因子、聚乙 二醇人GH受體拮抗劑、聚乙二醇促紅細(xì)胞生成素、聚乙二醇尿酸酶，聚乙二醇降纖酶、聚乙 二醇蛇毒凝血酶、聚乙二醇抑肽酶、聚乙二醇超氧化物歧化酶或聚乙二醇凝血因子VIII。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)藥物是聚乙二醇干擾素。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)藥物是聚乙二醇干擾素 a-2a或聚 乙二醇干擾素 a-2b。
8. 權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中用于修飾蛋白質(zhì)藥物的聚乙二醇是直鏈或分枝 的聚乙二醇，其分子量為約5k到約60k道爾頓。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中所述聚乙二醇的分子量為約20k到約50k道爾頓。
10. 權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法在聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)藥物中氨基修飾位點(diǎn)的確 證中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/50GK104120163SQ201310154747
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月28日
【發(fā)明者】趙偉, 李國柱, 張喜全, 曹宇虹, 畢海, 秦宇, 蘇賢德, 蔣丹 申請人:正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司