專利名稱：一種觀察血管干細(xì)胞附壁的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞觀察方法，具體涉及一種觀察血管干細(xì)胞附壁的方法。
背景技術(shù)：
明確血管干細(xì)胞、內(nèi)皮前體細(xì)胞參與血管生理性修復(fù)和病理性結(jié)構(gòu)重構(gòu)及其機(jī)制和影響因素對(duì)理解心血管疾病發(fā)生發(fā)展和開辟新治療途徑有重要意義。血管干細(xì)胞的概念雖已確立，但因其發(fā)育分化的時(shí)空依賴性，目前未有明確、具體的表征方法。多種標(biāo)志物及功能特征被共用于表征血管干細(xì)胞，也就是說，基于不同時(shí)空背景或途徑分離到多種有成血管潛力的細(xì)胞都可能是候選血管干細(xì)胞，如Flk+細(xì)胞、Flk_細(xì)胞、⑶34+KDR+細(xì)胞、Flk+⑶31+CD34+細(xì)胞等。明確一種血管干細(xì)胞首先需證明其參與血管生理性修復(fù)或病理性結(jié)構(gòu)重構(gòu)，要具備這些功能，其歸巢、黏附于血管壁是最基本的步驟和觀察指標(biāo)。中動(dòng)脈病變與致命性心血管疾病關(guān)系最密切，如冠狀動(dòng)脈病變與冠心病的關(guān)系，腦中動(dòng)脈病變與腦中風(fēng)的關(guān)系等。國內(nèi)外目前觀察血管干細(xì)胞、內(nèi)皮前體細(xì)胞歸巢、黏附一般用較深部位的大動(dòng)脈，如大鼠、小鼠和兔的勁總動(dòng)脈、股動(dòng)脈或微血管(包括新生血管)，迄今未報(bào)道在中動(dòng)脈的觀察?，F(xiàn)有一些體內(nèi)觀察方法，如局部植入或靜脈輸入熒光標(biāo)記(如GFP、CM-Dil等標(biāo)記)的細(xì)胞，于不同時(shí)間段，取待測(cè)靶血管進(jìn)行觀察；或植入/輸入其他方式標(biāo)記(如BrdU)的細(xì)胞，于不同時(shí)間段，取血管標(biāo)本，用組織化學(xué)、熒光免疫組織化學(xué)等方法觀察、評(píng)價(jià)。這兩種方法共同缺點(diǎn)有:①不能實(shí)時(shí)觀察，觀察時(shí)間點(diǎn)的選擇有盲目性和隨意性，觀察點(diǎn)的取舍有隨機(jī)性，從而影響評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性了解細(xì)胞歸巢、黏附動(dòng)態(tài)變化、影響因素難度大，需投入較大的時(shí)間和成本。用超順 磁性氧化鐵(造影劑)標(biāo)記細(xì)胞磁共振成像可在體原位實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞附壁，但超順磁性氧化鐵有細(xì)胞毒性，如何解讀觀察結(jié)果仍存在爭(zhēng)議。目前尚無觀察血管干細(xì)胞、內(nèi)皮前體細(xì)胞附壁的體外方法或模型。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種血管干細(xì)胞附壁的方法，該方法能夠簡(jiǎn)便、直觀、有效的觀察血管干細(xì)胞附壁情況。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):一種觀察血管干細(xì)胞附壁的方法，包括以下步驟:I)取待觀察的血管干細(xì)胞，用熒光染料進(jìn)行標(biāo)記后，備用；2)在恒溫恒壓條件下，對(duì)暴露出中動(dòng)脈的新鮮離體耳灌流5 lOmin，灌流液自耳中動(dòng)脈流入，由耳靜脈流出；其中，所述暴露出的中動(dòng)脈為完整的中動(dòng)脈或損傷的中動(dòng)脈；3)將步驟I)得到的經(jīng)熒光染料標(biāo)記的血管干細(xì)胞加入灌流液中，在恒溫恒壓條件下，避光循環(huán)灌流I 4h后，經(jīng)洗脫、固定后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。所述的血管干細(xì)胞為內(nèi)皮前體細(xì)胞，內(nèi)皮前體細(xì)胞粘附于損傷的中動(dòng)脈的受損部位。在所述損傷的中動(dòng)脈的受損部位觀察到熒光，在完整的中動(dòng)脈未觀察到熒光。所述損傷的中動(dòng)脈是采用球囊內(nèi)皮損傷法、金屬絲內(nèi)皮損傷法、夾捏法或凍傷法將完整的中動(dòng)脈損傷后得到的。所述的灌流液為任-洛液，灌流速度為1.0 2.0mL/min。所述加入灌流液中的經(jīng)熒光染料標(biāo)記的血管干細(xì)胞的量為IX IO6個(gè)細(xì)胞/50mL
灌流液。所述的恒溫恒壓條件是在37 °C，60cm任-洛液液柱下進(jìn)行。所述的暴露出中動(dòng)脈的新鮮離體耳是將新鮮離體耳中動(dòng)脈區(qū)域的毛發(fā)脫除后得到的。所述的洗脫是采用灌流液灌流5 lOmin，所述的固定是采用質(zhì)量濃度為2 4%多聚甲醒，灌流10 15min。所述的突光顯微鏡米用落射突光顯微鏡。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:本發(fā)明的觀察血管干細(xì)胞附壁的方法，首次利用中動(dòng)脈進(jìn)行血管干細(xì)胞附壁觀察，中動(dòng)脈的病變與致命性心血管疾病的關(guān)系最為密切，觀察損傷的中動(dòng)脈的受損部位，可以發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮受損后啟動(dòng)一系列炎癥反應(yīng)和血管新生，包括內(nèi)皮修復(fù)、血管壁結(jié)構(gòu)重構(gòu)過程，說明血管干細(xì)胞可能參與這些過程。本發(fā)明利用新鮮離體耳的`中動(dòng)脈，采用離體器官恒壓灌流的方法，將熒光染料標(biāo)記的血管干細(xì)胞加入灌流液中，灌流至離體耳的中動(dòng)脈中，用倒置顯微鏡觀察血管干細(xì)胞的附壁情況，本方法易于實(shí)施、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果明確，證明了用離體耳中動(dòng)脈觀察血管干細(xì)胞附壁是可行的。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。本發(fā)明的觀察血管干細(xì)胞附壁的方法，包括以下步驟:I)取待觀察的血管干細(xì)胞，用熒光染料進(jìn)行標(biāo)記后，備用；2)在恒溫恒壓條件下，對(duì)暴露出中動(dòng)脈的新鮮離體耳灌流5 lOmin，灌流液自耳中動(dòng)脈流入，由耳靜脈流出；其中，所述暴露出的中動(dòng)脈為完整的中動(dòng)脈或損傷的中動(dòng)脈；3)將步驟I)得到的經(jīng)熒光染料標(biāo)記的血管干細(xì)胞加入灌流液中，在恒溫恒壓條件下，避光循環(huán)灌流I 4h后，經(jīng)洗脫、固定后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。具體以“觀察自體晚期發(fā)育的內(nèi)皮前體細(xì)胞粘附于內(nèi)皮受損兔耳中動(dòng)脈”為例，本發(fā)明采用日本大耳白兔，兔耳中動(dòng)脈指耳背部外2/3段耳中動(dòng)脈(長度隨兔品系及年齡為4 10cm)。注:還可以選擇其他品系、膚色、的健康狀態(tài)的的兔耳。1、方法I)實(shí)驗(yàn)材料:新鮮離體兔耳，采自日本大耳白兔，雄性，體重2.0 2.2kg，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。2)晚期發(fā)育的內(nèi)皮前體細(xì)胞(OECs)體外擴(kuò)增及鑒定:在戊巴比妥鈉麻醉下，抽取兔的兩股骨的骨髓共6mL，從中分離出超過2 X IO8單個(gè)核細(xì)胞(MNCs)。將MNCs接種于膠原蛋白I包被的培養(yǎng)皿中用內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(EBM-2)及添加劑(包括肝素、抗壞血酸、慶大霉素、兩性霉素B、血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子-1、表皮生長因子等，均為Clonetics公司產(chǎn)品)培養(yǎng)28天，獲得4 5X IO7貼壁細(xì)胞。細(xì)胞呈鵝卵石狀，可攝入低密度脂蛋白，能結(jié)合血凝素，⑶144、caVeolin-l表達(dá)陽性，⑶14、⑶45表達(dá)陰性，產(chǎn)生一氧化氮，具遷移能力，在基質(zhì)Matrigel-Matrix存在時(shí)可形成管狀結(jié)構(gòu)。3)熒光染料標(biāo)記:用CM-Dil標(biāo)記OECs，細(xì)胞在貼壁狀態(tài)下2 U g/mLCM-Dil PBS溶液 37°C孵育 5min，4°C下 15min，PBS 洗兩遍。4)先用任-洛液，在恒溫恒壓條件下，對(duì)經(jīng)預(yù)處理的新鮮離體兔耳中動(dòng)脈灌流5 lOmin，灌流液自兔耳中動(dòng)脈流入，由兔耳靜脈流出；5)離體兔耳灌流法觀察自體OECs附壁:對(duì)離體兔耳行CM-Dil標(biāo)記的自體OECs恒壓灌流，即把I X IO6個(gè)細(xì)胞混懸于50mL任-洛液，用后者在37°C，60cm液柱下循環(huán)灌流兔耳I小時(shí)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3組:①、耳中動(dòng)脈內(nèi)皮完整組②、耳中動(dòng)脈內(nèi)皮受損 組采用球囊內(nèi)皮損傷法、金屬絲內(nèi)皮損傷法、夾捏法或凍傷法將完整的中動(dòng)脈損傷后得到的。③、膠原蛋白I抗體處理組細(xì)胞灌流前先用含小鼠抗牛膠原蛋白I抗體(Sigma公司產(chǎn)品,稀釋100倍)灌流液灌流20min。此后分離耳中動(dòng)脈，4%多聚甲醛固定后制成5 U m厚冷凍切片，直接在落射熒光顯微鏡下觀察，若觀察不到紅色熒光，將切片經(jīng)FITC-標(biāo)記的羊抗小鼠抗體孵育后觀察。2、結(jié)果與分析離體兔耳灌流實(shí)驗(yàn)表明，CM-Dil標(biāo)記的自體OECs恒壓灌流I小時(shí)，熒光顯微鏡下，耳中動(dòng)脈內(nèi)皮受損段可看到極強(qiáng)的紅色熒光，在其他部位未看到熒光，在內(nèi)皮完整耳中動(dòng)脈未看到熒光，在經(jīng)膠原蛋白I抗體處理的耳中動(dòng)脈內(nèi)皮受損段也未看到熒光。耳中動(dòng)脈內(nèi)皮受損段冷凍切片內(nèi)膜層可觀察到紅色熒光，內(nèi)皮完整耳中動(dòng)脈、經(jīng)膠原蛋白I抗體處理的內(nèi)皮受損段耳中動(dòng)脈冷凍切片均未直接觀察到熒光，膠原蛋白I抗體處理的內(nèi)皮受損段耳中動(dòng)脈冷凍切片經(jīng)FITC-標(biāo)記的羊抗小鼠抗體孵育后在內(nèi)膜層可觀察到極強(qiáng)的綠色熒光。從上述結(jié)果可以看出，血管內(nèi)皮受損后啟動(dòng)一系列炎癥反應(yīng)和血管新生(包括內(nèi)皮修復(fù)、血管壁結(jié)構(gòu)重構(gòu))過程。血管干細(xì)胞、內(nèi)皮前體細(xì)胞可能參與這些過程。內(nèi)皮受損同時(shí)使膠原暴露，離體兔耳灌流實(shí)驗(yàn)提示，血管內(nèi)皮受損后，循環(huán)血中的OECs很快歸巢、粘附于受損區(qū)，膠原蛋白I有助于細(xì)胞粘附。循環(huán)血中內(nèi)源性O(shè)ECs數(shù)量極少，因此研究OECs的作用或治療潛力，OECs應(yīng)盡早輸入。本實(shí)施例證明用兔耳中動(dòng)脈觀察熒光標(biāo)記的血管干細(xì)胞、內(nèi)皮前體細(xì)胞附壁是可行的。與有關(guān)的其他觀察方法相比，該發(fā)明不僅易于和便于實(shí)施，而且結(jié)果明確，能解決其他方法不容易解決的問題。
權(quán)利要求
1.一種觀察血管干細(xì)胞附壁的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)取待觀察的血管干細(xì)胞，用熒光染料進(jìn)行標(biāo)記后，備用； 2)在恒溫恒壓條件下，對(duì)暴露出中動(dòng)脈的新鮮離體耳灌流5 lOmin，灌流液自耳中動(dòng)脈流入，由耳靜脈流出；其中，所述暴露出的中動(dòng)脈為完整的中動(dòng)脈或損傷的中動(dòng)脈； 3)將步驟I)得到的經(jīng)熒光染料標(biāo)記的血管干細(xì)胞加入灌流液中，在恒溫恒壓條件下，避光循環(huán)灌流I 4h后，經(jīng)洗脫、固定后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種觀察血管干細(xì)胞附壁的方法，其特征在于，所述的血管干細(xì)胞為內(nèi)皮前體細(xì)胞，內(nèi)皮前體細(xì)胞粘附于損傷的中動(dòng)脈的受損部位。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種觀察血管干細(xì)胞附壁的方法，其特征在于，在所述損傷的中動(dòng)脈的受損部位觀察到熒光，在完整的中動(dòng)脈未觀察到熒光。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種觀察血管干細(xì)胞附壁的方法，其特征在于，所述損傷的中動(dòng)脈是采用球囊內(nèi)皮損傷法、金屬絲內(nèi)皮損傷法、夾捏法或凍傷法將完整的中動(dòng)脈損傷后得到的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種觀察血管干細(xì)胞附壁的方法，其特征在于，所述的灌流液為任-洛液，灌流速度為1.0 2.0mL/min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種觀察血管干細(xì)胞附壁的方法，其特征在于，所述加入灌流液中的經(jīng)熒光染料標(biāo)記的血管干細(xì)胞的量為I X IO6個(gè)細(xì)胞/50mL灌流液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種觀察血管干細(xì)胞附壁的方法，其特征在于，所述的恒溫恒壓條件是在37 °C，60cm任-洛液液柱下進(jìn)行。`
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種觀察血管干細(xì)胞附壁的方法，其特征在于，所述的暴露出中動(dòng)脈的新鮮離體耳是將新鮮離體耳中動(dòng)脈區(qū)域的毛發(fā)脫除后得到的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種觀察血管干細(xì)胞附壁的方法，其特征在于，所述的洗脫是采用灌流液灌流5 lOmin，所述的固定是采用質(zhì)量濃度為2 4%多聚甲醛，灌流10 15min。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種觀察血管干細(xì)胞附壁的方法，其特征在于，所述的熒光顯微鏡米用落射突光顯微鏡。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種觀察血管干細(xì)胞附壁的方法，包括以下步驟1)取待觀察的血管干細(xì)胞，用熒光染料進(jìn)行標(biāo)記后，備用；2)在恒溫恒壓條件下，對(duì)暴露出中動(dòng)脈的新鮮離體耳灌流5～10min，灌流液自耳中動(dòng)脈流入，由耳靜脈流出；其中，所述暴露出的中動(dòng)脈為完整的中動(dòng)脈或損傷的中動(dòng)脈；3)將步驟1)得到的經(jīng)熒光染料標(biāo)記的血管干細(xì)胞加入灌流液中，在恒溫恒壓條件下，避光循環(huán)灌流1～4h后，經(jīng)洗脫、固定后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。本發(fā)明易于實(shí)施、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果明確，證明了用離體耳中動(dòng)脈觀察熒光標(biāo)記的血管干細(xì)胞附壁是可行的。
文檔編號(hào)G01N1/28GK103245648SQ201310156400
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月28日
發(fā)明者劉書勤, 臧偉進(jìn) 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)