納米免疫磁球、其制備方法及用途
【專利摘要】本發(fā)明提供一種納米免疫磁球、其制備方法及用途，納米免疫磁球的平均粒徑為100-1000nm。其制備方法包括：納米磁球的活化；納米磁球的偶聯(lián)：將用于特異性捕獲和分離抗原的抗體經(jīng)稀釋后加入離心管中，抗體和活化后的納米磁球發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，使抗體偶聯(lián)到活化后的納米磁球表面，得到納米免疫磁球粗品；其中，偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)條件為：偶聯(lián)溫度為4～37℃，偶聯(lián)時間為2～12小時；抗體的濃度為10～200μg/mL；保存。納米免疫磁球的粒徑遠小于常規(guī)的免疫磁球，是一種分散效果好、穩(wěn)定性強的免疫磁球，從而能夠方便、快捷、高效的分離出樣品中的沙門氏菌。
【專利說明】納米免疫磁球、其制備方法及用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種納米免疫磁球、其制備方法及用途。

【背景技術(shù)】
[0002]沙門氏菌是一種革蘭氏陰性短桿菌，不形成芽胞，是引起人類食物中毒的主要病原菌之一，臨床上可表現(xiàn)為胃腸炎、腸熱病、菌血癥綜合癥或局灶性疾病。據(jù)統(tǒng)計，在世界各國的種類細菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。我國內(nèi)陸地區(qū)也以沙門氏菌為首位。
[0003]目前，我國絕大多數(shù)檢測機構(gòu)對沙門氏菌檢測的常規(guī)方法為分離培養(yǎng)方法，必須進行增菌培養(yǎng)以提高檢出率，因而具有檢測周期長、程序復(fù)雜、所需試劑繁多、檢出率較低等缺點，從而遠遠不能滿足現(xiàn)代檢測要求。
[0004]免疫磁球是一種新型的功能材料，免疫磁球表面偶聯(lián)有抗體，在反應(yīng)體系中，通過抗體與反應(yīng)介質(zhì)中特異性抗原結(jié)合形成抗原一抗體復(fù)合物，此復(fù)合物在磁場的作用下定向移動，從而達到分離或檢測抗原的目的。通過免疫磁球分離抗原，具有樣品分離速度快、特異性強、操作簡單、不需要昂貴的儀器設(shè)備等特點，而且不影響被分離細胞的生物學(xué)性狀和功能，目前已在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的許多方面發(fā)揮了重要作用。
[0005]但是，現(xiàn)有的沙門氏菌免疫磁球分離技術(shù)中，所使用的免疫磁球產(chǎn)品粒徑較大，一般都在I μ m以上，因此，在分離微生物過程中，具有免疫磁球溶液穩(wěn)定性差、容易沉淀聚集、不利于對分離目標物的有效捕獲、有可能對被分離的微生物造成損傷、對微生物的檢測靈敏度低等缺陷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明提供一種納米免疫磁球、其制備方法及用途，納米免疫磁球的粒徑遠小于常規(guī)的免疫磁球，是一種分散效果好、穩(wěn)定性強的免疫磁球，從而能夠方便、快捷、高效的分離出樣品中的沙門氏菌。
[0007]本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0008]本發(fā)明第一目的為提供一種納米免疫磁球,所述納米免疫磁球的平均粒徑為100-1000nm。
[0009]優(yōu)選的，所述納米免疫磁球的平均粒徑為180_450nm。
[0010]本發(fā)明第二目的為提供一種納米免疫磁球的制備方法，包括以下步驟:
[0011]SI,納米磁球的活化:
[0012]取未活化的納米磁球原料到離心管中，用磷酸鹽吐溫緩沖液PBST洗滌后，磁分離移除上清液；
[0013]以所述PBST為溶劑，分別配制I?10mg/mL的EDC溶液和I?10mg/mL的NHS溶液；向離心管中加入配制的EDC溶液和NHS溶液，在振蕩器上振蕩活化后，將離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附后，磁分離移除上清液；其中，EDC溶液和NHS溶液所使用的溶劑PBST為:10mM磷酸根濃度、pH為6.0?6.4、含有0.05%聚氧乙烯去水山梨醇單月桂酸酯Tween-20的緩沖液。1mM含義為10mmol/L。
[0014]向離心管中加入所述PBST，用所述PBST洗滌納米磁球后，磁分離移除上清液；使用PBS重懸磁球，得到活化后的納米磁球；
[0015]S2，納米磁球的偶聯(lián):
[0016]將用于特異性捕獲和分離抗原的抗體經(jīng)稀釋后加入離心管中，抗體和活化后的納米磁球發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，使抗體偶聯(lián)到活化后的納米磁球表面，得到納米免疫磁球粗品；其中，偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)條件為:偶聯(lián)溫度為4?37°C，偶聯(lián)時間為2?12小時；抗體的濃度為
10?200 μ g/mL ；
[0017]S3，將經(jīng)S2處理后的離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附后，磁分離移除上清液；使用所述PBST洗滌后，加入質(zhì)量分數(shù)為I?5% BSA封閉磁球；其中，封閉磁球的溫度為4?37°C ;封閉磁球的時間為I?12小時；
[0018]S4，將經(jīng)S3處理后的離心管放置到磁分離架上，磁分離移除上清液后PBS洗滌；
[0019]S5，保存:
[0020]將經(jīng)S4處理后的納米免疫磁球保存在含有I?10%的甘油、0.1?I %酪蛋白、10?20%血清和0.1 %疊氮鈉的溶液中。
[0021]優(yōu)選的，SI中，磷酸鹽吐溫緩沖液PBST為10mM、pH為6.0?6.4、含有0.05%Tween-20的緩沖液。
[0022]優(yōu)選的，SI中，所述EDC溶液濃度為I?10mg/ml ;所述NHS溶液濃度為I?1mg/ml ο
[0023]優(yōu)選的，SI中，所述在振蕩器上振蕩活化的條件為:22?25°C條件下震蕩活化30?60分鐘。
[0024]優(yōu)選的，SI中，所述PBS的pH = 7.0?7.4。
[0025]本發(fā)明第三目的為提供納米免疫磁球的用途，所述的納米免疫磁球用于富集沙門氏國。
[0026]實驗結(jié)果證明，本發(fā)明制備得到的納米免疫磁球?qū)ι抽T氏菌具有特異性和靈敏性。
[0027]本發(fā)明的有益效果如下:
[0028]本發(fā)明提供一種納米免疫磁球、其制備方法及用途，納米免疫磁球的粒徑遠小于常規(guī)的免疫磁球，是一種分散效果好、穩(wěn)定性強的免疫磁球，從而能夠方便、快捷、高效的分離出樣品中的沙門氏菌。

【具體實施方式】
[0029]納米免疫磁球制備實施例一
[0030]制備方法:
[0031 ] SI,納米磁球的活化:
[0032]取未活化的納米磁球原料到離心管中，用30 μ L、pH為6.0、濃度為10mM、含有0.05% Tween-20的磷酸鹽吐溫緩沖液PBST洗滌3次后，磁分離移除上清液；其中，本發(fā)明中，Tween-20含義為吐溫20。
[0033]以PBST為溶劑，分別配制lmg/mL的EDC溶液15 μ L、以及，10mg/mL的NHS溶液15 μ L ;向離心管中加入配制的EDC溶液和NHS溶液，22°C條件下在振蕩器上震蕩活化60分鐘，將離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附后，磁分離移除上清液；
[0034]向離心管中加入PBST，用30 μ L PBST洗滌納米磁球3次后，磁分離移除上清液；使用PH = 7.4的PBS重懸磁球，得到活化后的納米磁球；
[0035]S2，納米磁球的偶聯(lián):
[0036]將用于特異性捕獲和分離抗原的抗體經(jīng)稀釋后加入離心管中，抗體和活化后的納米磁球發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，使抗體偶聯(lián)到活化后的納米磁球表面，得到納米免疫磁球粗品；其中，偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)條件為:偶聯(lián)溫度為37°C,偶聯(lián)時間為12小時；抗體的濃度為200 μ g/mL ；
[0037]S3，將經(jīng)S2處理后的離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附后，磁分離移除上清液；使用PBST洗滌3次后，加入300μ L5%的BSA封閉磁球；其中，封閉磁球的溫度為37°C ;封閉磁球的時間為12小時；其中，BSA為牛血清白蛋白。
[0038]S4，將經(jīng)S3處理后的離心管放置到磁分離架上，PBS洗滌后磁分離移除上清液；
[0039]S5，保存:
[0040]將經(jīng)S4處理后的納米免疫磁球保存在含有10%的甘油、I %酪蛋白、10%血清和0.1 %疊氮鈉的溶液中。
[0041]納米免疫磁球制備實施例二
[0042]制備方法:
[0043]SI,納米磁球的活化:
[0044]取未活化的納米磁球原料到離心管中，用100 μ L、pH為6.4、濃度為10mM、含有0.05% Tween-20的磷酸鹽吐溫緩沖液PBST洗滌3次后，磁分離移除上清液；
[0045]以PBST 為溶劑，分別配制 10mg/mL、pH = 6.0 的 EDC 溶液 15 μ L、以及，lmg/mL、pH為6.4的NHS溶液15 μ L ;向離心管中加入配制的EDC溶液和NHS溶液，25°C條件下在振蕩器上震蕩活化30分鐘，將離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附后，磁分離移除上清液；
[0046]向離心管中加入PBST，用30 μ L PBST洗滌納米磁球3次后，磁分離移除上清液；使用PH = 7.0的PBS重懸磁球，得到活化后的納米磁球；
[0047]S2，納米磁球的偶聯(lián):
[0048]將用于特異性捕獲和分離抗原的抗體經(jīng)稀釋后加入離心管中，抗體和活化后的納米磁球發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，使抗體偶聯(lián)到活化后的納米磁球表面，得到納米免疫磁球粗品；其中，偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)條件為:偶聯(lián)溫度為4°C,偶聯(lián)時間為2小時；抗體的濃度為10 μ g/mL ；
[0049]S3，將經(jīng)S2處理后的離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附后，磁分離移除上清液；使用PBST洗滌3次后，加入300 μ L3%的BSA封閉磁球；其中，封閉磁球的溫度為4°C ;封閉磁球的時間為I小時；
[0050]S4，將經(jīng)S3處理后的離心管放置到磁分離架上，PBS洗滌后磁分離移除上清液；
[0051]S5，保存:
[0052]將經(jīng)S4處理后的納米免疫磁球保存在含有I %的甘油、0.1 %酪蛋白、20%血清和0.1 %疊氮鈉的溶液中。
[0053]納米免疫磁球制備實施例三
[0054]制備方法:
[0055]SI,納米磁球的活化:
[0056]取未活化的納米磁球原料到離心管中，用60 μ L、pH為6.2、濃度為10mM、含有0.05% Tween-20的磷酸鹽吐溫緩沖液PBST洗滌3次后，磁分離移除上清液；
[0057]以PBST 為溶劑，分別配制 8mg/mL、pH = 6.2 的 EDC 溶液 15 μ L、以及，7mg/mL、pH為6.1的NHS溶液15 μ L ;向離心管中加入配制的EDC溶液和NHS溶液，23°C條件下在振蕩器上震蕩活化45分鐘，將離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附后，磁分離移除上清液；
[0058]向離心管中加入PBST，用30 μ L PBST洗滌納米磁球3次后，磁分離移除上清液；使用PH = 7.3的PBS重懸磁球，得到活化后的納米磁球；
[0059]S2，納米磁球的偶聯(lián):
[0060]將用于特異性捕獲和分離抗原的抗體經(jīng)稀釋后加入離心管中，抗體和活化后的納米磁球發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，使抗體偶聯(lián)到活化后的納米磁球表面，得到納米免疫磁球粗品；其中，偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)條件為:偶聯(lián)溫度為21°C,偶聯(lián)時間為10小時；抗體的濃度為ΙΟΟμ g/mL ；
[0061]S3，將經(jīng)S2處理后的離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附后，磁分離移除上清液；使用PBST洗滌3次后，加入300 μ L3%的BSA封閉磁球；其中，封閉磁球的溫度為25°C ;封閉磁球的時間為5小時；
[0062]S4，將經(jīng)S3處理后的離心管放置到磁分離架上，PBS洗滌后磁分離移除上清液；
[0063]S5，保存:
[0064]將經(jīng)S4處理后的納米免疫磁球保存在含有8%的甘油、0.7%酪蛋白、15%血清和0.1 %疊氮鈉的溶液中。
[0065]納米免疫磁球制備實施例四
[0066]制備方法:
[0067]SI,納米磁球的活化:
[0068]取未活化的納米磁球原料到離心管中，用80 μ L、pH為6.3、濃度為10mM、含有
0.05% Tween-20的磷酸鹽吐溫緩沖液PBST洗滌3次后，磁分離移除上清液；
[0069]以PBST 為溶劑，分別配制 4mg/mL、pH = 6.3 的 EDC 溶液 15 μ L、以及，9mg/mL、pH為6.1的NHS溶液15 μ L ;向離心管中加入配制的EDC溶液和NHS溶液，24°C條件下在振蕩器上震蕩活化40分鐘，將離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附后，磁分離移除上清液；
[0070]向離心管中加入PBST，用30 μ L PBST洗滌納米磁球3次后，磁分離移除上清液；使用PH = 7.2的PBS重懸磁球，得到活化后的納米磁球；
[0071]S2，納米磁球的偶聯(lián):
[0072]將用于特異性捕獲和分離抗原的抗體經(jīng)稀釋后加入離心管中，抗體和活化后的納米磁球發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，使抗體偶聯(lián)到活化后的納米磁球表面，得到納米免疫磁球粗品；其中，偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)條件為:偶聯(lián)溫度為12°C,偶聯(lián)時間為9小時；抗體的濃度為50 μ g/mL ；
[0073]S3，將經(jīng)S2處理后的離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附后，磁分離移除上清液；使用PBST洗滌3次后，加入300 μ L4%的BSA封閉磁球；其中，封閉磁球的溫度為16°C ;封閉磁球的時間為8小時；
[0074]S4，將經(jīng)S3處理后的離心管放置到磁分離架上，PBS洗滌后磁分離移除上清液；
[0075]S5，保存:
[0076]將經(jīng)S4處理后的納米免疫磁球保存在含有6%的甘油、0.2%酪蛋白、17%血清和
0.1 %疊氮鈉的溶液中。
[0077]納米免疫磁球制備實施例五
[0078]制備方法:
[0079]SI,納米磁球的活化:
[0080]取未活化的納米磁球原料到離心管中，用60 μ L、pH為6.3、濃度為10mM、含有
0.05% Tween-20的磷酸鹽吐溫緩沖液PBST洗滌3次后，磁分離移除上清液；
[0081]以PBST 為溶劑，分別配制 6mg/mL、pH = 6.2 的 EDC 溶液 15 μ L、以及，8mg/mL、pH為6.2的NHS溶液15 μ L ;向離心管中加入配制的EDC溶液和NHS溶液，24°C條件下在振蕩器上震蕩活化50分鐘，將離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附后，磁分離移除上清液；
[0082]向離心管中加入PBST，用30 μ L PBST洗滌納米磁球3次后，磁分離移除上清液；使用PH = 7.3的PBS重懸磁球，得到活化后的納米磁球；
[0083]S2，納米磁球的偶聯(lián):
[0084]將用于特異性捕獲和分離抗原的抗體經(jīng)稀釋后加入離心管中，抗體和活化后的納米磁球發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，使抗體偶聯(lián)到活化后的納米磁球表面，得到納米免疫磁球粗品；其中，偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)條件為:偶聯(lián)溫度為26 °C,偶聯(lián)時間為8小時；抗體的濃度為150μ g/mL ；
[0085]S3，將經(jīng)S2處理后的離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附后，磁分離移除上清液；使用PBST洗滌3次后，加入300 μ L4%的BSA封閉磁球；其中，封閉磁球的溫度為32°C ;封閉磁球的時間為6小時；
[0086]S4，將經(jīng)S3處理后的離心管放置到磁分離架上，PBS洗滌后磁分離移除上清液；
[0087]S5，保存:
[0088]將經(jīng)S4處理后的納米免疫磁球保存在含有9%的甘油、0.3%酪蛋白、16%血清和
0.1 %疊氮鈉的溶液中。
[0089]納米免疫磁球制備實施例六
[0090]制備方法:
[0091 ] SI,納米磁球的活化:
[0092]取未活化的納米磁球原料到離心管中，用80 μ L、pH為6.3、濃度為10mM、含有
0.05% Tween-20的磷酸鹽吐溫緩沖液PBST洗滌3次后，磁分離移除上清液；
[0093]以PBST 為溶劑，分別配制 3mg/mL、pH = 6.2 的 EDC 溶液 15 μ L、以及，9mg/mL、pH為6.3的NHS溶液15 μ L ;向離心管中加入配制的EDC溶液和NHS溶液，23°C條件下在振蕩器上震蕩活化50分鐘，將離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附后，磁分離移除上清液；
[0094]向離心管中加入PBST，用30 μ L PBST洗滌納米磁球3次后，磁分離移除上清液；使用PH = 7.3的PBS重懸磁球，得到活化后的納米磁球；
[0095]S2，納米磁球的偶聯(lián):
[0096]將用于特異性捕獲和分離抗原的抗體經(jīng)稀釋后加入離心管中，抗體和活化后的納米磁球發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，使抗體偶聯(lián)到活化后的納米磁球表面，得到納米免疫磁球粗品；其中，偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)條件為:偶聯(lián)溫度為19°C,偶聯(lián)時間為12小時；抗體的濃度為170 μ g/mL ；
[0097]S3，將經(jīng)S2處理后的離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附后，磁分離移除上清液；使用PBST洗滌3次后，加入300 μ L3%的BSA封閉磁球；其中，封閉磁球的溫度為21°C ;封閉磁球的時間為7小時；
[0098]S4，將經(jīng)S3處理后的離心管放置到磁分離架上，PBS洗滌后磁分離移除上清液；
[0099]S5，保存:
[0100]將經(jīng)S4處理后的納米免疫磁球保存在含有5%的甘油、0.8%酪蛋白、13%血清和
0.1 %疊氮鈉的溶液中。
[0101]試驗例I
[0102]本試驗例用于考察納米免疫磁球制備實施例1-6制備得到的納米免疫磁球是否偶聯(lián)上抗體。
[0103]抗體均選用商品化羊抗沙門氏菌多克隆抗體、未活化的納米磁球原料的粒徑均選定為180nm,分別對納米免疫磁球制備實施例1_6制備得到的樣品1_6進行對目標菌的捕獲試驗，試驗條件為:向編號為1、2、3、4、5、6的離心管中分別加入ImL的細菌培養(yǎng)液，然后分別向離心管1、離心管2、離心管3、離心管4、離心管5和離心管6中加入制備得到的納米免疫磁球樣品1、樣品2、樣品3、樣品4、樣品5和樣品6,置25°C搖床中孵育0.5小時后,將離心管放置到磁分離架上，PBS洗滌后磁分離移除上清液；最后，每個離心管用ImL PBS重懸磁珠后，灌營養(yǎng)瓊脂平皿，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后觀察。敏感性試驗結(jié)果見表1。
[0104]表1

【權(quán)利要求】
1.一種納米免疫磁球,其特征在于,所述納米免疫磁球的平均粒徑為100-1000nm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米免疫磁球，其特征在于，所述納米免疫磁球的平均粒徑為 180_450nm。
3.—種權(quán)利要求1-2任一項所述的納米免疫磁球的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: SI，納米磁球的活化: 取未活化的納米磁球原料到離心管中，用磷酸鹽吐溫緩沖液PBST洗滌后，磁分離移除上清液； 以所述PBST為溶劑，分別配制I?10mg/mL的EDC溶液和I?10mg/mL的NHS溶液；向離心管中加入配制的EDC溶液和NHS溶液，在振蕩器上振蕩活化后，將離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附后，磁分離移除上清液； 向離心管中加入所述PBST，用所述PBST洗滌納米磁球后，磁分離移除上清液；使用PBS重懸磁球，得到活化后的納米磁球； S2，納米磁球的偶聯(lián): 將用于特異性捕獲和分離抗原的抗體經(jīng)稀釋后加入離心管中，抗體和活化后的納米磁球發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，使抗體偶聯(lián)到活化后的納米磁球表面，得到納米免疫磁球粗品；其中，偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)條件為:偶聯(lián)溫度為4?37°C，偶聯(lián)時間為2?12小時；抗體的濃度為10?200 μ g/mL ； S3，將經(jīng)S2處理后的離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附后，磁分離移除上清液；使用所述PBST洗滌后，加入質(zhì)量分數(shù)為I?5% BSA封閉磁球；其中，封閉磁球的溫度為4?37°C ;封閉磁球的時間為I?12小時； S4，將經(jīng)S3處理后的離心管放置到磁分離架上，磁分離移除上清液后PBS洗滌； S5，保存: 將經(jīng)S4處理后的納米免疫磁球保存在含有I?10%的甘油、0.1?1%酪蛋白、10?20%血清和0.1 %疊氮鈉的溶液中。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的納米免疫磁球的制備方法，其特征在于，SI中，磷酸鹽吐溫緩沖液PBST為10mM、pH為6.0?6.4、含有0.05% Tween-20的緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的納米免疫磁球的制備方法，其特征在于，SI中，所述EDC溶液濃度為I?10mg/ml ;所述NHS溶液濃度為I?10mg/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的納米免疫磁球的制備方法，其特征在于，SI中，所述在振蕩器上振蕩活化的條件為:22?25°C條件下震蕩活化30?60分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的納米免疫磁球的制備方法，其特征在于，SI中，所述PBS的pH=7.0 ?7.4。
8.一種納米免疫磁球的用途，其特征在于，權(quán)利要求1-2任一項所述的納米免疫磁球用于富集沙門氏菌。
【文檔編號】G01N33/569GK104133065SQ201310157681
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2013年5月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月2日
【發(fā)明者】鄧奕, 杜美紅, 許迪莘 申請人:北京市科學(xué)器材公司