利用加熱解決酶抑制法檢測(cè)韭菜和蒜黃中農(nóng)藥殘留的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用加熱解決酶抑制法檢測(cè)韭菜和蒜黃中農(nóng)藥殘留的方法。該方法的實(shí)施步驟為：(1)制備試劑；(2)制備樣品；(3)對(duì)照組處理；(4)韭菜或蒜黃處理；(5)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算。本發(fā)明通過(guò)在前處理過(guò)程中進(jìn)行加熱的方法，消除了使用酶抑制法檢測(cè)韭菜和蒜黃樣品中有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留產(chǎn)生假陽(yáng)性的影響，具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和成本低的優(yōu)點(diǎn)，更加適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】利用加熱解決酶抑制法檢測(cè)韭菜和蒜黃中農(nóng)藥殘留的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及酶抑制法檢測(cè)蔬菜中農(nóng)藥殘留的【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及利用加熱解決酶 抑制法檢測(cè)韭菜和蒜黃中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留產(chǎn)生假陽(yáng)性的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人們的生活水平不斷提高和經(jīng)濟(jì)全球化日益突顯，21世紀(jì)中國(guó)農(nóng)業(yè)將由數(shù)量 型向質(zhì)量型轉(zhuǎn)變，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的安全生產(chǎn)和質(zhì)量監(jiān)控將更加嚴(yán)格。防止農(nóng)藥殘留對(duì)人體的危 害除了嚴(yán)格禁止高毒、高殘留農(nóng)藥的使用和嚴(yán)格控制農(nóng)藥的用量外，加強(qiáng)對(duì)農(nóng)藥殘留的快 速檢測(cè)也是控制農(nóng)藥使用的有效手段。近些年，隨著農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展和加強(qiáng) 監(jiān)管力度，農(nóng)藥中毒事件已得到有效地控制。常用農(nóng)藥中，對(duì)高等動(dòng)物毒性較大，容易引起 中毒的是殺蟲劑，而在殺蟲劑中引起中毒事件最多的是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥，且這 兩類農(nóng)藥在實(shí)際生產(chǎn)中使用頻率較高，這就對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的快速檢測(cè)提出 了更高的要求。目前，常用的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢測(cè)方法有氣相色譜法、液相色譜 法、薄層色譜法、酶抑制法等。其中，氣相色譜法和液相色譜法定量準(zhǔn)確，靈敏度高，但分析 儀器昂貴，測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，而且需要專業(yè)技術(shù)人員操作，是適用于實(shí)驗(yàn)室分析；薄層色譜法檢 測(cè)方法復(fù)雜，操作難度大；酶抑制法具有準(zhǔn)確性高、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)， 適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，得到了廣泛應(yīng)用。酶抑制法檢測(cè)蔬菜中農(nóng)藥殘留的原理是：碘化硫代丁 酰膽堿（BuTCI)在丁酰膽堿酯酶（BuChE)的作用下，被水解成硫代膽堿和丁酸，硫代膽堿可 與二硫代雙對(duì)基苯甲酸（DTNB)產(chǎn)生顯色，使反應(yīng)液呈黃色，在分光光度計(jì)410nm處有最大 吸收峰，用分光光度計(jì)可測(cè)得酶活性被抑制程度（用抑制率表示）。在一定條件下，有機(jī)磷 和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)丁酰膽堿酯酶有抑制作用，使催化、水解、變色過(guò)程發(fā)生改變，其抑 制率與農(nóng)藥的濃度呈正相關(guān)。利用這一特性，在酶反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中加入底物和顯色劑觀察顏色 的變化或測(cè)定酶與某種特定化合物反應(yīng)的物理化學(xué)信號(hào)變化，可快速評(píng)估出蔬菜中有機(jī)磷 和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留程度。
[0003] 但是，使用酶抑制法檢測(cè)韭菜和蒜黃中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留時(shí)，會(huì)出 現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，干擾檢測(cè)結(jié)果，造成誤判。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的不足，提供一種使用酶抑制法檢測(cè)韭菜和蒜 黃中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的方法，本發(fā)明是在酶抑制法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，以 消除韭菜和蒜黃在酶抑制法檢測(cè)中出現(xiàn)假陽(yáng)性，從而準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)韭菜和蒜黃中有機(jī) 磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留。
[0005] 本發(fā)明解決使用酶抑制法檢測(cè)韭菜和蒜黃中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留時(shí)， 出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。本發(fā)明采用在前處理過(guò)程中加熱的方法消除假陽(yáng)性，從而快速、準(zhǔn)確的檢 測(cè)。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0007] (1)制備試劑：① pH8. 0緩沖液：準(zhǔn)確稱取磷酸氫二鈉（Na2HP04 · 12H20) 33. 92g，磷 酸二氫鈉（NaH2P04 · 2H20)0. 83g，用蒸餾水溶解定容至1000ml，即為pH8. 0 0. lmol/L的磷 酸緩沖液；②酶溶液：根據(jù)丁酰膽堿酯酶（BuChE)的活性情況，用10ml緩沖液溶解，反應(yīng)前 后吸光度差值Λ &控制在大于或等于0. 4 ;③底物液：碘化硫代丁酰膽堿（BuTCI) 100mg，用 l〇ml緩沖液溶解；④顯色劑：二硫代雙對(duì)基苯甲酸（DTNB)60mg，用10ml緩沖液溶解。
[0008] (2)制備樣品：稱取切碎長(zhǎng)度為1. 0-1. 5cm的韭菜或蒜黃2. 0g，放入提取瓶?jī)?nèi)，力口 入20ml緩沖液，振蕩l-2min，倒出提取液，靜置3-5min，取上清液3ml于1支小試管中，在 80°C的恒溫箱或水浴鍋中加熱lmin，冷卻到室溫，待用；
[0009] (3)對(duì)照組處理：于1只提取瓶中加入20ml緩沖液，振蕩l-2min，倒出提取液，靜 置3-5min。于小試管內(nèi)分別加入50ul酶溶液，3ml提取液，50ul顯色劑，在37-38°C的恒溫 箱中放置30min后，再加入50ul底物液，倒入比色皿中，用分光光度計(jì)檢測(cè)在410nm波長(zhǎng)下 反應(yīng)3min后與3min前的吸光度變化值ΔΑ。，記錄數(shù)據(jù)；
[0010] (4)韭菜或蒜黃處理：于步驟（2)中的1只小試管中加入50ul酶溶液，50ul顯色 齊[J，在37-38°C的恒溫箱中放置30min后，再加入50ul底物液，倒入比色皿中，用分光光度計(jì) 檢測(cè)在410nm波長(zhǎng)下反應(yīng)3min后與3min前的吸光度變化值A(chǔ)Ai，記錄數(shù)據(jù)；
[0011] (5)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算： 酶抑制率（％ ) = [(AAqAAJ/AAJXIOO
[0012] 其中，ΛΑ。是對(duì)照組反應(yīng)3min的吸光度變化值，AAi是樣品組反應(yīng)3min的吸光 度變化值；當(dāng)韭菜或蒜黃樣品提取液對(duì)酶的抑制率> 70%時(shí)，表示該樣品中含有某種有機(jī) 磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留。當(dāng)酶的抑制率>70%時(shí)，該樣品需要重復(fù)檢測(cè)2次以上，幾次 重復(fù)檢測(cè)的重現(xiàn)性應(yīng)在80%以上，方可判定該樣品檢測(cè)呈陽(yáng)性。對(duì)陽(yáng)性結(jié)果的樣品，可用其 他方法進(jìn)一步確定具體農(nóng)藥品種及含量。
[0013] 步驟（1)的酶溶液置于-18°C冰箱中保存，緩沖液、底物液、顯色劑置于0-5°C冰箱 中冷藏保存、備用，保存期不超過(guò)兩周。
[0014] 本發(fā)明的效果是，消除了利用酶抑制法檢測(cè)韭菜和蒜黃中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類 農(nóng)藥殘留的假陽(yáng)性影響，是對(duì)酶抑制法檢測(cè)蔬菜中農(nóng)藥殘留的改進(jìn)。經(jīng)過(guò)對(duì)樣品提取液加 熱處理后，假陽(yáng)性現(xiàn)象得以消除。本發(fā)明提高和擴(kuò)展了酶抑制法的適用范圍和準(zhǔn)確度，對(duì)利 用酶抑制法進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)蔬菜中農(nóng)藥殘留具有推廣意義。該發(fā)明可以快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地檢 測(cè)韭菜和蒜黃中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留，并且成本低廉，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。 本發(fā)明的檢測(cè)方法除對(duì)樣品提取液進(jìn)行加熱處理外，其余步驟均與《NY/T 448-2001蔬菜上有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)方法》相同。

【具體實(shí)施方式】 實(shí)施例1
[0015] 加入已知農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的韭菜樣品的檢測(cè)
[0016] (1)制備試劑：① ρΗ8· 0緩沖液：準(zhǔn)確稱取磷酸氫二鈉（Na2HP04 · 12H20) 33. 92g，磷 酸二氫鈉（NaH2P04 · 2H20)0. 83g，用蒸餾水溶解定容至1000ml，即為pH8. 0 0. lmol/L的磷 酸緩沖液；②酶溶液：根據(jù)丁酰膽堿酯酶的活性情況，用l〇ml緩沖液溶解，反應(yīng)前后吸光度 差值Λ A控制在大于或等于0. 4 ;③底物液：碘化硫代丁酰膽堿（BuTCI) 100mg，用10ml緩沖 液溶解；④顯色劑：二硫代雙對(duì)基苯甲酸（DTN甲酸（DTNB)60mg，用10ml緩沖液溶解。
[0017] (2)制備樣品：稱取2. 0g切碎長(zhǎng)度為1. 0-1. 5cm的韭菜7份，分別放入7個(gè)提取 瓶?jī)?nèi)，添加不同濃度的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液（已知濃度l〇〇ug/ml的甲胺磷、氧化樂(lè)果、克百威、涕 滅威4種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，選取1中農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入5ul、10ul、20ul、30ul、40ul、50ul、 60ul到步驟（2)的7個(gè)提取瓶中。），靜置20min，加入20ml緩沖液，振蕩l-2min，倒出提 取液，靜置3-5min，分別取上清液3ml于7支小試管中，在80°C的恒溫箱或水浴鍋中加熱 lmin，冷卻到室溫，待用；
[0018] (3)對(duì)照組處理：于1只提取瓶中加入20ml緩沖液，振蕩l-2min，倒出提取液，靜 置3-5min。于1支小試管內(nèi)分別加入50ul酶溶液，3ml提取液，50ul顯色劑，在37-38°C的 恒溫箱中放置30min后，再加入50ul底物液，倒入比色皿中，用分光光度計(jì)檢測(cè)在410nm波 長(zhǎng)下反應(yīng)3min后與3min前的吸光度變化值ΔΑ。。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)得ΔΑ。= 0. 646 ;
[0019] (4)韭菜處理：于步驟（2)中的7支小試管中分別加入50ul酶溶液，50ul顯色劑， 在37-38°C的恒溫箱中放置30min后，再分別加入50ul底物液，倒入比色皿中，用分光光度 計(jì)檢測(cè)在410nm波長(zhǎng)下反應(yīng)3min后與3min前的吸光度變化值Δ Ai，記錄數(shù)據(jù)見(jiàn)表1 ;
[0020] 表 1

【權(quán)利要求】
1. 一種利用加熱解決酶抑制法檢測(cè)韭菜和蒜黃中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留產(chǎn) 生假陽(yáng)性的方法，實(shí)施步驟如下： (1) 制備試劑：①PH8. 0緩沖液：準(zhǔn)確稱取磷酸氫二鈉（Na2HP04 ·12Η20)33. 92g，磷酸二 氫鈉（NaH2P04 · 2H20)0. 83g，用蒸餾水溶解定容至1000ml，即為pH8. Ο 0. lmol/L的磷酸緩 沖液；②酶溶液：根據(jù)丁酰膽堿酯酶（BuChE)的活性情況，用10ml緩沖液溶解，反應(yīng)前后吸 光度差值控制在大于或等于0. 4 ;③底物液：碘化硫代丁酰膽堿（BuTCI) 100mg，用10ml 緩沖液溶解；④顯色劑：二硫代雙對(duì)基苯甲酸（DTNB)60mg，用10ml緩沖液溶解。 (2) 制備樣品：稱取切碎長(zhǎng)度為1.0-1. 5cm的韭菜或蒜黃2. 0g，放入提取瓶?jī)?nèi)，加入 20ml緩沖液，振蕩l-2min，倒出提取液，靜置3-5min，取上清液3ml于1支小試管中，在80°C 的恒溫箱或水浴鍋中加熱lmin，冷卻到室溫，待用； (3) 對(duì)照組處理：于1只提取瓶中加入20ml緩沖液，振蕩l-2min，倒出提取液，靜置 3-5min。于小試管內(nèi)分別加入50ul酶溶液，3ml提取液，50ul顯色劑，在37-38°C的恒溫箱 中放置30min后，再加入50ul底物液，倒入比色皿中，用分光光度計(jì)檢測(cè)在410nm波長(zhǎng)下反 應(yīng)3min后與3min前的吸光度變化值Λ \，記錄數(shù)據(jù)； (4) 韭菜或蒜黃處理：于步驟⑵中的1只小試管中加入50ul酶溶液，50ul顯色劑，在 37-38°C的恒溫箱中放置30min后，再加入50ul底物液，倒入比色皿中，用分光光度計(jì)檢測(cè) 在410nm波長(zhǎng)下反應(yīng)3min后與3min前的吸光度變化值A(chǔ)Ai，記錄數(shù)據(jù)； (5) 檢測(cè)結(jié)果計(jì)算： 酶抑制率（％) = [(AVAAJ/AAJXIOO 其中，是對(duì)照組反應(yīng)3min的吸光度變化值，AAi是樣品組反應(yīng)3min的吸光度變 化值；當(dāng)韭菜或蒜黃樣品提取液對(duì)酶的抑制率> 70%時(shí)，表示該樣品中含有某種有機(jī)磷或 氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的利用加熱解決酶抑制法檢測(cè)韭菜和蒜黃中有機(jī)磷和氨基甲酸 酯類農(nóng)藥殘留的方法，其特征在于，所述步驟（5)韭菜或蒜黃樣品提取液對(duì)酶的抑制率 > 70%時(shí)，該樣品需要重復(fù)檢測(cè)2次以上，幾次重復(fù)檢測(cè)的重現(xiàn)性應(yīng)在80%以上，方可判定 該樣品檢測(cè)呈陽(yáng)性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的利用加熱解決酶抑制法檢測(cè)韭菜和蒜黃中有機(jī)磷和氨基甲酸 酯類農(nóng)藥殘留的方法，其特征在于，所述步驟（5)韭菜或蒜黃樣品提取液對(duì)酶的抑制率 >70%時(shí)，陽(yáng)性結(jié)果的樣品，可用其他方法進(jìn)一步確定具體農(nóng)藥品種及含量。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的利用加熱解決酶抑制法檢測(cè)韭菜和蒜黃中有機(jī)磷和氨基甲酸酯 類農(nóng)藥殘留的方法，其特征在于，所述步驟（1)的酶溶液置于_18°C冰箱中保存，緩沖液、底 物液、顯色劑置于〇_5°C冰箱中冷藏保存、備用，保存期不超過(guò)兩周。
【文檔編號(hào)】G01N21/31GK104142305SQ201310166866
【公開(kāi)日】2014年11月12日 申請(qǐng)日期:2013年5月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月9日
【發(fā)明者】薛科宇, 張麗麗 申請(qǐng)人:薛科宇, 張麗麗