專利名稱：芘及其衍生物作為生物芯片制備中光敏基團(tuán)脫保護(hù)增敏試劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物芯片技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及芘及其衍生物作為生物芯片制備中光敏基團(tuán)脫保護(hù)增敏試劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由于光敏基團(tuán)的應(yīng)用，生物芯片原位合成技術(shù)的發(fā)展更加快速。用光敏基團(tuán)保護(hù)某些特定的化學(xué)基團(tuán)，在特定波長光的輻射下，當(dāng)光敏基團(tuán)吸收足夠的能量就會與被保護(hù)的活性基團(tuán)斷開，這個過程稱為光脫保護(hù)反應(yīng)。也就是說，可以將曝光作為脫保護(hù)的控制條件，定時定量的將光照區(qū)域的某些被保護(hù)基團(tuán)進(jìn)行脫保護(hù)。這種技術(shù)被廣泛的應(yīng)用于光導(dǎo)向的原位合成中，最早由Fodor等人采用光刻法合成了 5個氨基酸長度的多肽，同時也被廣泛地用于蛋白質(zhì)芯片，基因芯片等的合成中。光敏基團(tuán)的光脫保護(hù)效率的高低是決定光刻法合成是否成功的因素之一。以DNA芯片合成來說，在重復(fù)的光脫保護(hù)和偶聯(lián)的過程中，光敏基團(tuán)的離去時間必須是適中的，否則合成一條幾十個堿基長度的DNA探針需要幾十個小時甚至幾天。如何提高紫外敏感基團(tuán)的感光效率，特別是在光強(qiáng)較低的情況下光脫保效率的提高已經(jīng)成為越來越重要的一個課題。為了提高光敏基團(tuán)的離去效率，人們開展了許多研究工作。當(dāng)光敏基團(tuán)及光強(qiáng)度確定之后，選擇合適的曝光環(huán)境成為光敏基團(tuán)脫保護(hù)效率的決定因素，大多數(shù)光刻實驗都是在溶液中進(jìn)行的，為了最大限度的提高光敏基團(tuán)的光敏感性，在溶劑中添加光敏劑就成為了選擇之一。比如Woll，D等人提出采用三線態(tài)光敏劑2-異丙基硫雜蒽酮(ITX)充當(dāng)DNA芯片合成中光敏基團(tuán)脫保護(hù)的增敏試劑，在無氧環(huán)境下，有效地提高了光脫保護(hù)的速率。盡管如此，目前的研究并未在更廣泛的應(yīng)用上達(dá)到令人滿意的程度。在用光刻法原位合成肽核酸(PNA)芯片的過程中發(fā)現(xiàn):如果在曝光溶劑中加入ITX系列光敏劑，曝光過程將·帶來很多負(fù)效應(yīng)，甚至破壞所有的氨基活性基團(tuán)，這可能是由于ITX系列光敏劑吸收光之后產(chǎn)生具有破壞性的自由基所引起的。因此，為克服裂解型光敏劑帶來的負(fù)效應(yīng)，需要尋找一種能用于生物芯片原位合成工藝的新型光敏劑。芘及芘的某些衍生物是一類具有熒光特性的共軛芳香族化合物，在稀溶液中具有較高的量子效率并能發(fā)出與激發(fā)波長相近的熒光。但是該類試物質(zhì)長期以來只作為熒光標(biāo)記試劑、光聚合試劑使用，或者應(yīng)用于有機(jī)光電子領(lǐng)域，更沒有將芘及其衍生物作為光敏基團(tuán)脫保護(hù)增敏試劑在生物芯片制備中應(yīng)用的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足和偏見，提供一種芘及其衍生物作為生物芯片制備中光敏基團(tuán)脫保護(hù)增敏試劑的新用途。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
芘及其衍生物作為生物芯片制備中光敏基團(tuán)脫保護(hù)增敏試劑的應(yīng)用。
其中，所述芘及其衍生物的濃度為0.08—0.12M，優(yōu)選為0.1M。所述芘衍生物為芘甲醇、N-芘甲基乙酰胺、1，4_ 二芘苯、1-乙炔基芘、1，3，6，-三(三甲基硅)芘等。所述生物芯片是肽核酸生物芯片。 所述生物芯片制備是采用光導(dǎo)向的原位合成法制備肽核酸生物芯片。所述原位合成法制備肽核酸生物芯片時采用10—13mW/cm2、365nm的紫外光,優(yōu)選為12mW/cm2、365nm的紫外光。下面結(jié)合原理對本發(fā)明作進(jìn)一步說明:
本發(fā)明在利用原位合成法制備肽核酸生物芯片時，采用芘及其衍生物作為曾敏試劑以加快光敏基團(tuán)的脫保護(hù)速率。ITX系列光敏劑主要用于光敏基團(tuán)保護(hù)的羥基的脫保護(hù)，在DNA合成中起到比較好的作用，而之前的報道多肽合成中采用的紫外光比較強(qiáng)，達(dá)35mW左右，不需要用到光敏試齊U。本發(fā)明的發(fā)明人在合成PNA (光敏基團(tuán)連接在氨基上)時使用了較弱的紫外光(10—13mW/cm2、365nm的 紫外光)，因此，考慮到要使用光敏增強(qiáng)試劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ITX系列副反應(yīng)很多。ITX系列光敏劑受到激發(fā)之后沒有傳遞出去的能量會裂解ITX，產(chǎn)生自由基，從而破壞反應(yīng)體系；而芘及其衍生物以熒光形式釋放多余的能量，從而避免負(fù)效應(yīng)，更意外的是這類物質(zhì)的激發(fā)光與發(fā)射光的波長相差很小，也就是兩者都在光敏基團(tuán)能感應(yīng)的波段，這樣的話就相當(dāng)于光對紫外敏感基團(tuán)接觸了兩次(一次是原始紫外光，另外一次就是產(chǎn)生的熒光)。光敏基團(tuán)受到一定波長的紫外光輻射，當(dāng)光子能量足夠時，光敏基團(tuán)就將與被保護(hù)的活性基團(tuán)斷開，從而實現(xiàn)脫保護(hù)。但是在光強(qiáng)一定或者較低的情況下，要想加快光脫保護(hù)的速率，就必須加快光敏基團(tuán)能量的吸收效率。在溶劑環(huán)境下，光敏劑芘在某一波段照射下，被激發(fā)至三線態(tài)，通過與光敏基團(tuán)的碰撞，將三線態(tài)能量傳遞給光敏基團(tuán)從而加速光脫保護(hù)。處于三線態(tài)的電子通常由于熱碰撞最終都會消耗掉自己的能力，因而不發(fā)光。然而，由于芘的熒光特性，不僅能激發(fā)至三線態(tài)，而且能激發(fā)至單線態(tài)并發(fā)出熒光，這是因為電子被激發(fā)至單線態(tài)后，經(jīng)過振動弛豫和內(nèi)部轉(zhuǎn)移，電子到達(dá)被激發(fā)的單線態(tài)(Si)的最低層(v=0)，然后以輻射的形式躍遷至基態(tài)(S0)，發(fā)出熒光。熒光波長與激發(fā)波長非常接近，能夠被光敏基團(tuán)再次吸收，也就是說在輻射紫外光及光敏劑單線態(tài)與三線態(tài)能量的共同作用下，增加光敏基團(tuán)能量的吸收，達(dá)到三次脫保護(hù)的效果(第一次是原始紫外光，第二次是能量傳遞，第三次是產(chǎn)生的熒光)，進(jìn)而提高光敏基團(tuán)的脫保護(hù)速率。不僅芘具有熒光特性，芘的衍生物也具有類似的性質(zhì)，如N-芘甲基乙酰胺，將其用于光敏基團(tuán)的脫保護(hù)，顯著地提高光脫保護(hù)速率，同時因為N-芘甲基乙酰胺產(chǎn)生的熒光與光敏基團(tuán)激發(fā)波長相近且熒光強(qiáng)度略高于芘(如圖3所示)，更有利于光敏基團(tuán)的脫保護(hù)。本發(fā)明公開的是能發(fā)熒光的化合物芘及芘的衍生物用作光敏基團(tuán)脫保護(hù)的增敏試劑的用途，利用熒光的再次增強(qiáng)，實現(xiàn)了對光敏基團(tuán)的三次脫保護(hù)(第一次是原始紫外光，第二次是能量傳遞，第三次是產(chǎn)生的熒光)，加速了光敏基團(tuán)的脫保護(hù)速率。同時，也因為利用熒光化合物的發(fā)熒光的性能，有效避免一般光敏試劑(如ITX系列)引起的裂解自由基的破壞作用，提高光敏基團(tuán)脫保護(hù)的質(zhì)量(如圖2所示)?？傊?，本發(fā)明首次提出利用熒光光敏劑的熒光加速光敏基團(tuán)脫保護(hù)，產(chǎn)生了意想不到的效果。將芘及其衍生物用于光敏基團(tuán)脫保護(hù)環(huán)節(jié)中，該類試劑一方面可以吸收一定波長的紫外光，把能量傳遞給光敏基團(tuán)；另一方面受一定紫外光激發(fā)能產(chǎn)生與該紫外光波長相近的熒光，該熒光能對光敏基團(tuán)提供二次曝光，加速光敏基團(tuán)脫保護(hù)的速率，同時克服一般光敏試劑帶來的因感光裂解產(chǎn)生自由基等的負(fù)效應(yīng)。


圖1是芘充當(dāng)光敏劑加速肽核酸芯片合成中光敏基團(tuán)曝光效率對比實驗掃描結(jié)果 圖2是芘與ITX充當(dāng)光敏劑加速肽核酸芯片合成中光敏基團(tuán)曝光效率對比實驗掃描結(jié)果 圖3是10_5M濃度的芘與N-芘甲基乙酰胺以及ITX的dioxane溶液熒光光譜；
圖4芘與芘的衍生物N-芘甲基乙酰胺曝光環(huán)節(jié)對比實驗掃描結(jié)果圖。
具體實施方式
:
實施例1
芘充當(dāng)光敏劑加速肽核酸芯片合成中曝光環(huán)節(jié)實驗
采用光導(dǎo)向的原位合成肽核酸芯片，其中對光敏基團(tuán)進(jìn)行脫保護(hù)的過程是合成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如要合成肽核酸芯片探針一般為13-17個堿基長度，則需要進(jìn)行13-17次曝光，在每次曝光之后再偶聯(lián)上新 的堿基，也就是說，曝光的效率最終直接地影響著整個肽核酸鏈的合成效率。本實驗中光強(qiáng)為12mW/cm2的365nm的紫外光，合成中利用的單體光敏基團(tuán)為2- (2-硝基苯)丙氧羰基(NPP0C)，為證明芘的增敏作用，將修飾有NPPOC保護(hù)的氨基的玻片在不同溶劑(1，4-二氧雜環(huán)己烷和芘)環(huán)境中進(jìn)行相同時間梯度下的曝光實驗(B卩，光敏基團(tuán)脫保護(hù)過程)，曝光之后使用ImM的羅丹明異硫氰酸酯的N-甲基吡咯烷酮溶液處理30分鐘，然后分別用N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯甲烷、含0.3%吐溫的水溶液中超聲洗滌5分鐘，然后用雙蒸水漂洗，氮氣吹干，熒光信號由Genepix Pro 4000B掃描儀檢測分析。將在有機(jī)溶劑1，4-二氧雜環(huán)己燒(Dixoane)中進(jìn)行的曝光結(jié)果與添加0.1M花的dixoane溶液中的結(jié)果進(jìn)行對比，掃描結(jié)果如圖1所示。在365nm紫外光的照射下，在dioxane中曝光，在10分鐘左右出現(xiàn)了飽和現(xiàn)象，但整體熒光強(qiáng)度偏低，可見在僅用dioxane溶劑的情況下，光敏基團(tuán)并不一定實現(xiàn)百分之百的脫保護(hù)或者光敏基團(tuán)的離去與曝光反應(yīng)中對產(chǎn)生的氨基破壞作用過早出現(xiàn)平衡。在加入了光敏劑花的dioxane溶液中在17分鐘時出現(xiàn)飽和,但是整體信號強(qiáng)度都強(qiáng)于在dioxane中曝光，也就說在光強(qiáng)不強(qiáng)的情況下，添加適量的芘能夠使被照區(qū)域?qū)崿F(xiàn)最大程度上的脫保護(hù)。這是合成生物芯片的關(guān)鍵步驟，在完全曝光的基礎(chǔ)上，進(jìn)行偶聯(lián)與再曝光能夠保證生物芯片合成的準(zhǔn)確率。該實施例說明光敏劑芘在曝光溶劑中確實起到了提高光脫保護(hù)效率的作用。實施例2
光敏劑2-異丙基硫雜蒽酮(ITX)與芘在肽核酸(PNA)芯片合成中曝光對比實驗光敏劑ITX在合成DNA芯片中加速光敏基團(tuán)保護(hù)的羥基起到一定的效果，由此特將光敏劑ITX與光敏劑芘在肽核酸(PNA)合成中進(jìn)行曝光對實驗。本實驗中光強(qiáng)為12mW/cm2的365nm的紫外光，合成中利用的單體光敏基團(tuán)為2- (2-硝基苯)丙氧羰基(NPP0C)，將修飾有NPPOC保護(hù)的氨基的玻片在不同溶劑(光敏劑ITX和芘)環(huán)境中進(jìn)行相同時間梯度下的曝光實驗(即，光敏基團(tuán)脫保護(hù)過程)，曝光之后使用ImM的羅丹明異硫氰酸酯的N-甲基吡咯烷酮溶液處理30分鐘，然后分別用N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯甲烷、含0.3%吐溫的水溶液中超聲洗滌5分鐘，然后用雙蒸水漂洗，氮氣吹干，熒光信號由Genepix Pro 4000B掃描儀檢測分析。0.1M光敏劑ITX的DMF溶液曝光的實驗結(jié)果與0.1M光敏劑芘的DMF溶液進(jìn)行對照分析，掃描結(jié)果如圖2所示。ITX做光敏劑，曝光從開始整體信號強(qiáng)度就不高，并隨著曝光時間的增加，熒光強(qiáng)度持續(xù)較低，并出現(xiàn)比背景更低的掃描強(qiáng)度，這要歸咎于ITX在曝光溶劑中受紫外光照之后，能量沒有全部轉(zhuǎn)移到光敏基團(tuán)上，自身裂解產(chǎn)生自由基，對表面手臂分子遭到了某種程度的破壞；芘做增敏試劑，在20分鐘的曝光時間內(nèi)，曝光信號強(qiáng)度隨時間梯度上升，并在15分鐘左右達(dá)到飽和狀態(tài)，這要歸功于一方面芘吸收紫外光后，進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移增敏作用，把紫外能量直接傳給光敏基團(tuán)，另外一方面，芘在受紫外光激發(fā)之后，發(fā)出與激發(fā)紫外光波長非常相近的熒光，且均與光敏基團(tuán)敏感波長相近，對光敏基團(tuán)進(jìn)行二次曝光。圖3所示的芘及芘的衍生物與ITX的熒光譜可以看出，ITX幾乎沒有熒光，這證明芘在同光敏劑ITX的促光脫保護(hù)的比較中較有優(yōu)勢，其熒光特性能有效避免能量積累導(dǎo)致的裂解自由基的破壞作用。實施例3
芘的衍生物N-芘甲基乙酰胺與芘曝光對比實驗
(a) N-芘甲基乙酰胺的合成:合成的第一步是芘的甲?；?，在室溫，芘加入到三濾氧磷與N-甲基甲酰苯胺的混合物中，溶液加熱到100°C，氮氣保護(hù)，得到1-芘甲醛；第二步是1-芘甲醛與鹽酸羥氨作用生成1-芘甲醛肟中間體；第三步是在甲酸條件下，用鋅粉還原
1-芘甲肟得到1-芘甲基胺:第四步進(jìn)行氨基與羧基的縮聚反應(yīng)，反應(yīng)物溶解在冰醋酸中，與乙酸酐反應(yīng)，回流，得到最終產(chǎn)物N-(1-芘甲基)乙酰胺。(b)芘以及芘的衍生物都是具有熒光特性的一類物質(zhì)，在芘的結(jié)構(gòu)上連上相應(yīng)的基團(tuán)，甚至具有比芘更強(qiáng)的熒光特性。在本實施例中，對比NPPOC保護(hù)氨基的曝光實驗進(jìn)行效果對比。本實驗中光強(qiáng)為12mW/cm2的365nm的紫外光，合成中利用的單體光敏基團(tuán)為
2-(2-硝基苯)丙氧羰基(NPP0C)，將修飾有NPPOC保護(hù)的氨基的玻片在不同溶劑(芘和芘甲基乙酰胺)環(huán)境中進(jìn)行相同時間梯度下的曝光實驗(即，光敏基團(tuán)脫保護(hù)過程)，曝光之后使用ImM的羅丹明異硫氰酸酯的N-甲基吡咯烷酮溶液處理30分鐘，然后分別用N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯甲烷、含0.3%吐溫的水溶液中超聲洗滌5分鐘，然后用雙蒸水漂洗，氮氣吹干，熒光信號由Gen印ix Pro 4000B掃描儀檢測分析。分別在0.1M芘的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液和0.1M N-芘甲基乙酰胺的DMF溶液中進(jìn)行光脫保護(hù)實驗，掃描結(jié)果圖如圖4所示?？梢钥闯?，在含芘乙酰胺的溶劑中曝光要優(yōu)于含芘的溶劑中的結(jié)果，表現(xiàn)為整體熒光強(qiáng)度的增加與飽和時間的提前。此實施例可以證明，芘的衍生物具有同樣或者更好的曝光增敏效果。
權(quán)利要求
1.芘及其衍生物作為生物芯片制備中光敏基團(tuán)脫保護(hù)增敏試劑的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述芘及其衍生物的濃度為0.08—0.12M。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述芘及其衍生物的濃度為0.1M。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述芘衍生物為芘甲醇、N-芘甲基乙酰胺、1，4_ 二芘苯、1-乙炔基芘或1，3，6，-三(三甲基硅)芘。
5.如權(quán)利要求1至4任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述生物芯片是肽核酸生物芯片。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述生物芯片制備是采用光導(dǎo)向的原位合成法制備肽核酸生物芯片。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述原位合成法制備肽核酸生物芯片時采用 10—13mW/cm2、365nm 的紫外光。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述原位合成法制備肽核酸生物芯片時采用12mW/cm2、365nm的 紫外光。
全文摘要
本發(fā)明公開了芘及其衍生物作為生物芯片制備中光敏基團(tuán)脫保護(hù)增敏試劑的應(yīng)用。利用熒光的再次增強(qiáng)，實現(xiàn)了對光敏基團(tuán)的三次脫保護(hù)(第一次是原始紫外光，第二次是能量傳遞，第三次是產(chǎn)生的熒光)，加速了光敏基團(tuán)的脫保護(hù)速率。同時，也因為利用熒光化合物的發(fā)熒光的性能，有效避免一般光敏試劑(如ITX系列)引起的裂解自由基的破壞作用，提高光敏基團(tuán)脫保護(hù)的質(zhì)量。
文檔編號G01N21/64GK103234948SQ20131016859
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月9日
發(fā)明者劉正春, 石環(huán)環(huán), 梁波, 牛艷芳, 楊飛鵬 申請人:中南大學(xué)