一種腸出血性大腸桿菌快速檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種腸出血性大腸桿菌快速檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟：免疫抗原的制備，免疫小鼠，抗體的純化，膠體金試紙條的制備。本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單快捷的腸出血性大腸桿菌檢測(cè)方法，旨在制備出高靈敏度腸出血性大腸桿菌膠體金試紙條，直接檢測(cè)樣品中的腸出血性大腸桿菌，解決了長(zhǎng)期存在的腸出血性大腸桿菌檢測(cè)周期長(zhǎng)，檢測(cè)操作復(fù)雜的難題；此外，本發(fā)明采用的免疫膠體金層析分析法，納米膠體金技術(shù)結(jié)合免疫原理，檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、方便快捷、準(zhǔn)確靈敏，適合現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)，利于檢測(cè)部門的監(jiān)控。
【專利說(shuō)明】一種腸出血性大腸桿菌快速檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種腸出血性大腸桿菌快速檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 大腸桿菌是一種革蘭氏陰性短桿菌，長(zhǎng)約2*l〇-3cm，寬約0. 5*l〇-3cm，體積約為 0. 6-0. 7*10-6cm周身鞭毛大約每個(gè)菌細(xì)胞有4 一 6根鞭毛能運(yùn)動(dòng)無(wú)芽孢。大腸桿菌合成代 謝能力強(qiáng)，在含無(wú)機(jī)鹽、錢鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)大腸桿菌的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌大 量存在于人及其他恒溫動(dòng)物體內(nèi)的腸道內(nèi)，常隨人及動(dòng)物糞便一塊排出，廣泛傳播于自然 環(huán)境中，對(duì)水源造成污染。若在水和食品中檢出，可認(rèn)為是被糞便污染的指標(biāo)。大腸桿菌對(duì) 熱的抵抗力較其他腸道桿菌強(qiáng)，55°C經(jīng)60分鐘或60°C加熱15分鐘仍有部分細(xì)菌存活。在自 然界的水中可存活數(shù)周至數(shù)月，在溫度較低的糞便中存活更久，這些特性使他們可以作為 一個(gè)理想的生物測(cè)試環(huán)境樣品的糞便污染指示物，因此，大腸桿菌的檢測(cè)已成為環(huán)境微生 物學(xué)中重要的檢測(cè)項(xiàng)目之一。目前，世界各國(guó)及國(guó)際組織都將大腸菌群數(shù)作為重要環(huán)境衛(wèi) 生學(xué)指標(biāo)，并對(duì)其提出了嚴(yán)格的限制。世界衛(wèi)生組織《飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》（第二版）中規(guī)定， 所有用于飲用的水中大腸桿菌或耐熱大腸菌在任意l〇〇mL水樣中不得檢出；現(xiàn)行美國(guó)飲用 水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)國(guó)家一級(jí)飲用水標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定總大腸菌群為cfu/ml ;中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《生 活飲用水水質(zhì)衛(wèi)生規(guī)范》規(guī)定，總大腸菌群及糞大腸菌群每l〇〇mL水樣中不得檢出。
[0003] 大腸桿菌的最適生長(zhǎng)溫度為37°C，在42°C并4°C條件下也可生長(zhǎng)，有些實(shí)驗(yàn)室菌 株在高達(dá)49°C下仍能繁殖。大腸桿菌兼性厭氧，其最適生長(zhǎng)的pH值范圍為6. 8 - 8.0。在 酸性發(fā)酵的厭氧條件下，大腸桿菌可以產(chǎn)生乳酸，琥珀酸，乙醇，乙酸和二氧化碳等。
[0004] 檢測(cè)大腸桿菌的傳統(tǒng)方法包括多管發(fā)酵法和濾膜法。
[0005] 多管發(fā)酵法適用于各種樣品，但操作復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)；濾膜法主要用于檢測(cè)雜 質(zhì)較少的水樣，操作比多管發(fā)酵法更為簡(jiǎn)單。但是這兩種方法都具有檢測(cè)周期長(zhǎng)，程序繁瑣 的缺點(diǎn)，難以適應(yīng)污染源快速診斷的需要。
[0006] 多管發(fā)酵法：
[0007] 食品中大腸茵群數(shù)常以每l〇〇ml (g)檢測(cè)樣品內(nèi)大腸菌群最近似數(shù)（MPN)來(lái)表示。 大腸菌群的測(cè)定，一般應(yīng)包括發(fā)酵試驗(yàn)（在單料或雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)進(jìn)行）、分離培養(yǎng) 試驗(yàn)（利用伊紅美藍(lán)平皿分離）、復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)（在乳糖發(fā)酵管中進(jìn)行）、革蘭氏染色、芽抱染 色、顯微鏡觀察等試驗(yàn)操作。
[0008] 大腸桿菌多管發(fā)酵法是指多管發(fā)酵法大腸菌群陽(yáng)性，在含有熒光底物的培養(yǎng)基上 44. 5°C培養(yǎng)24h，能產(chǎn)生β -葡萄糖醛酸酶（β -glucuronidase)分解熒光底物釋放出熒光 產(chǎn)物，使培養(yǎng)基在紫外光下產(chǎn)生特征性熒光，以此來(lái)檢測(cè)水中大腸桿菌的方法。多管發(fā)酵法 是對(duì)樣品中活菌濃度的一種估計(jì)值。
[0009] 當(dāng)混勾的樣品通過(guò)一系列稀釋和等量分配成為小樣品時(shí)，有些小樣品中最后喊樣 品量少，以至其中不再含有需檢驗(yàn)的細(xì)菌。在一定的小樣品中存在或不存在細(xì)菌，可被用來(lái) 對(duì)原樣品的菌數(shù)作統(tǒng)計(jì)學(xué)估計(jì)。多管發(fā)酵法就是這樣一種將樣品"多次（管）稀釋至無(wú)菌" 的計(jì)數(shù)方法。在此方法中，將3個(gè)稀釋梯度的檢樣稀釋液接種于9支或巧支試管培養(yǎng)基中， 每個(gè)稀釋度接種3支或5支。經(jīng)培養(yǎng)后，根據(jù)結(jié)果查閱MPN檢索表，就可得到原樣品中微生 物的估計(jì)數(shù)量。
[0010] 多管發(fā)酵法尤其適用于帶菌量極少、其他方法不能檢測(cè)的食品。比如水、乳制品及 其他食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)測(cè)定。在對(duì)一個(gè)產(chǎn)氣腸桿菌純培養(yǎng)物作計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)采用選擇性 平板計(jì)數(shù)法而不要用多管發(fā)酵法。如果待檢測(cè)的樣品是以其他細(xì)菌為主的河水，就應(yīng)選用 多管發(fā)酵法。
[0011] 食物上細(xì)菌的分布有可能是完全均勻的，也有可能存在于固態(tài)食物的表面上，或 者有可能分布在食物的特定的污染點(diǎn)，或是在全部食物中隨機(jī)分布的定位的污染點(diǎn)上。MPN 表中所列的值是假定所檢驗(yàn)的細(xì)菌在樣品或檢樣稀釋液中呈均勻分布而計(jì)算出來(lái)的。而 食物中的脂肪和不溶性食物顆粒妨礙了均一性，由于這個(gè)原因，由食物樣品中所得到的MPN 值，比之由水樣中所得到MPN值的精確度和可重復(fù)性就要差一些。
[0012] 濾膜法：
[0013] 針對(duì)大腸菌群的濾膜法是指用孔徑為0. 45pm的微孔濾膜過(guò)濾水樣，將濾膜貼在 添加乳糖的選擇性培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)24h，能形成特征性菌落的需氧和兼性厭氧的革蘭氏 陰性無(wú)芽胞桿菌以檢測(cè)水中大腸菌群的方法。采用濾膜過(guò)濾器過(guò)濾水樣，將水中含有的細(xì) 菌截留在濾膜上，然后將濾膜放在品紅硫酸鈉培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，因大腸菌群可以發(fā)酵乳 糖，在濾膜上出現(xiàn)紫紅色具有金屬光澤的菌落。直接計(jì)數(shù)濾膜上生長(zhǎng)的典型大腸菌群茵落， 可計(jì)算出每升水樣中含大腸菌群數(shù)。如果有必要，對(duì)可疑菌落應(yīng)進(jìn)行涂片染色鏡檢，并再接 種乳糖發(fā)酵管進(jìn)一步鑒定。
[0014] 大腸桿菌濾膜法則是指用濾膜法檢測(cè)水樣后，將大腸菌群陽(yáng)性的濾膜在含有熒光 底物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能產(chǎn)生P -葡萄糖醛酸酶分解熒光底物釋放出熒光產(chǎn)物，使菌落能 夠在紫外光下產(chǎn)生特征性熒光，以此來(lái)檢測(cè)水中大腸桿菌的方法。
[0015] 濾膜法具有高度的再現(xiàn)性，可用于檢驗(yàn)體積較大的水樣，能比多管發(fā)酵技術(shù)更快 地獲得肯定的結(jié)果。不過(guò)在檢驗(yàn)渾濁度高、非大腸桿菌類的細(xì)菌密度大的水樣時(shí)，有其局限 性。
[0016] 多管發(fā)酵法和濾膜法的結(jié)果作統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，可顯示后者較為精密。雖然這兩種技 術(shù)所得到的數(shù)據(jù)都提供了基本相同的樣品質(zhì)量情報(bào)，但檢驗(yàn)結(jié)果的數(shù)值不同。在做水源的 檢驗(yàn)時(shí)，可以預(yù)期約有80%的濾膜實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)落在多管發(fā)酵實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)95%的置信界限內(nèi)。
[0017] 目前，國(guó)內(nèi)外研究人員已經(jīng)發(fā)展了一些新方法進(jìn)行大腸桿菌的快速檢測(cè)，主要包 括酶底物法、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、免疫分析法、電化學(xué)方法、熒光法等。
[0018] 酶底物法：
[0019] 在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)〈GBT5750. 12 - 2006生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法〉中介紹了大腸菌群 和大腸桿菌酶底物法。大腸菌群酶底物法是指在選擇性培養(yǎng)基上能產(chǎn)生β -半乳糖昔酶 (β -D-galactosidase)的細(xì)菌群組，該細(xì)菌群組能分解色原底物釋放出色原體使培養(yǎng)基呈 現(xiàn)顏色變化，以此技術(shù)來(lái)檢測(cè)水中總大腸菌群的方法。大腸桿菌酶底物法是指在選擇性培 養(yǎng)基上能產(chǎn)生P-半乳糖昔酶（β-D-galactosidase)分解色原底物釋放出色原體使培養(yǎng) 基呈現(xiàn)顏色變化，并能產(chǎn)生壓葡萄糖醒酸酶（β - ghicuronidase)分解突光底物釋放出突 光產(chǎn)物，使菌落能夠在紫外光下產(chǎn)生特征性熒光，以此技術(shù)來(lái)檢測(cè)大腸埃希氏菌的方法為 大腸埃希氏菌酶底物法。
[0020] 酶底物法之所以可以入選國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，是由于根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，幾乎所有的大 腸菌群都有0-〇-半乳糖普酶0-〇-〖&]^〇1:〇8丨(^86)活性，94 (%-97(%的大腸桿菌具有 β-D-葡糖醛酸糖普酶（β-D-- glucuronidase)活性，而且水體和食品中都缺少這兩種 酶。因此，基于這兩種酶的水體和食品中大腸菌群和大腸桿菌的檢測(cè)方法得到了迅速的發(fā) 展。最近報(bào)道的一種安培生物傳感器應(yīng)用對(duì)氨基酚β-D-毗喃半乳糖苷（PAPG)作為底物， 能夠在60 - 7min內(nèi)檢測(cè)1000cfu/ml的大腸桿菌，采用預(yù)培養(yǎng)步驟可將靈敏度提高約一百 倍。
[0021] 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)：
[0022] 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR，Polymerase Chain Reaction)是利用從耐熱菌中分離的 DNA聚合酶，加入適量寡聚核普酸引物，以四種脫氧核普酸材料模擬天然DNA復(fù)制過(guò)程，在 實(shí)驗(yàn)室條件下特異性擴(kuò)增DNA(或RNA)片段的一種新技術(shù)。PCR由變性一退火一延伸三個(gè) 基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：1.模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93°C左右一定時(shí)間后，使模板 DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng) 作準(zhǔn)備；2.模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55°C 左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；3.引物的延伸：DNA模板一引物結(jié)合物在 幾 qDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù) 制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性一退火一延伸三過(guò) 程，就可獲得更多的"半保留復(fù)制鏈"，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè) 循環(huán)需2 - 4分鐘，2-3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。
[0023] PCR技術(shù)經(jīng)過(guò)近20年的發(fā)展已經(jīng)相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)和成熟，與電化學(xué)傳感器、酶聯(lián)免疫分 析以及表面等離子共振傳感器等檢測(cè)方法結(jié)合已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的檢測(cè)成為微生物檢 測(cè)技術(shù)中常見(jiàn)而重要的最基礎(chǔ)的分析手段之一。其中，應(yīng)用于大腸桿菌快速檢測(cè)的PCR技 術(shù)也到的了長(zhǎng)足的發(fā)展。Fricke :等建立了基于PCR的大腸桿菌檢測(cè)方法，可在24h內(nèi)完成 99種不同的環(huán)境水樣檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法100%吻合。Fortin等將套式PCR技術(shù)和 熒光探針相結(jié)合，可檢測(cè)出牛奶和果汁中大于100c幾如L的大腸桿菌，如果對(duì)細(xì)菌進(jìn)行增 菌處理，則可在6小時(shí)內(nèi)檢測(cè)到低至lefi刀mL的大腸桿菌。但是，PCR技術(shù)檢測(cè)大腸桿菌 有三點(diǎn)局限：一是難以精確定量；二是由于靈敏度高，操作不慎易交叉污染，產(chǎn)生假陽(yáng)性， 三是操作復(fù)雜，儀器昂貴，不利與大規(guī)模應(yīng)用。
[0024] 免疫檢測(cè)技術(shù)：
[0025] 免疫檢測(cè)技術(shù)是基于抗體與抗原或半抗原之間的高選擇性反應(yīng)而建立起來(lái)的一 種生物化學(xué)分析法，分為放射免疫分析、突光免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、酶免疫分析、酶 聯(lián)免疫分析及電化學(xué)免疫分析等非均相免疫分析和均相免疫分析。免疫檢測(cè)技術(shù)具有許多 優(yōu)點(diǎn)：第一，高選擇性。抗體的特異性很高，在免疫分析中一般樣品不需要預(yù)處理，這一點(diǎn)決 定了分析結(jié)果的可靠性，同時(shí)可以省略預(yù)分離的過(guò)程。第二，高親和性。保證分析數(shù)據(jù)的精 密度和分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，這也是達(dá)到高靈敏分析的基礎(chǔ)。事實(shí)上，抗體與抗原復(fù)合物的穩(wěn) 定常數(shù)一般為109,有些可達(dá)1014 - 1015,有較高的穩(wěn)定性。第三，高靈敏性?？贵w與其復(fù) 合物間應(yīng)有較大的信號(hào)反差，試劑空白低，從而結(jié)果準(zhǔn)確而靈敏。免疫檢測(cè)技術(shù)還具有檢測(cè) 時(shí)間短、樣品通量大、檢測(cè)成本低等優(yōu)勢(shì)。因此，在水體和食品中大腸桿菌的檢測(cè)領(lǐng)域得到 了諸多應(yīng)用.
[0026] 化學(xué)發(fā)光法：
[0027] 化學(xué)發(fā)光法是利用物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中伴隨的光輻射現(xiàn)象的一種化學(xué)分 析方法?；瘜W(xué)發(fā)光法在培養(yǎng)時(shí)間足夠長(zhǎng)的情況下可以檢測(cè)到非常低的細(xì)濃度，最低可以準(zhǔn) 確檢測(cè)到樣品中的幾個(gè)大腸桿菌。由于對(duì)細(xì)菌的滲透可以減胞內(nèi)酶的擴(kuò)散障礙，加速基底 向酶的傳遞，科學(xué)工作者經(jīng)常利用此來(lái)提高檢測(cè)號(hào)。同樣，熒光分析法也可以在充足的培養(yǎng) 時(shí)間下檢測(cè)到樣品中幾個(gè)大腸桿菌。例如Mathew等發(fā)展了一種化學(xué)發(fā)光檢測(cè)大腸桿菌的 方法。大腸桿菌在特定的培養(yǎng)過(guò)程中能夠產(chǎn)生半乳糖普酶，此酶能與Lumi-Gal⑧530發(fā)生 反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，發(fā)光強(qiáng)度與大腸桿菌在lxl〇3-l X106cfu/mL的范圍內(nèi)成線性關(guān)系。Van 等使用了改進(jìn)的熒光物質(zhì)和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)作為P -葡萄糖普酸酶的底物，提高了底物與細(xì) 胞之間的輸送速度，顯著改善了細(xì)菌的檢測(cè)靈敏度，縮短了檢測(cè)時(shí)間。
[0028] 除了上述的方法外，還有許多快速檢測(cè)方法，如納米裝置、熒光分析結(jié)合免疫技術(shù) 等方法，商品化的快速檢測(cè)方法包括特異性檢驗(yàn)的培養(yǎng)基、檢測(cè)試紙片等。一般是利用大腸 桿菌特異性酶檢測(cè)鑒定大腸桿菌，大約96 %?98 %的大腸桿菌產(chǎn)生β -D-葡萄糖苷酸酶 (β -D-Gud)，而絕大部分沙門氏菌、志賀氏菌和耶爾森氏菌不能產(chǎn)生該酶，因此可利用Gud 酶底物有效檢測(cè)大腸桿菌。
[0029] 以上的快速檢測(cè)方法很少是單獨(dú)使用的，更多情況下是多個(gè)方法復(fù)合使用，以提 高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，縮短檢測(cè)時(shí)間。但是這些方法還有許多方面需要改進(jìn)，其各自的不足限制 了檢測(cè)方法的推廣和運(yùn)用；而且隨著對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)速度和精確度要求的不斷提高，需 要更有效的方法的建立，為人們的生活環(huán)境及安全提供有力的保障。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0030] 本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種腸出血性大腸桿菌快速檢測(cè)方法，旨在通過(guò)采 用免疫膠體金層析分析法，納米膠體金技術(shù)結(jié)合免疫原理，制備高靈敏度腸出血性大腸桿 菌膠體金試紙條，直接檢測(cè)樣品中的腸出血性大腸桿菌，解決了長(zhǎng)期存在的腸出血性大腸 桿菌檢測(cè)周期長(zhǎng)，檢測(cè)操作復(fù)雜的問(wèn)題。
[0031] 本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種腸出血性大腸桿菌快速檢測(cè)方法，該方法包括 以下步驟：
[0032] 免疫抗原的制備；
[0033] 免疫小鼠；
[0034] 抗體的純化；
[0035] 膠體金試紙條的制備。
[0036] 進(jìn)一步，免疫抗原的制備：將二代腸出血性大腸桿菌菌株制備成菌懸液。
[0037] 進(jìn)一步，免疫小鼠：選用6-8周的BalB/c小鼠，初次免疫菌懸液與弗氏完全佐劑混 合，乳化完全，皮下多點(diǎn)注射，lml每只，每隔兩周，用相同劑量的菌懸液與弗氏不完全佐劑 進(jìn)行加強(qiáng)免疫。共加強(qiáng)免疫兩次，最后一次免疫后8-10天小鼠尾部取血，通過(guò)間接ELISA 測(cè)抗體血清效價(jià)，則進(jìn)行小鼠眼部取血。
[0038] 進(jìn)一步，抗體的純化：輕輕將血清置于Protein G親和層析柱（KPL)柱吸附瓊脂的 表面，用 10 倍柱體積 lXWashing/Binding Buffer(0. 1M 憐酸鈉緩沖液，0· 15MNaCl，pH7. 4) 洗吸附柱，用4倍柱體積的lXElution Buffer(0. 2M甘氨酸，pH2. 5)洗脫，得到腸出血性 大腸桿菌特異性抗體。
[0039] 進(jìn)一步，膠體金試紙條的制備，具體步驟為：
[0040] (1)、膠體金的制備
[0041] 利用檸檬酸三鈉法制備40nm膠體金，具體方法如下：利用冷凝回流裝置將50mL質(zhì) 量分?jǐn)?shù)為〇. 01 %的氯金酸溶液加熱至沸騰后迅速加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的檸檬酸三鈉溶液 1. 2mL，待顏色穩(wěn)定后繼續(xù)煮沸l(wèi)Omin，冷卻，4°C保存?zhèn)溆?。利用投射電鏡和紫外光譜掃描儀 分析膠體金的性狀。
[0042] (2)、標(biāo)記條件的選擇
[0043] 利用Mey氏穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)確定最佳標(biāo)記量以及最佳標(biāo)記pH值，具體方法如下：在酶 標(biāo)板孔中分別加入膠體金1〇〇μ L，而后依次從少到多加入0、0. 5、1、1. 5、2、2. 5、3、3. 5μ g 的腸出血性大腸桿菌特異性抗體，混勻lOmin后各加入10% NaCl溶液20 μ L，于lOmin后 肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果，第一個(gè)保持不變顏色的孔的抗PBP2a單克隆抗體加入量即為最少穩(wěn) 定量，最少穩(wěn)定量增加10 %左右為實(shí)際標(biāo)記量；取三支1. 5mL離心管各裝膠體金lmL，用 0· lmol/L HC1和K2C03分別調(diào)pH為7· 2、8· 2、9· 2,加入最佳標(biāo)記抗體量，對(duì)比標(biāo)記效果。
[0044] (3)、免疫膠體金制備
[0045] 取10mL膠體金于三角瓶中，用K2C03調(diào)pH為最佳標(biāo)記條件，加入最佳標(biāo)記抗體 量，RT攪拌反應(yīng)30min，得免疫膠體金，8000rpm離心30min，用lmLPBS復(fù)溶免疫膠體金備 用。將制備好的免疫膠體金噴涂在玻璃纖維膜上制成膠體金墊。
[0046] (4)、層析NC膜的制備
[0047] 將羊抗鼠二抗（C線）和腸出血性大腸桿菌多克隆抗體（T線）分別劃在NC膜上， 制成層析NC膜。
[0048] (5)、紙條的組裝
[0049] 取一張 PVC底板，在離上方18mm處貼上20mm寬的硝酸纖維膜，上方貼上19mm寬 的吸水紙，壓上硝酸纖維膜1mm，硝酸纖維膜下方貼上結(jié)合墊，結(jié)合墊壓硝酸纖維膜1mm，膠 體金墊下面貼上樣品墊（玻璃纖維膜），壓上膠體金墊3mm，下端與底板對(duì)齊。
[0050] 本發(fā)明提供的腸出血性大腸桿菌快速檢測(cè)方法，提供了一種簡(jiǎn)單快捷的本發(fā)明的 腸出血性大腸桿菌檢測(cè)方法，目的旨在制備出高靈敏度腸出血性大腸桿菌膠體金試紙條， 直接檢測(cè)樣品中的腸出血性大腸桿菌。解決了長(zhǎng)期存在的腸出血性大腸桿菌檢測(cè)周期長(zhǎng)， 檢測(cè)操作復(fù)雜的難題。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0051] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供腸出血性大腸桿菌快速檢測(cè)方法流程圖。
[0052] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的雙抗夾心法GICA原理示意圖。
[0053] 圖中：1、樣品塾；2、待檢樣品；3、結(jié)合塾；4、質(zhì)控線；5、吸水紙；6、底板；7、檢測(cè) 線；8、硝酸纖維膜。

【具體實(shí)施方式】
[0054] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0055] 圖1示出了本發(fā)明實(shí)施例提供的腸出血性大腸桿菌快速檢測(cè)方法的流程。為了便 于說(shuō)明，僅僅示出了與本發(fā)明相關(guān)的部分。
[0056] 如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例提供的腸出血性大腸桿菌快速檢測(cè)方法包括以下步 驟：
[0057] S101 :免疫抗原的制備；
[0058] S102:免疫小鼠；
[0059] S103 :抗體的純化；
[0060] S104 :膠體金試紙條的制備。
[0061] 本發(fā)明實(shí)施例提供的的具體實(shí)施步驟為：
[0062] 第一步、免疫抗原的制備：將二代腸出血性大腸桿菌菌株制備成菌懸液；
[0063] 第二步、、免疫小鼠：選用6-8周的BalB/c小鼠，初次免疫菌懸液與弗氏完全佐劑 混合，乳化完全，皮下多點(diǎn)注射，lml/每只，每隔兩周，用相同劑量的菌懸液與弗氏不完全佐 劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫。共加強(qiáng)免疫兩次，最后一次免疫后8-10天小鼠尾部取血，通過(guò)間接ELISA 測(cè)抗體血清效價(jià)，則進(jìn)行小鼠眼部取血；
[0064] 第三步、、抗體的純化：輕輕將血清置于Protein G親和層析柱（KPL)柱吸附瓊 脂的表面，用10倍柱體積lXWashing/Binding Buffer(0. 1M磷酸鈉緩沖液，0. 15MNaCl， pH7. 4)洗吸附柱，用4倍柱體積的IXElution Buffer (0. 2M甘氨酸，pH2. 5)洗脫，得到腸 出血性大腸桿菌特異性抗體；
[0065] 第五步、膠體金試紙條的制備，具體方法為：
[0066] 步驟一，膠體金的制備
[0067] 利用檸檬酸三鈉法制備40nm膠體金，具體方法如下：利用冷凝回流裝置將50mL質(zhì) 量分?jǐn)?shù)為〇. 01 %的氯金酸溶液加熱至沸騰后迅速加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的檸檬酸三鈉溶液 1. 2mL，待顏色穩(wěn)定后繼續(xù)煮沸l(wèi)Omin，冷卻，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0068] 步驟二，標(biāo)記條件的選擇：
[0069] 利用Mey氏穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)確定最佳標(biāo)記量以及最佳標(biāo)記pH值，具體方法如下：在酶 標(biāo)板孔中分別加入膠體金1〇〇μ L，而后依次從少到多加入0、0. 5、1、1. 5、2、2. 5、3、3. 5μ g 的腸出血性大腸桿菌特異性抗體，混勻l〇min后各加入10% NaCl溶液20 μ L，于10min后 肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果，第一個(gè)保持不變顏色的孔的抗PBP2a單克隆抗體加入量即為最少穩(wěn) 定量，最少穩(wěn)定量增加10 %左右為實(shí)際標(biāo)記量；取三支1. 5mL離心管各裝膠體金lmL，用 0· lmol/L HC1和K2C03分別調(diào)pH為7· 2、8· 2、9· 2,加入最佳標(biāo)記抗體量，對(duì)比標(biāo)記效果
[0070] 步驟三，免疫膠體金制備：
[0071] 取10mL膠體金于三角瓶中，用0.2M摩爾濃度K2C03調(diào)pH為8.2,加入35yg抗 體量，RT攪拌反應(yīng)30min，得免疫膠體金，8000rpm離心30min，用lmLPBS復(fù)溶免疫膠體金備 用，將制備好的免疫膠體金噴涂在聚酯纖維膜上制備成膠體金墊。聚酯纖維膜、玻璃纖維膜 處理方法：用PH7. 4的PB緩沖液浸泡1分鐘。
[0072] 步驟四，層析NC膜的制備：
[0073] 將羊抗鼠二抗（C線）和腸出血性大腸桿菌多克隆抗體（T線）分別劃在硝酸纖維 膜上，制成層析硝酸纖維膜。
[0074] 步驟五，紙條的組裝：
[0075] 如圖2所示，取一張 PVC底板6,在離上方18mm處貼上20mm寬的硝酸纖維膜8,上 方貼上19mm寬的吸水紙5,壓上硝酸纖維膜1mm，硝酸纖維膜8下方貼上結(jié)合墊即膠體金墊 3,膠體金墊3壓硝酸纖維膜1mm，膠體金墊3下面貼上樣品墊1 (玻璃纖維膜），壓上膠體金 墊3mm，下端與底板6對(duì)齊。
[0076] 檢測(cè)腸出血性大腸桿菌時(shí)只需把制備好的紙條水平放置，將待檢測(cè)樣品滴在樣品 墊1上即可。
[0077] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種腸出血性大腸桿菌快速檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟： 免疫抗原的制備；免疫小鼠；抗體的純化；膠體金試紙條的制備。
2. 如權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌快速檢測(cè)方法，其特征在于，免疫抗原的制 備是將二代腸出血性大腸桿菌菌株制備成菌懸液。
3. 如權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌快速檢測(cè)方法，其特征在于，免疫小鼠的方 法為：選用6-8周的BalB/c小鼠，初次免疫菌懸液與弗氏完全佐劑混合，乳化完全，皮下多 點(diǎn)注射，lml/每只，每隔兩周，用相同劑量的菌懸液與弗氏不完全佐劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫，共加 強(qiáng)免疫兩次，最后一次免疫后8-10天小鼠尾部取血，通過(guò)間接ELISA測(cè)抗體血清效價(jià)，則進(jìn) 行小鼠眼部取血。
4. 如權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌快速檢測(cè)方法，其特征在于，抗體純化的 方法為：將血清置于Protein G親和層析柱（KPL)柱吸附瓊脂的表面，用10倍柱體積 lXWashing/Binding Buffer洗吸附柱，用4倍柱體積的lXElution Buffer洗脫，得到腸 出血性大腸桿菌特異性抗體。
5. 如權(quán)利要求4所述的腸出血性大腸桿菌快速檢測(cè)方法，其特征在于，1 X Washing/ Binding Buffer 為 0.1M 憐酸鈉緩沖液，0.15MNaCl，ρΗ7· 4 洗吸附柱；lXElution Buffer 為0. 2M甘氨酸，pH2. 5。
6. 如權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌快速檢測(cè)方法，其特征在于，膠體金試紙條 制備的具體步驟為： 步驟一，膠體金的制備：利用冷凝回流裝置將50mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 01 %的氯金酸溶液 加熱至沸騰后迅速加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的檸檬酸三鈉溶液1. 2mL，待顏色穩(wěn)定后繼續(xù)煮沸 lOmin，冷卻，4°C保存?zhèn)溆?，利用投射電鏡和紫外光譜掃描儀分析膠體金的性狀； 步驟二，標(biāo)記條件的選擇：在酶標(biāo)板孔中分別加入膠體金100 μ L，而后依次從少到多 加入0、0. 5、1、1. 5、2、2. 5、3、3. 5μ g的腸出血性大腸桿菌特異性抗體，混勻lOmin后各加 入10% NaCl溶液20 μ L，于10min后肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果，第一個(gè)保持不變顏色的孔的抗 PBP2a單克隆抗體加入量即為最少穩(wěn)定量，最少穩(wěn)定量增加10%左右為實(shí)際標(biāo)記量，取三 支1. 5mL離心管各裝膠體金lmL，用0. lmol/L HC1和K2C03分別調(diào)pH為7. 2、8. 2、9. 2,加入 最佳標(biāo)記抗體量，對(duì)比標(biāo)記效果； 步驟三，免疫膠體金制備：取10mL膠體金于三角瓶中，用K2C03調(diào)pH為最佳標(biāo)記條件， 加入最佳標(biāo)記抗體量，RT攪拌反應(yīng)30min，得免疫膠體金，8000rpm離心30min，用lmLPBS復(fù) 溶免疫膠體金備用，將制備好的免疫膠體金噴涂在玻璃纖維膜上制成膠體金墊； 步驟四，層析NC膜的制備：將羊抗鼠二抗C線和腸出血性大腸桿菌多克隆抗體T線分 別劃在NC膜上，制成層析NC膜； 步驟五，紙條的組裝：取一張 PVC底板，在離上方18mm處貼上20mm寬的硝酸纖維膜，上 方貼上19mm寬的吸水紙，壓上硝酸纖維膜1mm，硝酸纖維膜下方貼上結(jié)合墊，結(jié)合墊壓硝酸 纖維膜1mm，膠體金墊下面貼上玻璃纖維膜，壓上膠體金墊3mm，下端與底板對(duì)齊。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK104142396SQ201310170561
【公開(kāi)日】2014年11月12日 申請(qǐng)日期:2013年5月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月10日
【發(fā)明者】裴勝, 涂維國(guó), 龐東 申請(qǐng)人:北京東方冷翠國(guó)際技術(shù)有限公司