Chip蛋白在胰腺癌早期診斷以及預后判斷中的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及CHIP蛋白在胰腺癌早期診斷以及預后判斷中的用途。進一步地，本發(fā)明提供了一種CHIP蛋白在用于制備診斷胰腺癌患者的試劑盒中的用途。更特別地，本發(fā)明提供了CHIP蛋白在制備用于評估胰腺癌患者預后的試劑盒中的用途。
【專利說明】CHIP蛋白在胰腺癌早期診斷以及預后判斷中的用途

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及CHIP蛋白作為診斷胰腺癌患者以及評估胰腺癌患者預后的血清標記 物的用途。

【背景技術】
[0002] 胰腺癌是最難早期發(fā)現(xiàn)、惡性程度最高和預后最差的腫瘤之一。美國癌癥協(xié)會對 美國腫瘤發(fā)病率及死亡率的統(tǒng)計結果表明，胰腺癌占全部腫瘤死亡原因的第四位，5年生存 率在5%以下。其死亡的主要原因是超過50%患者在發(fā)現(xiàn)時已處于晚期，腫瘤已包繞血管或 發(fā)生遠處轉移，且對傳統(tǒng)的放化療或靶向治療具有一定耐受性。因此，提高胰腺癌的早期診 斷率，抑制腫瘤的生長和遠處轉移，提高藥物的治療效果，成為改善胰腺癌患者預后的關鍵 因素。
[0003] 由于胰腺癌臨床發(fā)病隱匿，發(fā)展迅速，具有較高的侵襲性，而且通常在出現(xiàn)臨床癥 狀時已進入晚期，此時進行手術及放化療效果極差，而改變這種情況的關鍵在于早期的診 斷和治療。因此，對于胰腺癌的腫瘤標記物的研究有助于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)，有助于對胰腺 的良性病變或惡性腫瘤的鑒別診斷，為早期手術治療提供診斷依據(jù)。由于血清中可能含有 較多的腫瘤標記物，同時血樣的采集安全可靠，因此，通過血清學樣本對無癥狀患者進行胰 腺癌的篩選具有很大的潛力。目前臨床上常用的胰腺癌腫瘤學標志物是CA19-9和CA142。 CA19-9是一種唾液酸Lewis血型類粘蛋白糖蛋白抗原，與Lewis血型成分有關，用于鑒別正 常人和胰腺癌患者的敏感性為79% (70%-90%)，特異性為82 (68%-91%)，其中約5%-14%的 人群缺乏Lewis抗原糖基轉移酶而不能合成CA19-9,即使發(fā)生胰腺癌后其CA19-9的表達并 不升高；而急性膽管炎，胰腺炎膽汁淤積等非胰腺腫瘤疾病均可導致CA19-9表達的增加。 因此，CA19-9表達水平的改變更多的是作為手術或放化療后腫瘤復發(fā)的依據(jù)。CA242也是 一種唾液酸化的粘蛋白類型糖抗原，由于同時受到Lewis血型的影響所以靈敏度與CA19-9 相似，約為75% (65%-82%)，特異性為90% (65%-95%)，在與慢性胰腺炎、良性肝病、膽汁淤積 等方面診斷效率略好于CA19-9。這些標志物用于鑒別診斷的準確性并不高，常需要聯(lián)合使 用。因此，還需要尋找一些敏感性或特異性更好的腫瘤學標志物用于早期診斷。
[0004] C末端Hsc70反應蛋白（命名為CHIP)是一個種屬間高度保守的胞漿蛋白，在平滑 肌細胞、心肌細胞、骨骼肌和大腦中高度表達。它含有三個功能區(qū)，N末端的TPR功能區(qū)、 C-末端的U-盒子功能區(qū)和中間的正負電荷富集區(qū)。CHIP作為一個陪伴蛋白（chaperone) 即可通過TPR基序（motif)與熱休克蛋白Hsp70和Hsp90相互作用，輔助新生蛋白折疊，形 成具有正常結構和功能的蛋白，抑制變性蛋白的聚集；又可通過U-盒子功能區(qū)作為E3連 接酶，促進蛋白底物的泛素化降解。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CHIP在多種腫瘤中發(fā)揮重要的作用?？?與CHIP結合并發(fā)生降解的蛋白包括突變的p53,雌激素受體，erbB2, SMAD3, HIF-1，SRC-3， NF-κ B，c-Myc，以及磷酸化的AKT等，這些底物都與腫瘤的增殖、侵襲或轉移均密切相關。 另一方面，CHIP在乳腺癌、胃癌及腦神經(jīng)膠質瘤中的表達水平要明顯低于癌旁的正常組織， 這些結果均提示CHIP在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌的作用，目前關于腫瘤患者血清中CHIP表達 水平國內(nèi)外并沒有相關的報道。
[0005] 本發(fā)明來源于一個驚人的方法，S卩，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)正常人、慢性胰腺炎患者和胰腺 癌患者三者血清CHIP表達水平有顯著性差異。這一結果為胰腺疾病的鑒別診斷以及預后 提供了一個新的思路。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，癌組織表達水平高于癌旁組織，其表達與腫瘤淋巴結轉移和術后 轉移負相關；CHIP高表達患者預后相對較好，是影響胰腺癌預后的可能危險因素。CHIP在 慢性胰腺炎，胰腺癌患者血清中表達水平明顯降低；在胰腺癌患者中，其表達水平與腫瘤遠 處轉移相關，CHIP可作為鑒別正常人、慢性胰腺炎和胰腺癌患者有效的血清學標志物。
[0007] 一方面，本發(fā)明提供了一種CHIP蛋白在用于制備診斷胰腺癌患者的試劑盒中的 用途。
[0008] 進一步地，本發(fā)明提供了一種CHIP蛋白作為區(qū)分正常人、慢性胰腺炎和胰腺癌患 者的有效的血清學標志物中的用途。
[0009] 進一步地，本發(fā)明提供了一種CHIP蛋白作為區(qū)分正常人、胰腺良性腫瘤和胰腺癌 患者的有效的血清學標志物中的用途。
[0010] 進一步地，本發(fā)明提供了一種CHIP蛋白作為區(qū)分胰腺良性腫瘤、胰腺內(nèi)分泌腫瘤 與正常人的有效的血清學標志物。進一步地，所述的試劑盒用于ELISA方法中。
[0011] 另一方面，本發(fā)明提供了 CHIP蛋白在制備用于評估胰腺癌患者預后的試劑盒中 的用途。
[0012] 進一步地，其中CHIP蛋白高表達患者預后相對較好。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1顯示了 CHIP和Hsp70在癌和癌旁組織中的表達水平。N代表癌旁胰腺組織， T代表胰腺癌組織。
[0014] 圖2顯示了 CHIP在癌組織及癌旁組織表達水平比較。
[0015] 圖3顯示了血清CHIP表達水平鑒別正常人和慢性胰腺炎患者的價值。
[0016] 圖4顯示了血清CHIP表達水平鑒別正常人和胰腺良性腫瘤患者的價值。
[0017] 圖5顯示了血清CHIP表達水平鑒別正常人和胰腺內(nèi)分泌腫瘤患者的價值。
[0018] 圖6顯示了血清CHIP表達水平鑒別正常人和胰腺導管腺癌患者的價值。
[0019] 圖7顯示了血清CHIP表達水平鑒別慢性胰腺炎患者和胰腺良性腫瘤患者的價值。
[0020] 圖8顯示了血清CHIP表達水平鑒別慢性胰腺炎患者和胰腺內(nèi)分泌腫瘤患者的價 值。
[0021] 圖9顯示了血清CHIP表達水平鑒別慢性胰腺炎患者和胰腺導管腺癌患者的價值。
[0022] 圖10顯示了血清CHIP表達水平鑒別胰腺良性腫瘤患者和胰腺內(nèi)分泌腫瘤患者的 價值。
[0023] 圖11顯示了血清CHIP表達水平鑒別胰腺良性腫瘤患者和胰腺導管腺癌患者的價 值。
[0024] 圖12顯示了血清CHIP表達水平鑒別胰腺內(nèi)分泌腫瘤患者和胰腺導管腺癌患者的 價值。

【具體實施方式】
[0025] 本發(fā)明涉及的SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）是目前最常用 的分離蛋白質的電泳技術。SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質的二級和三級結 構，蛋白質同SDS分子按比例結合，形成帶負電荷的SDS-蛋白質復合物，這種復合物由于結 合大量的SDS，使蛋白質喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負離子 團塊，從而降低或消除了各種蛋白質分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質的結合 是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質分子的遷移速度僅取決于分子大小，因此可 以根據(jù)蛋白分子量大小將不同的蛋白拉出不同的梯度進而檢測。
[0026] Western blot即蛋白質印跡。被檢測物是蛋白質，"探針"是抗體，"顯色"用標記 的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體(例如PVDF薄膜)上，固相載體以非 共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體 上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與辣根過氧化物酶或同位素標 記的第二抗體起反應，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達 的蛋白成分。發(fā)光值得高低反映蛋白濃度的高低水平。
[0027] ELISA檢測人血清中的CHIP表達水平是結合在固相載體(如96孔板)表面的抗體 仍保持其免疫活性，受檢標本中的抗原可以與固相載體表面的抗體發(fā)生抗原抗體反應，用 洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體符合物與液體中的其他物質分開，再加入酶標記 的抗體，使之也通過反應而結合在固體載體上。此時固相上的酶含量即與標本中受監(jiān)測物 質的量呈正比，通過酶催化的底物顏色即可確定標本中抗原的含量。
[0028] 本部分實驗主要通過免疫組化研究CHIP在胰腺癌組織和癌旁組織中的表達水 平，通過CHIP的表達水平與臨床指標的聯(lián)系尋找可能影響預后的因素，通過CHIP表達水平 與總生存期和無瘤生存期觀察其是否可以作為預測預后的指標；通過在正常人和不同患者 血清中CHIP表達水平的差異觀察其是否可以作為胰腺癌鑒別診斷的有效腫瘤學標志物。
[0029] 實施例1、實驗材料的采集
[0030] 1、組織病理標本：
[0031] 收集北京協(xié)和醫(yī)院2006年1月至2010年7月收治的經(jīng)病理檢查確診的胰腺導管 腺癌的病例標本，標本于北京協(xié)和醫(yī)院基本外科-80°C標本庫保存。研究樣本的納入和排除 標準如下：
[0032] 1)納入標準：病理診斷為胰腺導管腺癌的標本，行手術切除的病例。
[0033] 2)排除標準：未行腫瘤切除，或僅行胰腺組織活檢；病例資料不完整，無法獲得隨 訪信息；標本無法制備成免疫組化切片。
[0034] 本次共有58例胰腺癌患者被納入本次研究，其中男性25人，女性33人，男女比例 為1:1. 32 ;年齡< 65歲者38例，> 65歲者20例；位于胰頭者36例，位于胰體尾者22例； 低分化者25例，高中分化者33例；腫瘤--Μ分期1-2期44例，3-4期14例；R0切除者47 例，R1切除11例。所有患者在術前均未接受放化療或免疫治療。本項研究已經(jīng)獲得北京 協(xié)和醫(yī)院倫理委員會的批準。
[0035] 2、血清標本：
[0036] 收集北京協(xié)和醫(yī)院2008年1月至2012年1月進行檢查的健康志愿者47例，經(jīng)臨 床診斷為慢性胰腺炎患者的血標本18例，經(jīng)病理檢查確診為胰腺良性腫瘤的血標本29例， 經(jīng)病理檢查確診為胰腺內(nèi)分泌腫瘤的血標本19例，經(jīng)病理檢查確診為胰腺導管腺癌患者 的血標本47例。行手術患者其血清樣品均為手術如獲取樣品，標本保存于北點協(xié)和醫(yī)院基 本外科-80°C冰箱中。研究樣本的納入和排除標準如下：
[0037] 1)納入標準：
[0038] 健康志愿者：無肝炎，結核，慢性炎癥以及腫瘤的健康人群。
[0039] 慢性胰腺炎：根據(jù)內(nèi)外分泌不足的臨床癥狀和體征、影像學診斷作為臨床診斷納 入標準。
[0040] 胰腺良性腫瘤：包括漿液性囊性腫瘤，粘液性囊性腫瘤，導管內(nèi)乳頭狀粘液性腫 瘤，實性假乳頭性腫瘤患者。
[0041] 胰腺內(nèi)分泌腫瘤：包括胰島素瘤和胰腺內(nèi)分泌癌患者。
[0042] 胰腺癌：胰腺導管腺癌患者，包括未手術切除僅行病理穿刺確診患者。
[0043] 2)排除標準：伴有肝炎，膽囊炎或其他合并癥；血清標本發(fā)生降解；術后獲取的血 清樣品；病例資料不完整，無法獲得隨訪息。
[0044] 本項研究已經(jīng)獲得北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會的批準。
[0045] 實施例2、實驗方法
[0046] 采用本領域公知的技術進行組織蛋白的提取、組織蛋白SDS-PAGE和 Westernblot、免疫組化檢測、ELISA檢測人血清中的CHIP表達水平。其中CHIP蛋白的 ELISA試劑盒購自武漢華美生物有限公司，試劑盒號CBS-EL022887HU。
[0047] 免疫組化結果的判定如下：
[0048] 按染色陽性細胞百分比分為四個等級
[0049] -陰性
[0050] +< 30%陽性細胞數(shù)
[0051] ++30-60%陽性細胞數(shù)
[0052] +++>60%陽性細胞數(shù)
[0053] 以陽性細胞百分比為60%分為CHIP低表達和CHIP高表達兩組。評分由兩位病理 科醫(yī)師獨立完成。
[0054] 統(tǒng)計分析：
[0055] 對于計數(shù)資料采用卡方檢驗（Chi-square test)或Fisher精確檢驗；單因素分析 用Log-rank檢驗組間生存曲線差異，多因素分析采用Cox比例風險回歸模型分析相對危險 度；Kaplan-Meier法進行生存時間分析；采用R0C曲線評估指標的診斷價值以及診斷敏感 性和特異性。統(tǒng)計軟件采用SPSS13. 0,取p〈0. 05為有統(tǒng)計學差異。采用Graphpad Prism5. 0 進行統(tǒng)計作圖。
[0056] 實施例3、實驗結果
[0057] 1 )、SDS-PAGE和Western blot檢測CHIP和Hsp70在胰腺癌和癌旁組織的表達水 平
[0058] 結果發(fā)現(xiàn)，CHIP在第一和第三例病人中的胰腺癌組織中表達水平是升高的，在第 二和第四例病人中表達水平明顯降低。Hsp70表達水平差別并不明顯，第一例和第三例患者 表達水平升高，第二例表達水平無明顯差異，第四例表達水平降低。（圖1)
[0059] 2)、免疫組化檢測CHIP蛋白在胰腺癌組織和癌旁組織的表達水平
[0060] CHIP蛋白表達主要在胞漿中，表現(xiàn)為淡黃色至深棕色。癌旁組織CHIP蛋白陰性表 達37例，有表達21例。癌組織陰性表達19例，有表達39例。胰腺癌組織中CHIP表達水 平明顯高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學意義。（P=〇. 001)。（圖2)
[0061] 3)、人胰腺癌組織中CHIP表達水平與臨床特征的關系
[0062] 以陽性細胞百分比60%分為低表達和高表達組，進行免疫組化染色進行評分和統(tǒng) 計學分析。結果發(fā)現(xiàn)，CHIP表達水平與N分期有相關性，p=0. 041，胰腺癌中低表達CHIP發(fā) 生淋巴結轉移的風險是高表達CHIP發(fā)生淋巴結轉移風險的3. 06倍。另外，CHIP表達水平 也與術后腫瘤轉移有相關性，P=〇. 01，低表達CHIP發(fā)生術后轉移的風險是高表達CHIP發(fā)生 術后轉移的4. 18倍。CHIP表達和性別、年齡、腫瘤部位、手術方式、腫瘤分化程度、是否根治 切除、T分期、遠處轉移、術后是否復發(fā)并無相關性。
[0063] 表1胰腺癌組織CHIP蛋白表達水平與臨床指標的相關性
[0064]

【權利要求】
1. CHIP蛋白標志物在制備用于診斷膜腺癌患者的試劑盒中的用途。
2. 根據(jù)權利要求1的用途，其中所述的CHIP蛋白標志物作為區(qū)分正常人、慢性胰腺炎 和胰腺癌患者的有效的血清學標志物。
3. 根據(jù)權利要求1的用途，其中所述的CHIP蛋白標志物作為區(qū)分正常人、胰腺良性腫 瘤和胰腺癌患者的有效的血清學標志物。
4. 根據(jù)權利要求1的用途，其中所述的CHIP蛋白標志物作為區(qū)分胰腺良性腫瘤、胰腺 內(nèi)分泌腫瘤與正常人的有效的血清學標志物。
5. 根據(jù)權利要求1-4任一項所述的用途，其中將所述試劑盒用于ELISA方法中。
6. -種CHIP蛋白在制備用于評估胰腺癌患者預后的試劑盒中的用途。
7. 根據(jù)權利要求6所述的用途，其中CHIP蛋白高表達患者預后相對較好。
【文檔編號】G01N33/68GK104142403SQ201310172510
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2013年5月10日 優(yōu)先權日:2013年5月10日
【發(fā)明者】趙玉沛, 張?zhí)? 王天笑, 由磊, 周立, 廖泉, 戴夢華, 舒紅, 徐建威, 李建, 曹喆 申請人:中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院