一種檢測細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種檢測細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的方法，包括步驟：（1）利用甲硫氨酸類似物將細胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)的甲硫氨酸標(biāo)記上疊氮小分子基團，（2）在不同的時間點裂解細胞，通過CuAAC反應(yīng)將特定的可被識別的分子偶聯(lián)在蛋白質(zhì)的疊氮小分子基團上，（3）在反應(yīng)體系中直接利用均相時間分辨熒光共振原理（HTRF）對偶聯(lián)了步驟（2）中可被識別的分子的目標(biāo)蛋白進行定量，從而確定目標(biāo)蛋白的降解速率。本方法無需同位素或細胞毒素的蛋白質(zhì)降解測量新方法，并達到了與高通量篩選兼容，可用于醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)界篩選疾病蛋白降解相關(guān)藥物，以及學(xué)術(shù)界對特定蛋白降解相關(guān)信號通路的篩選等。
【專利說明】一種檢測細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生物化學(xué)領(lǐng)域，涉及檢測細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的方法，具體涉及一種基于 CuAAC反應(yīng)及能量轉(zhuǎn)移均相時間分辨熒光共振的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 本領(lǐng)域公知，蛋白質(zhì)降解其相關(guān)參數(shù)（降解速度及半衰期等）對理解蛋白質(zhì)功 能、小分子調(diào)控物對蛋白的預(yù)期作用、以及針對特定疾病蛋白的降解研發(fā)藥物有著重要 意義。目前，研究報道的蛋白質(zhì)降解途徑主要有蛋白酶體降解以及溶酶體降解兩種途 徑。研究顯示，蛋白質(zhì)通過上述兩種途徑的降解異常時，均可能產(chǎn)生疾病。例如，多種神 經(jīng)退行性疾?。ㄈ绾嗤㈩D病等）由變異蛋白的錯誤折疊及不正常降解引起，而增強溶酶體 或蛋白酶體對疾病蛋白的降解在疾病細胞及動物模型中顯示出可以有效的治療這些疾病 [Boxun Lu, Ismael Al-Ramahi, Antonio Valencia, Qiong Wang, Frada Berenshteyn, Haidi Yang, Tatiana Gallego-Flores， Salah Ichcho， Arnaud Lacoste， Marc Hild， Marian DiFiglia, Juan Botas & James Palacino， Identification of NUB1 as a suppressor of mutant Huntingtin toxicity via enhanced protein clearance, NATURE NEUROSCIENCE 16，562 - 570，May 2013]。近年來，有多項研究表明，溶酶體降解的不正常， 是導(dǎo)致多種癌癥的原因之一 [Maria H0yer_Hansen and Marja Autophagy: An emerging target for cancer therapy, AUTOPHAGY 4(5), 574-580, 2008]〇
[0003] 經(jīng)典的蛋白質(zhì)降解檢測方法主要利用同位素35S標(biāo)記進行脈沖-示蹤實驗 (Pulse-chase)。其原理在于，利用同位素 35S標(biāo)記新合成的蛋白，之后通過目標(biāo)蛋白的抗體 沉淀目標(biāo)蛋白，再通過電泳膠上分離得到目標(biāo)蛋白的位置，最后通過同位素信號強弱隨時 間變化追蹤被標(biāo)記目標(biāo)蛋白的降解。實踐顯示，該經(jīng)典的蛋白質(zhì)降解檢測方法其存在的主 要缺陷有：一、需要利用同位素，因此，對實驗人員健康及安全有一定影響，并對實驗室要求 較高；二、操作流程復(fù)雜，需要免疫沉淀、電泳分離等高通量不兼容的實驗步驟，使得利用此 方法進行針對蛋白降解的高通量篩選變得不可能；三、由于免疫沉淀的效率受諸多因素影 響，此方法對蛋白降解速率的定量在很多情況下噪音很大，定量不精確。
[0004] 近年來有研究利用蛋白質(zhì)翻譯阻斷劑放線菌酮研究蛋白降解，其優(yōu)點是操作方 便，并且有可能進行高通量篩選；但，仍存在如下缺陷：一、放線菌酮阻斷所有蛋白翻譯，非 特異性強；二、放線菌酮具有很高的細胞毒性，處理9個小時即導(dǎo)致大規(guī)模細胞死亡，因此， 不適用于降解速度較慢的蛋白；而另一方面，事實上很多神經(jīng)退行性疾病蛋白降解緩慢。
[0005] 近年來有研究公開了 CuAAC 反應(yīng)（copper-catalyzed azide-alkyne cycloadditions [])被發(fā)現(xiàn)可以用于標(biāo)記細胞內(nèi)新合成蛋白，并用于研究細胞內(nèi)蛋白降解 [Boxun Lu, Ismael Al-Ramahi, Antonio Valencia, Qiong Wang, Frada Berenshteyn, Haidi Yang, Tatiana Gallego-Flores， Salah Ichcho， Arnaud Lacoste， Marc Hild， Marian DiFiglia， Juan Botas & James Palacino， Identification of NUB1 as a suppressor of mutant Huntingtin toxicity via enhanced protein clearance, NATURE MWOStTBVCF 16，562 - 570,May 2013]。然而，其所用的操作流程與傳統(tǒng)脈沖-示蹤實驗 相似，只是利用了疊氮小分子基團代替了同位素35S標(biāo)記，因此，仍然還是不能做到高通量 及精確定量。鑒于現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，本申請的發(fā)明人擬提供一種新的研究蛋白質(zhì)降解的有 效方法，以達到可以進行非同位素依賴的，高精度的，并與高通量篩選兼容的蛋白質(zhì)降解測 量。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種新的研究蛋白質(zhì)降解的有 效方法，具體涉及一種檢測細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的方法，尤其涉及一種基于CuAAC反應(yīng)及能 量轉(zhuǎn)移均相時間分辨熒光共振的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的檢測方法。該方法可以進行非同位素 依賴的，高精度的，并與高通量篩選兼容的蛋白質(zhì)降解測量。
[0007] 本發(fā)明的方法依據(jù)如下原理：利用L-azidohomoalanine和CuAAC反應(yīng)，將特定 時間點被標(biāo)記而未被降解的蛋白標(biāo)記上特定的可被識別的分子(例如生物素）；之后，再利 用與偶聯(lián)的分子特異性結(jié)合的識別化合物(例如與生物素特異性結(jié)合的鏈霉親和素)，在反 應(yīng)中加入熒光基團標(biāo)記了的識別化合物和目標(biāo)蛋白抗體，利用均相時間分辨熒光共振原理 (HTRF)，對生物素分子偶聯(lián)的目標(biāo)蛋白進行定量。
[0008] 具體的，本發(fā)明的一種檢測細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的方法，其包括步驟： (1) 將細胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)的甲硫氨酸標(biāo)記上疊氮小分子基團； (2) 在降解過程中的不同時間點，利用CuAAC反應(yīng)將特定的可被識別的分子偶聯(lián)在蛋 白質(zhì)的疊氮小分子基團上； (3) 利用均相時間分辨熒光共振原理（HTRF)對偶聯(lián)了步驟（2)中可被識別的分子的 目標(biāo)蛋白進行定量，從而確定目標(biāo)蛋白的降解速率。
[0009] 更具體的，本發(fā)明的一種檢測細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的方法，其特征在于，其包括步 驟： (1) 利用甲硫氨酸類似物L(fēng)-azidohomoalanine將細胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)的甲硫氨酸 標(biāo)記上疊氮小分子基團； (2) 洗去細胞外的L-azidohomoalanine后，在不同的時間點裂解細胞，通過CuAAC反 應(yīng)將特定的可被識別的分子(例如生物素）偶聯(lián)在未降解的被標(biāo)記了的蛋白質(zhì)的疊氮小分 子基團上； (3) 在反應(yīng)體系中加入熒光共振基團標(biāo)記了的目標(biāo)蛋白抗體以及識別化合物，利用均 相時間分辨熒光共振原理高通量高精度特異性地對目標(biāo)蛋白進行定量，從而確定目標(biāo)蛋白 的降解速率。
[0010] 本發(fā)明中，所述的識別化合物是指，能特異性地結(jié)合步驟（2)中通過CuAAC反應(yīng)偶 聯(lián)的分子基團的化合物(例如識別生物素的鏈霉親和素)。
[0011] 本發(fā)明中，可用的熒光共振包括，含稀土族元素鋱或銪的熒光供體標(biāo)記的目標(biāo)蛋 白抗體，以及XL665或D2熒光受體標(biāo)記的鏈霉親和素,或含稀土族元素試或銪的熒光供體 標(biāo)記的鏈霉親和素，以及XL665或D2熒光受體標(biāo)記的目標(biāo)蛋白抗體。
[0012] 本發(fā)明所需和各種生化試劑均可通過市購渠道在多家生物及化學(xué)公司購得，亦可 人工合成。
[0013] 本發(fā)明中，以生物素和與之特異性結(jié)合的鏈酶親和素為例，進一步闡明本發(fā)明的 原理及步驟： 首先，利用甲硫氨酸類似物L(fēng)-azidohomoalanine將細胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)的甲硫氨 酸標(biāo)記上疊氮小分子基團，將細胞在無 L-甲硫氨酸的培養(yǎng)液中培養(yǎng)一小時后，耗盡胞內(nèi)處 于自由狀態(tài)的甲硫氨酸，之后，加入L-azidohomoalanine將細胞內(nèi)新合成蛋白中的L-甲硫 氨酸均替換成L-azidohomoalanine，達到將細胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)標(biāo)記上疊氮小分子基團 的效果；該步驟中，可使用于各種細胞； 其次，利用培養(yǎng)液的更換，洗去細胞外的L-azidohomoalanine，由此，含有疊氮小分子 基團的蛋白不斷被細胞降解，而培養(yǎng)液更換后新合成的蛋白則不會被重新標(biāo)記；之后，在不 同的時間點裂解細胞，通過CuAAC反應(yīng)將生物素分子偶聯(lián)在未降解的被標(biāo)記了的蛋白質(zhì)的 疊氮小分子基團上，用于下一步的檢測； 第三，利用高通量藥篩常用的均相時間分辨熒光共振原理（HTRF)對未降解的被標(biāo)記了 的目標(biāo)蛋白進行高通量的、高精度的、特異性的定量，從而準(zhǔn)確的檢測蛋白降解。
[0014] 本發(fā)明中，HTRF的原理在于利用含稀土族元素鋱或銪的熒光供體及XL665或D2熒 光受體在空間距離足夠接近時(約8納米）會產(chǎn)生穩(wěn)定的時間分辨熒光共振信號，被特定儀 器檢測（如PerkinElmer生產(chǎn)的Envision等）。
[0015] 本發(fā)明的方法中，將目標(biāo)蛋白的抗體和特異性結(jié)合生物素的鏈霉親和素分別標(biāo)記 上熒光供體及熒光受體，或者反之；由此，僅有既被生物素標(biāo)記，又能被目標(biāo)蛋白抗體特異 性結(jié)合的蛋白，產(chǎn)生熒光共振信號(如圖2所示)，達到測量被標(biāo)記蛋白降解速率的目的。本 發(fā)明的方法中，盡管從理論上說，與目標(biāo)蛋白結(jié)合的蛋白會對信號產(chǎn)生一定的干擾，但是由 于熒光共振所學(xué)空間距離很近，隨距離增加衰減很快，所以，通過結(jié)合蛋白間接產(chǎn)生的熒光 共振信號很弱，通常，大多數(shù)情況下影響不大。
[0016] 本方法的顯著效果和優(yōu)點在于： 可以進行非同位素依賴的，高精度的，并與高通量篩選兼容的蛋白質(zhì)降解測量，可用于 醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)界篩選疾病蛋白降解相關(guān)藥物，以及學(xué)術(shù)界對特定蛋白降解相關(guān)信號通路的篩選 等。
[0017] 該方法在多個方面明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的測量細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的方法。
[0018] 為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發(fā)明的一種檢測細胞內(nèi)蛋白 質(zhì)降解的方法進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，顯然本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明做出各種各樣的修正 和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1是，甲硫氨酸類似物L(fēng)-azidohomoalanine，L-甲硫氨酸的結(jié)構(gòu)圖。
[0020] 圖2是，將目標(biāo)蛋白的抗體和特異性結(jié)合生物素的鏈霉親和素分別標(biāo)記上熒光供 體及熒光受體，或者反之，產(chǎn)生的僅有既被生物素標(biāo)記，又能被目標(biāo)蛋白抗體特異性結(jié)合的 蛋白，產(chǎn)生熒光共振信號。

【具體實施方式】
[0021] 實施例1疊氮小分子基團對細胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)的甲硫氨酸標(biāo)記 在實驗小鼠的STHdh等多種細胞中，甲硫氨酸是合成蛋白質(zhì)的必需氨基酸。 L-azidohomoalanines是一種帶有疊氮基的甲硫氨酸類似物。在數(shù)個培養(yǎng)皿中鋪上相 同數(shù)目的細胞，用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時，移去完全培養(yǎng)液，用PBS洗一次。使用購自 Life Technologies公司不含甲硫氨酸的培養(yǎng)液對細胞進行一小時饑餓處理，使細胞內(nèi)原 有的甲硫氨酸完全消耗，然后加入帶有疊氮基的甲硫氨酸類似物L(fēng)-azidohomoalanine， 使培養(yǎng)液中其終濃度為1%。，培養(yǎng)12小時，該12小時中細胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)被 L-azidohomoalanine標(biāo)記，從而帶有疊氮基；12小時后收取第一個時間點的細胞，并將 其余培養(yǎng)皿中的細胞用PBS洗后換成完全培養(yǎng)液；之后，隔一定時間收取一皿細胞，收到 的細胞在冰上用裂解液（1% SDS in 50mM Tris-HCl, pH 8.0 with EDTA-free cocktail protease inhibitor)裂解30分鐘，10%功率超聲裂解產(chǎn)物10s, Vortex震蕩產(chǎn)物5分 鐘，18000g離心5分鐘，對上清進行蛋白定量；得到在同一時間點被疊氮基標(biāo)記，降解時間 可控，能反映一定時間長度內(nèi)蛋白降解情況的蛋白樣品。
[0022] 實施例2 通過CuAAC反應(yīng)將生物素分子偶聯(lián)在蛋白質(zhì)的疊氮小分子基團上： CuAAC反應(yīng)是指銅催化疊氮化物和端基炔發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)，利用銅離子催化標(biāo)記了疊 氮基團而未被降解的蛋白質(zhì)的疊氮基團與帶有生物素的端基炔反應(yīng)，實現(xiàn)蛋白質(zhì)被生物素 記。
[0023] 按照購自Life Technologies公司的Click-iT Reaction Kit的具體操作步驟 進行反應(yīng)。在EP管中加入最多50uL蛋白裂解液(蛋白質(zhì)量上限為200ug)，加入100uL Click一iT reaction buffer,加水補至總體積 160uL, Vortex 震蕩 5s，加入 10uL Click-iT Component B(CuS04), Vortex 震蕩 5s,力口入 lOuL click it reaction buffer additive 1, Vortex 震蕩 5s，放置 2-3 min,但不超過 5 min,加入 20uL Click-iT reaction buffer additive 2，Vortex震蕩5s，將EP管置于旋轉(zhuǎn)混合儀上旋轉(zhuǎn)20 min反應(yīng)，反應(yīng)完成后在 實施例1中被疊氮基標(biāo)記而未降解的蛋白質(zhì)被生物素標(biāo)記，在不同的時間點取得蛋白裂解 液，用于測量不同時間點降解所剩蛋白的蛋白量。
[0024] 實施例3 利用均相時間分辨熒光共振原理對生物素分子偶聯(lián)的目標(biāo)蛋白進行定量： 鏈霉親和素（Streptavidin)和生物素（Biotin)具有特異性結(jié)合的性質(zhì)，在反應(yīng)中 加入熒光基團標(biāo)記了的鏈霉親和素和目標(biāo)蛋白抗體，利用均相時間分辨熒光共振原理 (HTRF)，對未降解而被標(biāo)記了的目標(biāo)蛋白進行1?通量、1?精度、特異性的定量，從而準(zhǔn)確地 檢測蛋白降解。
[0025] 在384孔板中加入含有一定量被生物素標(biāo)記的蛋白樣，加入溶解在含400 mM氟離 子緩沖液中的含有熒光受體D2標(biāo)記的鏈霉親和素（Str印tavidin-D2, L 4 ng/μ 1)和鋱穴 狀化合物（Terbium Cryptate)標(biāo)記的目標(biāo)蛋白特異性抗體（2B7-Tb，0. 023 ng/μ 1)，孵育 1?2小時候后在PerkinElmer Envision儀器上檢測突光共振信號，只有既被生物素標(biāo)記， 又能被目標(biāo)蛋白抗體特異性結(jié)合的蛋白，才會產(chǎn)生熒光共振信號，由此，可根據(jù)不同降解時 長蛋白樣的熒光共振信號可以定量反映蛋白降解速度。
【權(quán)利要求】
1. 一種檢測細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的方法，其特征在于，其包括步驟： (1) 將細胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)的甲硫氨酸標(biāo)記上疊氮小分子基團； (2) 在降解過程中的不同時間點，利用CuAAC反應(yīng)將特定的可被識別的分子偶聯(lián)在蛋 白質(zhì)的疊氮小分子基團上； (3) 利用均相時間分辨熒光共振原理（HTRF)對偶聯(lián)了步驟（2)中可被識別的分子的目 標(biāo)蛋白進行定量，從而確定目標(biāo)蛋白的降解速率。
2. 按權(quán)利要求1所述的檢測細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的方法，其特征在于，所述的步驟（1) 中，利用甲硫氨酸類似物L(fēng)-azidohomoalanine將細胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)的甲硫氨酸標(biāo)記 上疊氮小分子基團。
3. 按權(quán)利要求1所述的檢測細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的方法，其特征在于，所述的步驟（2) 中，洗去細胞外的L-azidohomoalanine后，在不同的時間點裂解細胞，通過CuAAC反應(yīng)將特 定的可被識別的分子偶聯(lián)在未降解的被標(biāo)記了的蛋白質(zhì)的疊氮小分子基團上。
4. 按權(quán)利要求1所述的檢測細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的方法，其特征在于，所述的步驟（3) 中，在反應(yīng)體系中加入熒光共振基團標(biāo)記了的目標(biāo)蛋白抗體以及識別化合物，利用均相時 間分辨熒光共振原理高通量高精度特異性地對目標(biāo)蛋白進行定量，從而確定目標(biāo)蛋白的降 解速率。
5. 按權(quán)利要求3所述的檢測細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的方法，其特征在于，所述的可被識別 的分子是生物素。
6. 按權(quán)利要求3所述的檢測細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的方法，其特征在于，所述的識別化合 物是，能特異性地結(jié)合步驟（2)中通過CuAAC反應(yīng)偶聯(lián)的分子基團的化合物。
7. 按權(quán)利要求3所述的檢測細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的方法，其特征在于，所述的識別化合 物是識別生物素的鏈霉親和素。
8. 按權(quán)利要求4所述的檢測細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的方法，其特征在于，所述方法中，可用 的突光共振包括，含稀土族元素試或銪的突光供體標(biāo)記的目標(biāo)蛋白抗體，以及XL665或D2 熒光受體標(biāo)記的鏈霉親和素，或含稀土族元素試或銪的熒光供體標(biāo)記的鏈霉親和素，以及 XL665或D2突光受體標(biāo)記的目標(biāo)蛋白抗體。
【文檔編號】G01N21/64GK104155452SQ201310179334
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年5月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月15日
【發(fā)明者】魯伯塤, 崔笑添 申請人:復(fù)旦大學(xué)