專利名稱：一種檢測土壤中痕量井岡霉素a的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測土壤中痕量井R霉素A的方法，具體涉及一種利用大孔強酸性陽離子交換樹脂富集土壤中井R霉素A，以緩沖溶液和乙醇除雜，再利用非極性大孔吸附樹脂除去非極性雜質后采用常規(guī)反相柱進行痕量井R霉素A等度洗脫分析的方法，屬于土壤中農藥殘留分析領域。
背景技術：
井岡霉素是我國獨立開發(fā)研制的生物源殺菌劑，主要用于抑制水稻紋枯菌的生長，對蔬菜、棉花等其它農作物的立枯病也有很好的防治效果，是至今為止我國最廉價且使用面積最廣的一種農用抗生素，是農民非常信賴的產品之一。井R霉素A是井R霉素中最具活性的物質，分子中含有多個極性基團，難于氣化，不能直接進行氣相色譜分析。由于井R霉素的吸光能力弱，其最大吸收波長為210 nm，在此波長下測定，基質中的雜質極易產生干擾，而熒光檢測技術由于受到衍生條件的限制，重現(xiàn)性和再現(xiàn)性較差。張存政等(南京農業(yè)大學學報，2005，28(1): 107-110)將5 g新鮮稻葉以90%的甲醇提取，經C18固相萃取小柱凈化后，在210 nm波長下，對水稻葉片中的井岡霉素殘留量進行了分析，以2倍信噪比計算得井R霉素的最低檢出量為0.46 ng，最低檢出限為0.92 mg/kg。一方面，該法需要用比較昂貴的C18固相萃取小柱對樣品溶液進行凈化，另一方面，以甲醇:Na2HPO4 (pH=7) = 2: 98 (V: V)為流動相進行HPLC分析，經過C18固相萃取小柱凈化的樣品溶液中仍然有較多的極性較低的物質會殘留在色譜分析柱上，污染分析柱。馬婧瑋等(農藥，2007，46(10): 686-687)采用 Venusil HILIC 柱，在 210 nm波長下，以乙腈-水為流動相，建立了井R霉素A的反相高效液相色譜梯度洗脫分析方法，方法的精密度高，但需要用高含量的乙腈。余曉江等(現(xiàn)代農藥，2011，10(2): 37-39)將大米和谷殼分別以10%的氨水 和90%的甲醇提取，經C18固相萃取小柱凈化后，在親水C18柱上，以210 nm為檢測波長，對大米和谷殼中的井岡霉素殘留量進行了分析，井岡霉素的最低檢出量為0.5 ng,大米和谷殼中井R霉素的最低檢測濃度均為0.2 mg/kg。關文碧等(分析科學學報，2012，28(4): 136-138)以90%甲醇為提取溶劑，采用HPLC-MS/MS法測定了稻米和谷殼中的井岡霉素殘留量，雖然靈敏度很高，定量限為0.005 mg/kg，但必須要使用液質聯(lián)用儀。上述分析方法中，有的需要使用大量昂貴的色譜試劑乙腈，有的必須要經過一次性的固相萃取小柱進行樣品凈化，有的則必須要用液質聯(lián)用儀，成本非常高。為此，需要一個成本低廉且不需要使用大量有毒試劑的、對痕量井R霉素A進行富集、凈化和測定的方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是在于提供一種檢測土壤中痕量井R霉素A的方法。本發(fā)明提供了一種檢測土壤中痕量井R霉素A的方法，具體操作步驟如下:(1)提取:稱取40.0 g含有0.05 1.00 mg/kg井岡霉素的土壤樣品，以40 mL緩沖溶液超聲提取15 min后,經過布氏漏斗減壓抽濾或離心15 min,再分別用30 mL、30 mL緩沖液洗漆殘洛、抽濾瓶或離心管，合并清液，用鹽酸或氫氧化鈉調節(jié)提取液的pH值；
(2)富集:量取30mL經過預處理的陽離子交換樹脂于玻璃層析柱中，以60 mL pH 3.5的磷酸鹽緩沖液平衡后，將提取液上樣于層析柱中進行吸附富集；
(3)去雜:分別用pH3.5的磷酸鹽緩沖溶液和乙醇淋洗去除雜質；
(4)洗脫:用6(T175mL洗脫劑進行洗脫；
(5)凈化:將步驟(4)的洗脫液以不高于60°C的溫度，在旋轉蒸發(fā)儀上濃縮至約30mL，加入10 g左右非極性大孔吸附樹脂振搖，過濾，用20 mL pH 7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌樹脂2次，過濾，合并濾液，在60°C下旋蒸近干，再用氮氣或空氣吹干，定量加入2.00 mLNa2HPO4-KH2PO4緩沖溶液(ρΗ7.0)超聲溶解；
(6)檢測:將樣品溶液按下述色譜操作條件進行檢測=LC-1OAtvp型高效液相色譜儀(日本島津公司生產，帶液相色譜工作站和紫外檢測器)，色譜柱:Aligent C18 plus柱(4.6 X 250 mm, 5Mm)，流動相:甲醇=Na2HPO4-KH2PO4 緩沖溶液(ρΗ7.0) = 2:98 (V:V)，流速:0.6 mL/min，檢測波長:210 nm，柱溫:35°C，進樣量:20 μ L ;
(7)回收:將使用過的陽離子交換樹脂和非極性樹脂經過5%HCl和5% NaOH處理后回收再利用。步驟(I)中所述的緩沖溶液為濃度0.05、.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，pH值為
6.0 9.0 ;離心速度為3000^15000 r/min ;清液的pH值為2.5 7.5。步驟(2)中所述的陽離子交換樹脂為D072大孔強酸性陽離子交換樹脂(南開和成科技有限公司，使用前用4%HCl、4%NaOH和乙醇預處理)，提取液上樣速度為0.3^1.0 mL/min。步驟(3)中所述pH 3.5磷酸鹽緩沖溶液濃度為0.θΓθ.1 mol/L,所用體積為60 200 mL,乙醇體積為60 200 mL,淋洗速度為0.5 1.0 mL/min。步驟(4)所述洗脫劑是選自以下溶劑中的一種:1 mol/L氨水，1.5 mol/L氨水,2mol/L氨水，I mol/L氨水:乙醇=1: 1，2: 1，3:1和4:1 (均為體積比)，洗脫速度為0.5 1.0mL/minο步驟(5)中所述的非極性大孔吸附樹脂為x-5 (南開和成科技有限公司，使用前用5%HCl、5%Na0H、丙酮和乙醇預處理)，振搖時間為20 mirTl h。技術效果:
1.本發(fā)明方法中所用D072樹脂和X-5樹脂非常便宜，在井R霉素的富集、除雜、洗脫和凈化過程中不需要使用有毒的試劑；
2.本發(fā)明方法操作簡單，不需要使用昂貴的一次性固相萃取小柱進行樣品凈化或液質聯(lián)用儀器可以在普通的反相液相色譜柱上實現(xiàn)井網(wǎng)霉素的等度洗脫，既節(jié)約了成本，又避免了梯度洗脫造成的基線漂移；
3.本發(fā)明的準確度高，精密度好，檢測限低。稻田土壤的空白添加回收率在70.359Γ96.44%之間，相對標準偏差為7.1% 9.8%，最低檢出限為0.01 mg/kg。井岡霉素添加回收率和相對標準偏差均在農藥殘留試驗準則允許的范圍內，符合農藥殘留量分析與檢測的技術要求，可以應用于土壤中痕量井網(wǎng)霉素A的分析檢測。


:
圖1是井網(wǎng)霉素A標樣色譜圖，Y為井網(wǎng)霉素A鋒；
圖2是稻田土壤空白色譜 圖3是稻田土壤添加未經X-5凈化的色譜圖，Y為井R霉素A鋒；
圖4是稻田土壤添加經過X-5凈化后的色譜圖，Y為井R霉素A鋒。
具體實施例方式下面，本發(fā)明將用實施例進行進一步的說明，但是它并不限于這些實施例的任一個或類似實例。供試土壤:供試土壤為潮土、紅壤和紫色土 3種土壤。其pH值和有機質含量分別% 6.2,2.13%、6.5，2.32% 和 6.2，2.02%。實施例1:
稱取河潮土空白樣品40.0 g于250 mL具塞三角瓶中，準確加入井岡霉素標準溶液，使其在土壤中的添加濃度為0.05 mg/kg，加入40 mL Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液(ρΗ7.0)超聲提取15 min,離心(15000 r/min) 15min,再分別用30 mL、30 mL pH 7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌殘渣和離心管，合并清液，用稀鹽酸和氫氧化鈉調節(jié)至PH 3.5后，以0.3 mL/min的速度上樣于D072柱。依次用150 mL磷酸鹽緩沖溶液(ρΗ3.5)和125 1^乙醇以0.6 mL/min的淋洗速度淋洗去 除雜質，用100 mL I mol/L氨水:乙醇=4:1洗脫，收集洗脫液，在60°C下旋蒸濃縮至約30 mL,加入10 g左右X-5樹脂振搖30 min,過濾,再用20 mL pH7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌樹脂2次，過濾，合并濾液，濃縮至近干，用氮氣或空氣吹干，定量加入2.00mL Na2HPO4-KH2POJ^沖溶液(PH7.0)超聲溶解，按步驟(6)所述色譜操作條件進行HPLC檢測。5次平行測定的回收率分別為:72.64%、78.57%、76.13%、87.27%和82.02%，平均回收率為79.33%，相對標準偏差為7.1%。井岡霉素標樣色譜圖見圖1，稻田土壤空白色譜圖見圖2，稻田土壤添加未經X-5凈化的色譜圖見圖3 ;稻田土壤添加經過X-5凈化后的色譜圖見圖4。實施例2:
稱取紅壤土空白樣品40.0 g于250 mL具塞三角瓶中，準確加入井岡霉素標準溶液，使其在土壤中的添加濃度為0.50 mg/kg，加入40 mL Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液(ρΗ7.0)超聲提取15 min,離心(15000 r/min) 15min,再分別用30 mL、30 mL pH 7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌殘渣和離心管，合并清液，用稀鹽酸和氫氧化鈉調節(jié)至PH 3.5后，以0.8 mL/min的速度上樣于D072柱。依次用150 mL磷酸鹽緩沖溶液(ρΗ3.5)和125 1^乙醇以0.6 mL/min的淋洗速度淋洗去除雜質，用100 mL I mol/L氨水:乙醇=4:1洗脫，收集洗脫液，在60°C下旋蒸濃縮至約30 mL,加入10 g左右X-5樹脂振搖40 min,過濾,再用20 mL pH7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌樹脂2次，過濾，合并濾液，濃縮至近干，用氮氣或空氣吹干，定量加入2.00mL Na2HPO4-KH2POJ^沖溶液(PH7.0)超聲溶解，按步驟(6)所述色譜操作條件進行HPLC檢測。5次平行測定的回收率分別為:92.11%、78.97%、87.17%、76.63%和96.44%，平均回收率為86.26%，相對標準偏差為9.8%。實施例3:
稱取紫色土空白樣品40.0g于250 mL具塞三角瓶中，準確加入井R霉素標準溶液，使其在土壤中的添加濃度為1.00 mg/kg，加入40 mL Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液(ρΗ7.0)超聲提取15 min，減壓抽濾，再分別用30 mL、30 mL pH 7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌殘渣和抽濾瓶，合并濾液，用稀鹽酸和氫氧化鈉調節(jié)至pH 3.5后，以0.6 mL/min的速度上樣于D072柱。依次用150 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH3.5)和125 mL乙醇以0.6 mL/min的淋洗速度淋洗去除雜質，用100 mLl mol/L氨水:乙醇=4:1洗脫,收集洗脫液,在60°C下旋蒸濃縮至約30 mL,加入10 g左右X-5樹脂振搖I h，過濾，再用20 mL pH7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌樹脂2次，過濾，合并濾液，濃縮至近干，用氮氣或空氣吹干，定量加入2.00 mL Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液(PH7.0)超聲溶解，按步驟(6)所述色譜操作條件進行HPLC檢測。5次平行測定的回收率分別為:78.19%、87.80%、70.35%、78.30%和79.05%，平均回收率為78.74%，相對標準偏差為 7.9%
權利要求
1.本發(fā)明提供了一種檢測土壤中痕量井R霉素A的方法，具體操作步驟如下: (1)提取:稱取40.0 g含有0.05 1.00 mg/kg井岡霉素的土壤樣品，以40 mL緩沖溶液超聲提取15 min后,經過布氏漏斗減壓抽濾或離心15 min,再分別用30 mL、30 mL緩沖液洗漆殘洛、抽濾瓶或離心管，合并清液，用鹽酸或氫氧化鈉調節(jié)提取液的pH值； (2)富集:量取30mL經過預處理的陽離子交換樹脂于玻璃層析柱中，以60 mL pH 3.5的磷酸鹽緩沖液平衡后，將提取液上樣于層析柱中進行吸附富集； (3)去雜:分別用pH3.5的磷酸鹽緩沖溶液和乙醇淋洗去除雜質； (4)洗脫:用6(T175mL洗脫劑進行洗脫； (5)凈化:將步驟(4)的洗脫液以不高于60°C的溫度，在旋轉蒸發(fā)儀上濃縮至約30mL，加入10 g左右非極性大孔吸附樹脂振搖，過濾，用20 mL pH 7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌樹脂2次，過濾，合并濾液，在60°C下旋蒸近干，再用氮氣或空氣吹干，定量加入2.00 mLPH7.0的Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液超聲溶解； (6)檢測:將樣品溶液按下述色譜操作條件進行檢測=LC-1OAtvp型高效液相色譜儀，色譜柱=Aligent C18 plus柱，流動相:甲醇:pH7.0的Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液體積比2:98，流速:0.6 mL/min，檢測波長:210 nm，柱溫:35°C，進樣量:20 μ L ; (7)回收:將使用過的陽離子交換樹脂和非極性樹脂經過5%HCl和5% NaOH處理后回收再利用。
2.根據(jù)權利要求1的方法，步驟(I)中所述的緩沖溶液為濃度0.05、.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，pH值為6.0 9.0 ;離心速度為3000^15000 r/min ;清液的pH值為2.5 7.5。
3.根據(jù)權利要 求1的方法，步驟(2)中所述的陽離子交換樹脂為D072大孔強酸性陽離子交換樹脂，提取液上樣速度為0.3^1.0 mL/min。
4.根據(jù)權利要求1的方法，步驟(3)中所述pH3.5磷酸鹽緩沖溶液濃度為0.0Γ0.1mol/L，所用體積為60 200 mL，乙醇體積為60 200 mL，淋洗速度為0.5 1.0 mL/min。
5.根據(jù)權利要求1的方法，步驟(4)所述洗脫劑是選自以下溶劑中的一種:1mol/L氨水，1.5 mol/L氨水,2 mol/L氨水，I mol/L氨水:乙醇=1:1, 2:1, 3:1和4:1 (均為體積比)，洗脫速度為0.5 1.0 mL/min。
6.根據(jù)權利要求1的方法，步驟(5)中所述的非極性大孔吸附樹脂為X-5，使用前用5%HCl、5%Na0H、丙酮和乙醇進行預處理，振搖時間為20 mirTl h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種屬于土壤中農藥殘留分析領域的利用大孔強酸性陽離子交換樹脂和非極性大孔樹脂檢測土壤中痕量井岡霉素A的方法。該方法采用緩沖溶液提取土壤中的井岡霉素A，以大孔強酸性陽離子交換樹脂D072吸附井岡霉素A，然后以緩沖溶液和乙醇除雜，再利用非極性大孔吸附樹脂除去非極性雜質后采用常規(guī)反相柱進行痕量井岡霉素A的等度洗脫分析，從而實現(xiàn)對土壤中痕量井岡霉素A的檢測。本發(fā)明方法分別采用價格便宜的D072樹脂和X-5為吸附和凈化材料，不僅操作簡單，避免了有毒有機溶劑的反復萃取和昂貴的一次性固相萃取小柱的樣品凈化，也不需要液質聯(lián)用儀器便可以在普通的反相液相色譜柱上實現(xiàn)井岡霉素A的等度洗脫，既節(jié)約了成本，又避免了梯度洗脫造成的基線漂移。準確度高，回收率在70.35%~96.44%之間，精密度好，5次平行測定的相對標準偏差為7.1%~9.8%，最低檢限為0.01mg/kg。
文檔編號G01N30/06GK103235065SQ201310181728
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月17日 優(yōu)先權日2013年5月17日
發(fā)明者石國榮 申請人:向華