一種檢測尿液中pca3基因和psa基因表達量的熒光定量pcr法及其診斷試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及了一種用于檢測尿液樣本中PCA3基因和PSA基因表達量的熒光定量PGR法及其診斷試劑盒。該方法指首先跨內(nèi)含子設(shè)計PCA3和PSA的特異性的引物和Taqman熒光探針，2個探針使用不同的熒光染料進行標(biāo)記，可以在同一反應(yīng)液中進行擴增和檢測，然后利用含PCA3和PSA特異性擴增片段的體外轉(zhuǎn)錄RNA定量標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對尿液樣本中PCA3和PSA?mRNA分別進行定量，最后通過對比PCA3基因和PSA基因表達量，建立PCA3評分標(biāo)準(zhǔn)，PCA3分?jǐn)?shù)可以協(xié)助臨床醫(yī)生判斷患者得前列腺癌的可能性，有效預(yù)測前列腺穿刺陽性活檢率。該診斷試劑盒包括：PCA3/PSA-PCR反應(yīng)液、PCA3/PSA?RNA陽性對照、陰性對照、4種已知濃度的PCA3/PSA?RNA定量標(biāo)準(zhǔn)品。本發(fā)明為臨床利用尿液樣本進行前列腺癌早期篩查提供了一種新的方法。
【專利說明】—種檢測尿液中PCA3基因和PSA基因表達量的焚光定量PCR法及其診斷試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥及體外診斷試劑領(lǐng)域，具體涉及檢測尿液樣本中前列腺癌組織表達基因PCA3基因和PSA基因表達量的熒光定量PCR法及其診斷試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]前列腺癌(prostate carcinoma, PCa)是男性常見的惡性腫瘤之一，除少數(shù)病例外；其生長大多比較緩慢，潛伏期較長，有些甚至終生不被發(fā)現(xiàn)。許多患者早期沒有任何主觀不適，等出現(xiàn)臨床癥狀時已至疾病晚期，從而錯過了最佳治療時機。臨床上探尋前列腺癌的早期診斷方法，一直是研究的熱點。因此，開發(fā)早期診斷前列腺癌的試劑盒有重要的臨床價值。目前血清前列腺特異性抗原(PSA)是臨床應(yīng)用最廣泛的前列腺腫瘤標(biāo)記物，PSA敏感度高，但特異度較低，由此導(dǎo)致臨床前列腺穿刺活檢陰性幾率較高，以及多次前列腺重復(fù)穿刺活檢、過度診斷和過度醫(yī)療等問題。因此人們不斷尋找敏感性高，特異性強的檢測項目。
[0003]PCA3 (prostate cancer antigen3)是 1999 年 Bussemakers 等應(yīng)用差異顯不分析方法，通過比較前列腺癌組織和正常前列腺組織的mRNA表達譜時發(fā)現(xiàn)的一種前列腺癌特異性基因。PCA3基因位于9號染色體長臂2區(qū)I帶到2帶，全長25000bp，含有4個外顯子和3個內(nèi)含子，具有很高的組織特異性和癌特異性，在癌變的前列腺細(xì)胞中表達量很高，具有較高的敏感性和特異性，是最新發(fā)現(xiàn)的前列腺癌早期診斷篩查和對治療后的患者進行有效的監(jiān)測的標(biāo)記物。Hessels等應(yīng)用RT-PCR法證實，PCA3基因高度表達于前列腺癌組織，在正常前列腺、良性前列腺增生細(xì)胞中僅有少數(shù)表達或不表達，在其他腫瘤組織及器官中無表達，現(xiàn)已成為一種較有應(yīng)用前景的前列腺癌標(biāo)記物，它較之單一檢測PSA水平篩查前列腺癌具有更高的效能。
[0004]各種研究認(rèn)為PCA3基因序列中含有高密度的終止密碼子，因而PCA3表達非編碼的mRNA，而不產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白質(zhì)。因此，目前檢測PCA3的主要方法都是檢測PCA3 mRNA。研究還發(fā)現(xiàn)PCa組中PCA3 mRNA和PSA mRNA含量顯著高于前列腺增生組，PCA3 mRNA和PSAmRNA可作為PCa診斷的良好標(biāo)志。PSA mRNA診斷PCa的敏感度高于PCA3 mRNA,但特異度較之低，可能是由于PSA mRNA在腫瘤細(xì)胞中的表達量高于PCA3 mRNA，而PCA3 mRNA高度特異性地表達于PCa細(xì)胞。因此，若將PCA3 mRNA和PSA mRNA聯(lián)合檢測，則可相互彌補PCA3mRNA敏感度低和PSA mRNA特異性低的不足，從而大大提高對早期PCa的診斷效能。臨床評估證明PCA3在前列腺癌的診斷過程中能與PSA檢測結(jié)合，有效排除前列腺體積、炎癥等干擾因素，顯著提高前列腺癌的早期診斷價值。PCA3分?jǐn)?shù)=PCA3 mRNA表達量/PSA mRNA表達量。慢性前列腺炎、前列腺體積、PSA水平對PCA3分?jǐn)?shù)沒有影響。在世界多個地區(qū)、國家的人群多樣本研究中表明，PCA3分?jǐn)?shù)可以有效預(yù)測穿刺陽性活檢率。
[0005]目前有3種針對PCA3的診斷技術(shù)，第一種是以熒光定量PCR技術(shù)定量檢測PCA3mRNA的表達；第二種是uPM3技術(shù),是由Bostwick實驗室發(fā)展的基于核苷酸序列擴增的檢驗方法；第三種是Gen-P1be公司以APTIMA技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)分子診斷試劑盒，為目前唯一的商業(yè)化試劑盒。國內(nèi)外各種研究表明，利用熒光定量RT-PCR建立的PCA3評分方法，方法簡便、特異且重復(fù)性好，為臨床應(yīng)用提供了一種新方法。
[0006]本發(fā)明應(yīng)用Taqman熒光探針技術(shù)定量檢測尿液樣本中PCA3基因和PSA基因的mRNA的表達，然后通過對比兩種基因的表達，建立PCA3評分標(biāo)準(zhǔn)，PCA3分?jǐn)?shù)可以協(xié)助臨床醫(yī)生判斷患者得前列腺癌的可能性，有效預(yù)測前列腺穿刺陽性活檢率。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的提供一種可以同時對尿液樣本中PCA3基因和PSA基因表達量定量檢測體外診斷試劑盒。
[0008]本發(fā)明的另一目的在于建立一種對尿液樣本中PCA3基因和PSA基因表達量熒光定量PCR檢測方法，通過對比PCA3基因和PSA基因表達量，建立PCA3評分標(biāo)準(zhǔn)，PCA3分?jǐn)?shù)可以協(xié)助臨床醫(yī)生判斷患者得前列腺癌的可能性，有效預(yù)測前列腺穿刺陽性活檢率。
[0009]所述的PCA3/PSA mRNA熒光定量PCR檢測試劑盒包括PCA3/PSA-PCR反應(yīng)液、PCA3/PSA RNA陽性對照、陰性對照、4種已知濃度的PCA3/PSA RNA定量標(biāo)準(zhǔn)品。
[0010]所述的PCA3/PSA-PCR反應(yīng)液包括反轉(zhuǎn)錄PCR緩沖液、MgCl2、dNTP、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、PCA3基因上游引物(PCA3-F)、PCA3基因下游引物(PCA3-R)、PCA3基因熒光探針(PCA3-P)PSA基因上游引物(PSA-F)、PSA基因下游引物(PSA-R)、PSA基因熒光探針(PSA-P)、內(nèi)參基因上游引物(IC-F)、內(nèi)參基因下游引物(IC-R)和內(nèi)參基因熒光探針(IC-P)。
[0011]所述PCA3/PS A-PCR反應(yīng)液各成分的終濃度為:1X的反轉(zhuǎn)錄PCR緩沖液、4mM的MgCl2、0.4mM 的 dNTP、2U 的 Taq DNA 聚合酶、2U 的 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶、200nM 的 PCA3_F、200nM 的PCA3-R、150nM 的 PCA3_P、200nM 的 PSA_F、200nM 的 PSA_R、200nM 的 PSA-P、10nM 的 IC-F、10nM 的 IC-R 和 10nM 的 IC-P0
[0012]所述的PCA3-F序列為:
[0013]5' -GCTTCCTGTGTGTGTGGATATTTAA-3'；
[0014]所述的PCA3-R序列為:
[0015]5' -GAGAAGCTGGCATCAGAAAAACA-3'；
[0016]所述的PCA3-P序列為:
[0017]5' -TCCTGGTCTCCCTCGGCTGCA-3'；
[0018]所述的PSA-F序列為:
[0019]5' -GTCTGCGGCGGTGTTCTG-3;；
[0020]所述的PSA-R序列為:
[0021]5' -GCTGTGGCTGACCTGAAATACC-3'；
[0022]所述的PSA-P序列為:
[0023]5' -CCCCAGTGGGTSCTCACAGCTGC-3'；
[0024]所述的IC-F序列為:
[0025]5' -TGAAGGCTCATGGCAAGAAAGT-3'；
[0026]所述的IC-R序列為:
[0027]5' -TTGTCACAGTGCAGCTCACTCA-3'；
[0028]所述的ICP序列為:
[0029]5' -ACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCAC-3'；
[0030]其中PCA3-P的U端標(biāo)記FAM熒光報告基團，3'端標(biāo)記BHQl熒光淬滅基團；PSA-P的5'端標(biāo)記HEX熒光報告基團，3'端標(biāo)記BHQl熒光淬滅基團；IC_P的5'端標(biāo)記ROX熒光報告基團，3'端標(biāo)記BHQ2熒光淬滅基團。
[0031 ] 所述的PCA3/PSA RNA陽性對照為含靶序列的PCA3體外轉(zhuǎn)錄的RNA與含靶序列的PSA體外轉(zhuǎn)錄的RNA的等比例混合物。
[0032]所述的陰性對照為DEPC處理水。
[0033]所述的4種已知濃度的PCA3/PSA RNA定量標(biāo)準(zhǔn)品為含靶序列的PCA3體外轉(zhuǎn)錄的RNA與含靶序列的PSA體外轉(zhuǎn)錄的RNA的等比例混合物，濃度從高到底依次為17拷貝/mL、106 拷貝 /mL、105 拷貝 /mL 和 14 拷貝 /mL。
[0034]本發(fā)明中試劑盒的原理為:首先為避免PCA3和PSA基因組DNA的干擾，跨內(nèi)含子設(shè)計PCA3和PSA的特異性的引物和Taqman熒光探針，2個探針使用不同的熒光染料進行標(biāo)記，可以在同一反應(yīng)液中進行擴增和檢測。TaqMan技術(shù)是由美國Perkin Elmer (PE)公司研制的一種實時PCR技術(shù),它在一條20多bp的寡核苷酸探針的兩端分別標(biāo)記上突光發(fā)射基團(R)和淬滅基團(Q)，在PCR反應(yīng)中設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)品模板系列和陰性對照，根據(jù)FRET原理，探針完整時發(fā)射基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，當(dāng)PCR擴增時，Taq酶的5' -3'外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發(fā)射基團和熒光淬滅基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個游離的熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，并計算出Rn值、Λ Rn值、Ct值和閾值。Ct值是指樣品管的熒光信號達到某一固定閾值的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)。同時利用標(biāo)準(zhǔn)品模板系列繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合各樣品的Ct值，就可以確定樣品的起初模板量。根據(jù)不用的熒光標(biāo)記，儀器可以識別不同的熒光信號，達到分開檢測的目的，常用的熒光基團是FAM、J0E、HEX和R0X。在整個擴增中有2個酶起到重要作用，AMV反轉(zhuǎn)錄酶負(fù)責(zé)把mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，Taq酶負(fù)責(zé)PCR擴增。跨內(nèi)含子設(shè)計的引物可以避免基因組DNA的干擾，熒光探針可以使2種產(chǎn)物在一個反應(yīng)管中同時檢測到。通過自制的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別對PCA3mRNA和PSA mRNA進行定量，然后就可以得到PCA3分?jǐn)?shù)(PCA3分?jǐn)?shù)=PCA3 mRNA表達量/PSA mRNA表達量)，根據(jù)PCA3分?jǐn)?shù)臨床醫(yī)生可以判斷患者得前列腺癌的可能性，有效預(yù)測前列腺穿刺陽性活檢率。

【具體實施方式】
[0035]下列實施是旨在舉例說明，而不是限制本發(fā)明。
[0036]實施例1:本發(fā)明試劑盒的使用方法
[0037]I產(chǎn)品名稱:PCA3/PSA mRNA定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)
[0038]2預(yù)期用途:用于男性尿液樣本中PCA3和PSA mRNA的表達量進行定量檢測，通過計算PCA3和PSA mRNA的比值，確定PCA3分?jǐn)?shù)，為前列腺癌的早期診斷提供依據(jù)，為預(yù)測前列腺活檢陽性率提供參考。
[0039] 3試劑盒組成成分:2管PCA3/PSA-PCR反應(yīng)液(1.1mL/管)、I管PCA3/PSARNA陽性對照(200ul/管)、1管陰性對照(300ul/管)、1管PCA3/PSA RNA定量標(biāo)準(zhǔn)品I (200ul/管)、I 管 PCA3/PSA RNA 定量標(biāo)準(zhǔn)品 2 (200ul/管)、I 管 PCA3/PSA RNA 定量標(biāo)準(zhǔn)品 3 (200ul/管)、1管PCA3/PSA RNA定量標(biāo)準(zhǔn)品4 (200ul/管)和1份產(chǎn)品說明書。
[0040]4樣本的采集、保存和運輸:
[0041]4.1樣本采集:取當(dāng)日第一次晨尿，不少于50mL。
[0042]4.2樣本的保存和運輸:保存于4_8°C，48h內(nèi)檢測。樣本長距離運輸采用泡沫盒加冰袋，3h內(nèi)送達實驗室。
[0043]5樣本處理:取15mL尿液，使用商品化的總RNA提取試劑盒抽提RNA。
[0044]6試劑準(zhǔn)備:若樣本數(shù)為n，準(zhǔn)備n+6個PCR管，每管分裝45ul的PCA3/PSA-PCR反應(yīng)液，其中6指1份陽性對照、1份陰性對照和4份定量標(biāo)準(zhǔn)品。
[0045]7加樣:向分裝的PCR反應(yīng)液中依次分別加入5ul的陰性對照、抽提的RNA樣本、陽性對照和定量標(biāo)準(zhǔn)品。
[0046]8 上機:使用 ABI7500。
[0047]8.1樣品設(shè)置:根據(jù)樣本類型設(shè)置樣本編號、陰性對照、陽性對照和定量標(biāo)準(zhǔn)品(包括其濃度值)。
[0048]8.2熒光通道選擇:每個樣品選擇FAM、ROX和J0E3個通道。參比熒光(PassiveReference)設(shè)置為 none。
[0049]8.3反應(yīng)條件設(shè)定
[0050]

【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測尿液樣本中PCA3基因和PSA基因表達量的熒光定量PCR法，其特征在于: 為避免PCA3和PSA基因組DNA的干擾，首先跨內(nèi)含子設(shè)計PCA3和PSA的特異性的引物和Taqman熒光探針，2個探針使用不同的熒光染料進行標(biāo)記，可以在同一反應(yīng)液中進行擴增和檢測，同時加入內(nèi)參檢測引物和探針對樣本處理和PCR擴增進行全程監(jiān)控。然后利用含PCA3和PSA特異性擴增片段的體外轉(zhuǎn)錄RNA定量標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對尿液樣本中PCA3和PSA mRNA分別進行定量。最后通過對比PCA3基因和PSA基因表達量，建立PCA3評分標(biāo)準(zhǔn)，PCA3分?jǐn)?shù)可以協(xié)助臨床醫(yī)生判斷患者得前列腺癌的可能性，有效預(yù)測前列腺穿刺陽性活檢率。
2.如權(quán)利I所述，PCA3mRNA檢測所用的引物和探針為: 上游引物 PCA3-F 序列為 5' -GCTTCCTGTGTGTGTGGATATTTAA-3'； 下游引物 PCA3-R 序列為 5' -GAGAAGCTGGCATCAGAAAAACA-3'； 熒光探針PCA3-P序列為5' -TCCTGGTCTCCCTCGGCTGCA-3' ,5'端標(biāo)記FAM熒光報告基團，3'端標(biāo)記BHQl熒光淬滅基團。
3.如權(quán)利I所述，PSAmRNA檢測所用的引物和探針為: 上游引物 PSA-F 序列為:5' -GTCTGCGGCGGTGTTCTG-3'； 下游引物 PSA-R 序列為:5' -GCTGTGGCTGACCTGAAATACC-3'； 熒光探針 PSA-P 序列為:5 ' -CCCCAGTGGGTSCTCACAGCTGC-3' ,5'端標(biāo)記 HEX 熒光報告基團，3'端標(biāo)記BHQl熒光淬滅基團。
4.如權(quán)利I所述，內(nèi)參基因檢測所用的引物和探針為: 上游引物 IC-F 序列為:5' -TGAAGGCTCATGGCAAGAAAGT-3'； 下游引物 IC-R序列為:5' -TTGTCACAGTGCAGCTCACTCA-3'； 熒光探針 ICP 序列為:5 ' -ACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCAC-3'，5'端標(biāo)記 ROX 熒光報告基團，3'端標(biāo)記BHQ2熒光淬滅基團。
5.如權(quán)利I所述，PCA3標(biāo)準(zhǔn)品中含的特異性擴增片段為:
GAGAAGCTGGCATCAGAAAAACAGAGGGGAGATTTGTGTGGCTGCAGCCGAGGGAGACCAGGAAGATCTGCATGGTGGGAAGGACCTGATGATACAGAGGTGAGAAATAAGAAAGGCTGCTGACTTTACCATCTGAGGCCACACATCTGCTGAAATGGAGATAATTAACATCACTAGAAACAGCAAGATGACAATATAATGTCTAAGTAGTGACATGTTTTTGCACATTTCCAGCCCCTTTAAATATCCACACACACAGGAATC。
6.如權(quán)利I所述，PSA標(biāo)準(zhǔn)品中含的特異性擴增片段為:
GGGCAGTCTGCGGCGGTGTTCTGGTGCACCCCCAGTGGGTCCTCACAGCTGCCCACTGCATCAGGAACAAAAGCGTGATCTTGCTGGGTCGGCACAGCCTGTTTCATCCTGAAGACACAGGCCAGGTATTTCAGGTCAGCCACAGCTTCC0
7.一種PCA3和PSA mRNA核酸熒光定量PCR檢測試劑盒，該試劑盒包括:PCA3/PSA-PCR反應(yīng)液、PCA3/PSA RNA陽性對照、陰性對照、4種已知濃度的PCA3/PSA RNA定量標(biāo)準(zhǔn)品。
8.如權(quán)利7所述，PCA3/PSA-PCR反應(yīng)液各成分的終濃度為:1X的反轉(zhuǎn)錄PCR緩沖液、4mM 的 MgCl2、0.4mM 的 dNTP、2U 的 Taq DNA 聚合酶、2U 的 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶、200nM 的 PCA3-F、200nM 的 PCA3-R、150nM 的 PCA3_P、200nM 的 PSA_F、200nM 的 PSA_R、200nM 的 PSA-P、10nM的 IC-FUOOnM 的 IC-R 和 10nM 的 IC-P0
【文檔編號】G01N21/64GK104164474SQ201310182694
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2013年5月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月17日
【發(fā)明者】劉代新, 何勝祥 申請人:劉代新