摻假蜂蜜中寡糖的快速檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于食品檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種摻假蜂蜜中寡糖的快速檢測方法。本發(fā)明的目的在于針對目前市場上一部分摻入糖漿的蜂蜜，開發(fā)出一種可以快速、準確地對糖漿中的寡糖定性、定量的檢測方法。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明公開了一種檢測摻假蜂蜜中寡糖的快速檢測方法，包括方法的前處理，液相色譜分離和質(zhì)譜檢測三個步驟。該方法以質(zhì)荷比為851.3、1013.5和1175.5m/z的離子峰分別為五糖、六糖和七糖的特征檢測峰的HPLC-MS檢測方法。
【專利說明】摻假蜂蜜中寡糖的快速檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種摻假蜂蜜中寡糖的快速檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 純正天然的蜂蜜主要由單糖，包括葡萄糖和果糖組成，同時還含有較少量的二糖 和三糖。真正的蜂蜜是由昆蟲蜜蜂從開花植物的花中采得的花蜜在蜂巢中釀制的蜜，從釀 造到采蜜過程中禁止任何人為的添加活性成分或者蜂蜜中的花粉等顆粒物質(zhì)。然而，一些 不法商人為了牟取更高的利潤往往會往蜂蜜中加入與蜂蜜主要成分類似的轉(zhuǎn)化糖漿，如 甜菜糖漿、大米糖漿、木薯糖漿、菊苣糖漿等。過去針對蜂蜜的摻雜造假的檢測方法有碳 同位素方法（C4植物糖），薄層色譜法（TLC)，呋喃果糖苷酶法（BFF法），歐洲同位素方法 (LC-IRMS)方法，但這些方法都是國外人提出，而且經(jīng)過一段時間后，這些方法也不能適應 新環(huán)境的需要。我們通過通過大量的研究發(fā)現(xiàn)這些摻入蜂蜜中的糖漿中含有少量的寡糖 (包括五糖，六糖和七糖），而純正天然的蜂蜜中含有寡糖的量卻遠遠低于糖漿中的量。因 此，通過檢測蜂蜜中寡糖的含量是判別蜂蜜是否摻入糖漿的準確方法之一。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于針對目前市場上存在的摻假蜂蜜，提出一種選擇性好、靈敏度 高、操作簡單的摻假蜂蜜中寡糖的快速定性、定量檢測方法。
[0004] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明公開了一種摻假蜂蜜中寡糖的快速檢測方法，其 特征主要包括以下步驟：
[0005] 第一步：方法的前處理；
[0006] 第二步：液相色譜分離；
[0007] 第三步：質(zhì)譜檢測。
[0008] 該方法以質(zhì)荷比為851. 3、1013. 5和1175. 5m/z的離子峰分別為寡糖中五糖、六糖 和七糖的特征檢測峰的HPLC-MS/MS檢測方法。分別通過作五糖、六糖和七糖的標準曲線來 對摻假蜂蜜中五糖、六糖和七糖的含量進行精確定量。
[0009] 針對本發(fā)明步驟一，公開了一種已經(jīng)進行優(yōu)化的前處理步驟：準確稱量 1. 0 (±0. 01) g樣品于50ml樣品管中，加入5. 0ml水，渦旋至完全溶解，取200 μ 1加入樣品 瓶中，再加入800 μ 17 : 3乙腈：水定容至lml，渦旋混勻，過水相濾膜后進樣。
[0010] 針對本發(fā)明步驟二，還公開了一種已經(jīng)優(yōu)選的液相分離條件：色譜柱選用 proteomix WAX-NP5 (2. 1 X 100mm，5 μ m);柱溫為 35°C ;流動相為 A.乙腈-B. 0· 1 % 甲酸水 溶液，流速為〇. 25ml/min ;采用梯度洗脫的方式，以體積百分比計，0?lmin，A :80%、B : 20% ;1 ?4min，A :80%?30%，B :20%?70% ;4 ?5min，A :30%，B :70% ;5 ?5. lmin， A :30%?80%，B :70%?20% ;5· 1?6. 5min，A :80%，B :20% ;所述的液相分離采用在線 閥切換技術(shù)。
[0011] 最后，針對本發(fā)明步驟三，公開了已經(jīng)優(yōu)化好的質(zhì)譜檢測方法：采用電噴霧離子源 (ESI);毛細管電壓：3. 5KV ;干燥氣溫度：350°C ;干燥氣流量（氮氣）：5L/min ;鞘氣溫度： 40(TC ;霧化器壓力：50psig的條件下，進行正離子SRM掃描。五糖的檢測母離子為851. 3， 子離子包括365. 4、527. 4、689. 3、851. 3 ;六糖的檢測母離子為1013. 5,子離子包括689. 3， 85L 3,1013. 5 ;七糖的檢測母離子為 1175. 5,子離子包括 689. 3,85L 3,1013. 5,1175. 5.
[0012] 本發(fā)明的方法優(yōu)點在于：操作簡單，選擇性高，靈敏度高，樣品溶液經(jīng)過液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜多反應監(jiān)測選擇離子分析，采用外標法可以對摻假蜂蜜中寡糖的含量進行精確定 性定量，回收率在95?105%范圍內(nèi)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1為天然純正江蘇油菜蜂蜜檢測樣品檢測結(jié)果圖譜。
[0014] 圖2為摻入糖漿樣品檢測結(jié)果圖譜。
[0015] 圖3為陽性樣品的六糖與七糖的峰面積響應值與離子豐度比圖譜。
[0016] 圖4為假陽性樣品的六糖與七糖的峰面積響應值與離子豐度比圖譜。

【具體實施方式】
[0017] 1.前處理：準確稱量1. 0 (±0. 01) g樣品于50ml樣品管中，加入5. 0ml水，潤旋至 完全溶解，取200μ1加入樣品瓶中，再加入80〇μ 17 : 3乙腈：水定容至lml，渦旋混勻，過 水相濾膜后進樣。
[0018] 2.五糖、六糖和七糖的標準品溶液的配制：分別精確稱量0. 025g五糖、六糖和七 糖標準品，用超純水定容于25mL容量瓶中，得到lmg/ml標準溶液，再稀釋到1 μ g/ml標準 溶液。最后稀釋得到六個標準點：5ppb、10ppb、20ppb、50ppb、100ppb、200ppb，分別得到五 糖、六糖和七糖標準曲線。
[0019] 3.外標法定量，五糖的標準曲線方程為Y = 3. 154E4+3. 134E6*X，R2 = 0. 999 ;六 糖的標準曲線方程為Y = 1. 590E4+2. 907E6*X，R2 = 0. 999 ;七糖的標準曲線方程為Y = 7.251E3+2. 375E6*X, R2 = 0.999 ；
[0020] 4.檢測方法的重復性實驗：對內(nèi)蒙葵花、新疆葵花、遼寧洋槐、河南洋槐、山東洋 槐、河南荊條、湖北荊條、江蘇油菜、新疆油菜、四川油菜、新疆棉花、陜西棗花、吉林椴樹、內(nèi) 蒙蕎麥14種來自SGS公司的天然蜂蜜分別添加五糖、六糖和七糖，每一種均添加三個濃度 點，包括5ppb、50ppb、200ppb，平行測點三次，總體平均回收率均在95?105%范圍內(nèi)。
[0021] 5.通過對內(nèi)蒙葵花、新疆葵花、遼寧洋槐、河南洋槐、山東洋槐、河南荊條、湖北荊 條、江蘇油菜、新疆油菜、四川油菜、新疆棉花、陜西棗花、吉林椴樹、內(nèi)蒙蕎麥14種來自SGS 公司的天然蜂蜜進行分析發(fā)現(xiàn)，天然蜂蜜中幾乎不存在寡糖，如圖1為江蘇油菜的色譜圖。 圖2則為摻入了糖漿樣品的色譜圖。寡糖檢測為陽性的樣品的判據(jù)為：六糖與七糖的峰面 積響應值比在0.8?1.2之間，且碎片離子的相對豐度比如圖3所示。當六糖與七糖的峰 面積響應值比值> 1.2,且碎片離子的相對豐度比與陽性樣品不符，如圖4所示，則可判斷 此樣品為陰性，典型的代表為老瓜頭蜂蜜蜜種。
【權(quán)利要求】
1. 一種摻假蜂蜜中寡糖的快速檢測方法，包括方法的前處理、液相色譜分離和質(zhì)譜檢 測三個步驟，其特征在于該方法以質(zhì)荷比為851. 3、1013. 5和1175. 5m/z的離子峰分別為五 糖、六糖和七糖的特征檢測峰的HPLC-MS檢測方法。
2. 如權(quán)利要求1所述的快速檢測方法，其特征是所述的液相色譜分離條件為：色譜柱 選用 proteomix WAX-NP5 (2. 1 X 100mm，5 μ m);柱溫為 35°C ;流動相為 A.乙腈-B. 0· 1 % 甲 酸水溶液，流速為〇. 25ml/min。
3. 如權(quán)利要求1所述的快速檢測方法，其特征是所述的質(zhì)譜檢測方法為：采用電噴霧 離子源（ESI);在毛細管電壓：3. 5KV ;干燥氣溫度：350°C ;干燥氣流量（氮氣）：5L/min ;鞘 氣溫度：400°C ;霧化器壓力：50psig的條件下，進行正離子SRM掃描。
【文檔編號】G01N30/02GK104215704SQ201310219463
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月5日
【發(fā)明者】徐錦忠, 吳斌, 張曉燕, 劉秀紅, 丁濤, 張睿, 楊波 申請人:江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心, 江蘇中譜檢測有限公司