檢測人Lp-PLA2蛋白的熒光免疫層析試紙及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及檢測人Lp-PLA2蛋白的熒光免疫層析試紙及其制備方法。所述試紙通過雙抗體夾心法檢測人Lp-PLA2蛋白，所述雙抗體夾心法采用標(biāo)記有熒光微球的第一Lp-PLA2單克隆抗體作為捕獲抗體，所述第一Lp-PLA2單克隆抗體來源于序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述的序列中的一者；并且所述雙抗體夾心法采用第二Lp-PLA2單克隆抗體作為檢測抗體，所述第二Lp-PLA2單克隆抗體來源于序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述的序列中的另一者。本發(fā)明的熒光免疫層析試紙操作簡便、快速、檢測范圍寬、特異性高、靈敏度好。
【專利說明】檢測人LP-PLA2蛋白的巧光免疫層析試紙及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于多膚化學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及人脂蛋白相關(guān)磯脂酶A2 (LP-PLA2) 抗原表位膚、用該抗原表位膚制備的LP-PLA2特異性抗原和相應(yīng)的單克隆抗體或多克隆抗 體、所述抗體在制備人LP-PLA2體外診斷試劑盒上的用途，人LP-PLA2體外診斷試劑盒，W 及一種用于定量檢測待測物中人LP-PLA2蛋白的英光免疫層析試紙及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 也腦血管疾病一直被公認(rèn)為是危害人類健康的最大殺手之一，也是全球范圍內(nèi)造 成死亡的最主要原因。我國每年死于也腦血管疾病的人數(shù)高達(dá)300萬W上，現(xiàn)有患者超過 6000萬人。近年來，隨著居民生活水平的不斷提高，自然環(huán)境的不斷惡化，各種人群的也腦 血管疾病的患病率、發(fā)病率和死亡率都呈逐年上升的趨勢。尤其是中老年人的發(fā)病率高達(dá) 62%，因此預(yù)防治療也腦血管疾病已經(jīng)變得刻不容緩，它不僅關(guān)系到廣大人民群眾的健康生 活問題，在一定程度上還影響著整個國家國民素質(zhì)的整體情況。
[0003] 也腦血管疾病的病理基礎(chǔ)是動脈粥樣硬化。近年來，研究發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化是一 種炎性反應(yīng)性疾病，炎性細(xì)胞及其釋放的產(chǎn)物被認(rèn)為是最主要的促動脈粥樣硬化的因素。 在粥樣斑塊形成、進(jìn)展和最終破裂的過程中均有炎性反應(yīng)介質(zhì)的參與。
[0004] 因此，尋找一種能夠反應(yīng)該種動態(tài)變化過程的介質(zhì)尤為重要，目前國際上已經(jīng) 發(fā)現(xiàn)了一種新的炎性反應(yīng)標(biāo)志物，即脂蛋白相關(guān)磯脂酶A2化ipoprotein-Associated Phospholipase A2，Lp-PLA2)。
[0005] 脂蛋白相關(guān)磯脂酶A2,英文簡寫LP-PLA2,屬于磯脂酶A2家族，主要由炎癥細(xì)胞 巧口巨瞻細(xì)胞和淋己細(xì)胞)分泌。LP-PLA2是由441個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量為45KDa。 LP-PLA2具有降解血小板活化因子的活性，又稱為血小板活化因子己醜水解酶（PAF-AH)。 80%的LP-PLA2與低密度脂蛋白（LDL)結(jié)合，能水解低密度脂蛋白上的氧化卵磯脂，生成溶 血卵磯脂和氧化型游離脂肪酸，后二者是促炎物質(zhì)，因此LP-PLA2具有促炎癥和促動脈粥 樣硬化形成的作用。
[0006] 當(dāng)動脈粥樣硬化的炎癥發(fā)展到嚴(yán)重程度時，LP-PLA2將會被大量釋放入血液中，致 使其血液內(nèi)的水平大幅增高，因此LP-PLA2在血液中的濃度能夠反映動脈粥樣斑塊的炎癥 程度。
[0007] 因此，通過檢測血液中的LP-PLA2,可W有效地了解動脈粥樣硬化斑塊的炎癥程度 及其穩(wěn)定性。該樣就可預(yù)警也肌梗死和腦血栓的發(fā)生，對預(yù)防也腦血管突發(fā)事件具有相當(dāng) 重要的意義。
[0008] 檢測LP-PLA2最理想的方法是免疫測定。因此，尋找合適的具有免疫原性的 LP-PLA2抗原表位膚、制備特異性的LP-PLA2抗原及抗體即成為了重點。
[0009] 英光免疫層析方法測血液中的待測物操作簡便、快速，只需10分鐘就能完成樣品 檢測，并且檢測范圍寬，靈敏度好，能夠迅速及時地幫助診斷病情，監(jiān)測預(yù)后。中國專利申 請No. 200910117820. 8公開了一種英光微球免疫層析試紙條的制備方法及定量檢測方法； 中國專利申請No. 200910047352. I公開了一種英光免疫層析試紙及其制備方法和應(yīng)用。然 而，目前還沒有針對人LP-PLA2蛋白的英光免疫層析試紙。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題，本發(fā)明提供了一種用于定量檢測待測物中 人LP-PLA2蛋白的英光免疫層析試紙及其制備方法。
[0011] 具體而言，本發(fā)明提供了：
[0012] 一種用于定量檢測待測物中人LP-PLA2蛋白的英光免疫層析試紙，該試紙通過雙 抗體夾也法檢測所述人LP-PLA2蛋白，其中：
[0013] 所述雙抗體夾也法采用標(biāo)記有英光微球的第一 LP-PLA2單克隆抗體作為捕獲抗 體，所述第一 LP-PLA2單克隆抗體來源于人LP-PLA2抗原表位膚（1)和（2)中的一者；并且
[0014] 所述雙抗體夾也法采用第二LP-PLA2單克隆抗體作為檢測抗體，所述第二 LP-PLA2單克隆抗體來源于人LP-PLA2抗原表位膚（1)和（2)中的另一者；
[00巧]所述人LP-PLA2抗原表位膚（1)和（2)分別為：
[0016] (1)Thr-Lys-Ile-Pro-Arg-Gly-Asn-Gly-Pro-Arg-Ser-Lys-Glu-Ser-Tyr ；
[0017] (2)Tyr-Lys-Gly-Asp-Ile-Asp-Ser-Asn-Val-Ala-Ile-Asp-Leu-Ser-Asn。
[0018] 優(yōu)選地，所述第一 LP-PLA2單克隆抗體是由第一 LP-PLA2抗原制備而成的，該第一 LP-PLA2抗原是通過使所述人LP-PLA2抗原表位膚（1)和（2)中的一者與載體蛋白偶聯(lián)制 備而成的；并且
[0019] 所述第二LP-PLA2單克隆抗體是由第二LP-PLA2抗原制備而成的，該第二LP-PLA2 抗原是通過使所述人LP-PLA2抗原表位膚（1)和（2)中的另一者與載體蛋白偶聯(lián)制備而成 的。
[0020] 優(yōu)選地，所述英光微球的粒徑為320nm至400nm。
[0021] 優(yōu)選地，所述英光微球上的英光物質(zhì)為異硫氯酸英光素、四己基羅丹明、四甲基異 硫氯酸羅丹明或X-羅丹明，其中優(yōu)選為X-羅丹明；所述英光微球的微球材料為聚苯己帰、 聚甲基丙帰酸甲醋或甲基丙帰酸甲醋的共聚物。
[0022] 優(yōu)選地，所述英光微球的激發(fā)波長為350?600皿，優(yōu)選為390皿；發(fā)射波長為 500 ?700nm，優(yōu)選為 615nm。
[0023] 優(yōu)選地，所述英光免疫層析試紙具有底板，并且在該底板上沿使用時的層析方向 依次W接觸方式設(shè)置有：樣品墊、結(jié)合墊、反應(yīng)膜、吸水濾紙，所述結(jié)合墊設(shè)置有所述的標(biāo)記 有英光微球的第一 LP-PLA2單克隆抗體，所述反應(yīng)膜包括檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述檢測區(qū)包 被有所述第二LP-PLA2單克隆抗體，所述質(zhì)控區(qū)包被有能與所述的標(biāo)記有英光微球的第一 LP-PLA2單克隆抗體特異性結(jié)合的抗抗體。
[0024] 優(yōu)選地，所述反應(yīng)膜為在大于550nm的波長下基本上不發(fā)英光的硝酸纖維素膜。 [00巧]優(yōu)選地，所述底板基本上不具有英光性質(zhì)。
[0026] 優(yōu)選地，所述抗抗體為羊抗鼠IgG單克隆抗體或兔抗鼠IgG單克隆抗體，其中優(yōu)選 為羊抗鼠IgG單克隆抗體。
[0027] 本發(fā)明還提供了一種制備所述的用于定量檢測待測物中人LP-PLA2蛋白的英光 免疫層析試紙的方法，其包括W下步驟：
[002引 I)提供標(biāo)記有英光微球的第一 LP-PLA2單克隆抗體；
[0029] 2)提供結(jié)合墊，其中在所述結(jié)合墊上包被所述的標(biāo)記有英光微球的第一 LP-PLA2 單克隆抗體；
[0030] 3)提供反應(yīng)膜，其中在所述反應(yīng)膜上沿使用時的層析方向間隔固定第二LP-PLA2 單克隆抗體和抗抗體，W分別形成檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)；和
[0031] 4)在底板上沿使用時的層析方向依次W接觸方式設(shè)置樣品墊、所述結(jié)合墊、所述 反應(yīng)膜、吸水濾紙，從而制成所述英光免疫層析試紙。
[0032] 優(yōu)選地，所述步驟1)包括：
[0033] a)用碳二亞胺活化英光微球，優(yōu)選地，將英光微球的水分散液或MES緩沖液分散 液經(jīng)超聲波處理并與碳二亞胺混合，從而活化所述英光微球；
[0034] b)洗涂步驟a)所獲得的活化的英光微球，優(yōu)選地，將步驟a)所獲得的活化的英光 微球用N-輕基硫代玻巧醜亞胺-巧樣酸緩沖液洗涂、分散，并經(jīng)超聲波處理；
[00巧]C)用步驟b)所獲得的英光微球標(biāo)記第一 LP-PLA2單克隆抗體，優(yōu)選地，將步驟b) 所獲得的英光微球與第一 LP-PLA2單克隆抗體混合，用BSA-己醇胺緩沖液封閉，離也，用 BSA-吐溫水溶液分散，經(jīng)超聲波處理，從而得到標(biāo)記有英光微球的第一 LP-PLA2單克隆抗 體。
[0036] 優(yōu)選地，在所述步驟2)中，所述的標(biāo)記有英光微球的第一 LP-PLA2單克隆抗體的 包被濃度為0. 5?2mg/ml。
[0037] 優(yōu)選地，在所述步驟3)中，所述檢測區(qū)和所述質(zhì)控區(qū)間隔3mm至8mm，所述第二 LP-PLA2單克隆抗體和所述抗抗體的包被濃度分別為0. 5?2mg/ml。
[0038] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有W下優(yōu)點和積極效果：
[0039] 1.本發(fā)明的人LP-PLA2抗原表位膚具有良好的抗原性，用其制備的抗原(免疫原） 免疫動物能夠產(chǎn)生高度特異性的單克隆抗體和多克隆抗體。
[0040] 2.用本發(fā)明制備的LP-PLA2單克隆抗體和多克隆抗體能夠高度特異地與血液樣 本中的LP-PLA2結(jié)合。
[0041] 3.本發(fā)明的人LP-PLA2體外診斷試劑盒可W有效地監(jiān)測動脈粥樣硬化斑塊的炎 癥程度及其穩(wěn)定性，可預(yù)警也肌梗死和腦血栓的發(fā)生，預(yù)防也腦血管突發(fā)事件。
[0042] 4.本發(fā)明將英光分析技術(shù)與快速層析免疫技術(shù)相結(jié)合，提供了一種用于定量檢測 待測物中人LP-PLA2蛋白的英光免疫層析試紙，用該試紙檢測待測物中的人LP-PLA2蛋白， 操作簡便、快速，只需10分鐘就能完成樣品檢測，并且檢測范圍寬、特異性高、靈敏度好，能 夠迅速及時地幫助診斷病情，監(jiān)測預(yù)后。
[0043] 5.本發(fā)明在制備所述人LP-PLA2蛋白的英光免疫層析試紙的過程中，通過大量的 試驗摸索，優(yōu)化了各方面的制備條件，使得用本發(fā)明的英光免疫層析試紙進(jìn)行檢測時，英光 信背比大大提高，從而提高了檢測靈敏度和結(jié)果可信度；此外，本發(fā)明還通過試紙的檢測區(qū) 與質(zhì)控區(qū)的英光強度比值的變化來反應(yīng)樣品中LP-PLA2的含量，該與傳統(tǒng)的層析技術(shù)只考 查檢測區(qū)的絕對英光強度相比，最大程度上減少了外界條件和背景等的影響，進(jìn)一步提高 了檢測結(jié)果可信度。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0044] 圖I示意性示出本發(fā)明的一個實施方案的英光免疫層析試紙的結(jié)構(gòu)示意圖。

【具體實施方式】
[0045] W下通過【具體實施方式】的描述并參照附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但該并非是對 本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可W做出各種修改或改進(jìn)，但是只 要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0046] 一、人LP-PLA2抗原表位膚
[0047] 本文中所述的人LP-PLA2蛋白是本領(lǐng)域已知的，其氨基酸序列是本領(lǐng)域已知的， 可W在NCBI等專業(yè)數(shù)據(jù)庫中查到。
[004引本發(fā)明提供了一種人LP-PLA2抗原表位膚（1)和（2)，其氨基酸序列分別如序列表 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示，為：
[0049] (1)T虹-Lys-IIe-Pro-Arg-Gly-Asn-Gly-Pro-Arg-Ser-Lys-Glu-Ser-Tyr ;
[0050] (2)Tyr-LyS-Gly-Asp-Ile-Asp-Ser-Asn-Val-Ala-Ile-Asp-Leu-Ser-Asn。
[0051] 本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量的理論研究和實驗摸索，最終篩選得到兩種具有良好的 抗原性的抗原表位膚。
[0052] LP-PLA2抗原表位膚（1) W人LP-PLA2蛋白N端第54至62位的一段含9個氨基 酸殘基的膚段為抗原決定簇，并且在其C端添加有親水性膚段Arg-Ser-Lys-Glu-Ser-Tyr, 該樣構(gòu)成的LP-PLA2抗原表位膚（1)具有親水性高、抗原性強并且易于合成的特點。
[0053] LP-PLA2抗原表位膚（2) W人LP-PLA2蛋白C端第372至385位的一段含14個氨 基酸殘基的膚段為抗原決定簇，并且在其N端添加有Tyr。在N端添加Tyr是為了使該抗原 表位膚通過抓B (Bis-diazotizedbenzidine dichloride)交聯(lián)到載體蛋白（例如血藍(lán)蛋白 (KLH))上，從而作為抗原來制備抗體。LP-PLA2抗原表位膚（2)也具有親水性高、抗原性強 并且易于合成的特點。
[0054] 目前，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的LP-PLA2抗原表位膚具有如下功能：
[0055] 1.具有抗原性；2.與載體蛋白連接后作為免疫原刺激動物產(chǎn)生特異性的抗體； 3.用抗原表位膚制備的抗體可特異性地與人LP-PLA2結(jié)合。
[0056] 本發(fā)明的LP-PLA2抗原表位膚的制備方法可用化學(xué)合成法；利用美國ABI431A型 多膚自動合成儀，通過固相法合成抗原表位膚。本發(fā)明的抗原表位膚（1)和（2)的分子量 分別為1690. 09和1623. 92,可用質(zhì)譜進(jìn)行確定，并通過多膚序列測定鑒定所合成的抗原表 位膚序列。膚段的純度用薄層色譜和高效液相色譜進(jìn)行評定，并測定抗原表位膚的濃度。
[0057] 二、LP-PLA2 抗原
[0058] 本發(fā)明還提供了一種LP-PLA2抗原，其通過使本發(fā)明的人LP-PLA2抗原表位膚（1) 和（2)中的一者與載體蛋白偶聯(lián)制備而成。具體而言，本發(fā)明提供了 LP-PLA2抗原（1)和 (2)，所述LP-PLA2抗原（1)通過使本發(fā)明的人LP-PLA2抗原表位膚（1)與載體蛋白偶聯(lián)制 備而成；所述LP-PLA2抗原（2)通過使本發(fā)明的人LP-PLA2抗原表位膚（2)與載體蛋白偶 聯(lián)制備而成。本發(fā)明的LP-PLA2抗原具有免疫原性和特異性，是一種免疫原，可用來免疫動 物從而制備特異性的LP-PLA2抗體。在本發(fā)明中，可用的載體蛋白的例子包括KLH(鑰孔血 藍(lán)蛋白）、牛血清白蛋白（BSA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH (鑰孔血藍(lán)蛋白）免疫原性強，結(jié) 合位點多，免疫效果較好，并且與免疫動物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，用其作為載體蛋白不易引起交叉 反應(yīng)，因此是優(yōu)選的。
[0059] H、LP-PLA2單克隆抗體、LP-PLA2多克隆抗體和人LP-PLA2體外診斷試劑盒
[0060] 本發(fā)明還提供了人LP-PLA2單克隆抗體和人LP-PLA2多克隆抗體，所述抗體可W 分別利用本發(fā)明的LP-PLA2抗原（1)和（2)(免疫原）免疫動物制備而得。制備方法可采 用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，具體可參見實施例2。
[0061] 本發(fā)明的LP-PLA2單克隆抗體和多克隆抗體可W用于制備人LP-PLA2體外診斷試 劑盒，該試劑盒可W基于免疫方法對血液標(biāo)本中的LP-PLA2進(jìn)行檢測。
[0062] 因此，本發(fā)明提供了一種人LP-PLA2體外診斷試劑盒，其包含本發(fā)明的人LP-PLA2 單克隆抗體或多克隆抗體。
[0063] 目前已知可用于臨床檢驗的免疫實驗方法主要包括W下幾種；ELISA法、化學(xué)發(fā) 光法、英光層析法、膠體金免疫測定法等。
[0064] 而化ISA法包括W下幾種類型；雙抗體夾也法檢測抗原、雙抗原夾也法檢測抗體、 間接法測抗體、競爭法測抗體、競爭法測抗原、捕獲包被法測抗體等。
[0065] 本發(fā)明的人LP-PLA2體外診斷試劑盒優(yōu)選采用ELISA雙抗體夾也法來檢測 LP-PLA2蛋白。該試劑盒可W包含包被抗體、結(jié)合抗體、酶標(biāo)記的第二抗體和/或必要的工 具和試劑等。
[0066] 優(yōu)選的是，所述人LP-PLA2體外診斷試劑盒采用本發(fā)明的人LP-PLA2單克隆抗體 作為包被抗體。在此，術(shù)語"包被抗體"是指包被于固相的酶標(biāo)板上的抗體。此外，所述人 LP-PLA2體外診斷試劑盒還優(yōu)選包含人LP-PLA2多克隆抗體W作為結(jié)合抗體，其中，當(dāng)所述 結(jié)合抗體來源于本發(fā)明的人LP-PLA2抗原表位膚（1)和（2)中的一者時，所述包被抗體來 源于所述抗原表位膚（1)和（2)中的另一者。在此，術(shù)語"結(jié)合抗體"是指試劑盒中可與待 測抗原及酶標(biāo)記第二抗體結(jié)合的特異性抗體。所述試劑盒還可W包含酶標(biāo)記的第二抗體， 該第二抗體可W為羊抗兔IgG抗體，所述酶標(biāo)記可W為辣根過氧化物酶、堿性磯酸酶等。
[0067] 用本發(fā)明的人LP-PLA2體外診斷試劑盒進(jìn)行臨床研究，對115例病人和79例對照 組血樣標(biāo)本進(jìn)行檢測，檢測靈敏度為93%，特異度為91%，準(zhǔn)確性為92%。
[0068] 基于此結(jié)果可W得知，利用本發(fā)明的LP-PLA2抗體制備的人LP-PLA2體外診斷試 劑盒能夠監(jiān)測動脈粥狀硬化的炎癥程度，對于也肌梗塞和腦血栓的發(fā)生具有相當(dāng)重要的預(yù) 警作用。
[0069] 在本發(fā)明的試劑盒中，還可W包含檢測所需的任何試劑或工具，例如預(yù)包被板、洗 涂液、顯色劑、終止液等。
[0070] 四、用于定量檢測人LP-PLA2蛋白的英光免疫層析試紙
[0071] 本發(fā)明還提供了一種用于定量檢測待測物中人LP-PLA2蛋白的英光免疫層析試 紙，該試紙通過雙抗體夾也法檢測所述人LP-PLA2蛋白，其中：
[0072] 所述雙抗體夾也法采用標(biāo)記有英光微球的第一 LP-PLA2單克隆抗體作為捕獲抗 體，所述第一 LP-PLA2單克隆抗體來源于人LP-PLA2抗原表位膚（1)和（2)中的一者；并且
[0073] 所述雙抗體夾也法還采用第二LP-PLA2單克隆抗體作為檢測抗體，所述第二 LP-PLA2單克隆抗體來源于人LP-PLA2抗原表位膚（1)和（2)中的另一者；
[0074] 所述人LP-PLA2抗原表位膚（1)和（2)分別為：
[0075] (1)Thr-Lys-Ile-Pro-Arg-Gly-Asn-Gly-Pro-Arg-Ser-Lys-Glu-Ser-Tyr ；
[0076] (2)Tyr-Lys-Gly-Asp-Ile-Asp-Ser-Asn-Val-Ala-Ile-Asp-Leu-Ser-Asn。
[0077] 在本發(fā)明中，在雙抗體夾也法英光免疫層析試紙中，"捕獲抗體"是指能夠首先特 異性識別待測抗原的抗體，其通常設(shè)置在結(jié)合墊上；"檢測抗體"是指另一種能夠特異性識 別待測抗原的抗體，其與捕獲抗體分別識別待測抗原分子上的不同的抗原表位，其通常固 定在反應(yīng)膜的檢測區(qū)上。
[0078] 在本發(fā)明中，所述第一 LP-PLA2單克隆抗體可W由第一 LP-PLA2抗原制備而成，該 第一 LP-PLA2抗原可W通過使所述人LP-PLA2抗原表位膚（1)和（2)中的一者與載體蛋白 偶聯(lián)制備而成；并且所述第二LP-PLA2單克隆抗體可W由第二LP-PLA2抗原制備而成，該第 二LP-PLA2抗原可W通過使所述人LP-PLA2抗原表位膚（1)和（2)中的另一者與載體蛋白 偶聯(lián)制備而成。
[0079] 在本發(fā)明中，可用的載體蛋白的例子包括KLH (鑰孔血藍(lán)蛋白）、牛血清白蛋白 (BSA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH (鑰孔血藍(lán)蛋白）免疫原性強，結(jié)合位點多，免疫效果較 好，并且與免疫動物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，用其作為載體蛋白不易引起交叉反應(yīng)，因此是優(yōu)選的。
[0080] 優(yōu)選地，本發(fā)明的英光免疫層析試紙中所用的英光微球的粒徑為320nm至400nm， 優(yōu)選為360nm，英光微球上的英光物質(zhì)可為異硫氯酸英光素、四己基羅丹明、四甲基異硫氯 酸羅丹明或X-羅丹明等，其中優(yōu)選為X-羅丹明（可購自上海晶純公司）。英光微球的微球 材料可W為由聚苯己帰、聚甲基丙帰酸甲醋或甲基丙帰酸甲醋與其它單體共聚形成的共聚 物，其它單體的例子為苯己帰等。英光微球的激發(fā)波長可W為350?600nm，優(yōu)選為390nm ; 發(fā)射波長可W為500?700皿，優(yōu)選為615皿。
[0081] 在本發(fā)明中，英光微球的最大激發(fā)波長與發(fā)射波長差值較大，說明英光微球有較 大的斯巧克斯（Stokes)位移，該樣，英光試紙的背景干擾較低，W該微球做免疫層析標(biāo)記物 有較強的優(yōu)勢。
[0082] 在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的英光免疫層析試紙具有底板，并且在該底 板上沿使用時的層析方向依次W接觸方式設(shè)置有：樣品墊、結(jié)合墊、反應(yīng)膜、吸水濾紙， 所述樣品墊用于在使用時加載待測樣品，所述結(jié)合墊設(shè)置有所述的標(biāo)記有英光微球的第 一 LP-PLA2單克隆抗體，所述反應(yīng)膜包括檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述檢測區(qū)包被有所述第二 LP-PLA2單克隆抗體，所述質(zhì)控區(qū)包被有能與所述的標(biāo)記有英光微球的第一 LP-PLA2單克 隆抗體特異性結(jié)合的抗抗體。
[0083] 優(yōu)選地，本發(fā)明的英光免疫層析試紙的樣品墊、結(jié)合墊、反應(yīng)膜、吸水濾紙可W沿 使用時的層析方向依次搭接設(shè)置在底板上(參見圖1)。反應(yīng)膜上間隔設(shè)置的檢測區(qū)和質(zhì)控 區(qū)可W為，但不限于，線、帶、塊等形式，檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)優(yōu)選間隔3mm至8mm。
[0084] 在本發(fā)明中，反應(yīng)膜優(yōu)選為在大于550nm的波長下基本上不發(fā)英光的硝酸纖維素 膜。此外，底板優(yōu)選基本上不具有英光性質(zhì)。
[0085] 通常，常規(guī)的層析試紙組件(反應(yīng)膜、底板等)在550nm波長下具有較明顯的英光背 景，該對英光信號的檢測產(chǎn)生很大干擾。本發(fā)明通過采用在大于550nm的波長下基本上不 發(fā)英光的硝酸纖維素膜和低英光性質(zhì)的底板，從而克服了常規(guī)英光試紙的缺陷。此外，本發(fā) 明所用的英光物質(zhì)X-羅丹明可產(chǎn)生較強的英光信號，從而進(jìn)一步大大提高了英光信背比， 使得能夠很好地區(qū)分信號和背景，進(jìn)而提高檢測靈敏度。
[0086] 在本發(fā)明中，樣品墊和結(jié)合墊的材料可采用本領(lǐng)域通常使用的材料，例如，樣品墊 和結(jié)合墊可W為玻璃纖維。
[0087] 本發(fā)明所采用的能與標(biāo)記有英光微球的第一 LP-PLA2單克隆抗體特異性結(jié)合的 抗抗體可W為羊抗鼠IgG單克隆抗體或兔抗鼠IgG單克隆抗體，其中優(yōu)選為羊抗鼠IgG單 克隆抗體，與多克隆抗體相比，單克隆抗體特異性更高。
[0088] 在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的英光免疫層析試紙在使用時，在樣品墊上滴 加樣品液巧日含有LP-PLA2的血樣)，在毛細(xì)管作用下，樣品液向吸水濾紙一端移動，在結(jié)合 墊處與所述的標(biāo)記有英光微球的第一 LP-PLA2單克隆抗體形成免疫復(fù)合物，該免疫復(fù)合物 進(jìn)一步移動，在檢測線上與所述第二LP-PLA2單克隆抗體結(jié)合形成雙抗體夾也的免疫復(fù)合 物，而未形成免疫復(fù)合物的標(biāo)記有英光微球的第一 LP-PLA2單克隆抗體則與質(zhì)控線上的抗 抗體結(jié)合。此過程需要10分鐘至15分鐘，之后，用英光檢測儀進(jìn)行檢測，如果質(zhì)控線處未出 現(xiàn)條帶，則說明試紙失效；如果質(zhì)控線處出現(xiàn)條帶，而檢測線處未出現(xiàn)條帶，則說明樣品中 不含人LP-PLA2蛋白；如果在質(zhì)控線和檢測線上均出現(xiàn)條帶，則說明樣品中含有人LP-PLA2 蛋白。
[0089] 在另一個方面，本發(fā)明提供了一種制備用于定量檢測待測物中人LP-PLA2蛋白的 英光免疫層析試紙的方法，其包括W下步驟：
[0090] 1)提供標(biāo)記有英光微球的第一 LP-PLA2單克隆抗體；
[0091] 2)提供結(jié)合墊，其中在所述結(jié)合墊上包被所述的標(biāo)記有英光微球的第一 LP-PLA2 單克隆抗體；
[0092] 3)提供反應(yīng)膜，其中在所述反應(yīng)膜上沿使用時的層析方向間隔固定第二LP-PLA2 單克隆抗體和抗抗體，W分別形成檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)；和
[0093] 4)在底板上沿使用時的層析方向依次W接觸方式設(shè)置樣品墊、所述結(jié)合墊、所述 反應(yīng)膜、吸水濾紙，從而制成所述英光免疫層析試紙。
[0094] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可W理解的是，可W根據(jù)實際需要對上述步驟的順序進(jìn)行調(diào)整， 例如步驟3)可W在步驟1)之前，或在步驟1)和2)之間。
[0095] 本發(fā)明的方法還可W包括將制成的英光免疫層析試紙切割成適當(dāng)寬度的步驟5)。
[0096] 本發(fā)明的發(fā)明人通過大量的試驗摸索，優(yōu)化了制備本發(fā)明的用于檢測人LP-PLA2 蛋白的英光免疫層析試紙的方法的各個步驟的條件，從而使得本發(fā)明的英光免疫層析試紙 能夠針對人LP-PLA2蛋白獲得符合臨床檢測要求的結(jié)果，即，檢測范圍寬、特異性高、靈敏 度好。
[0097] 因此，優(yōu)選的是，在本發(fā)明的方法中，所述步驟1)包括：
[0098] a)用碳二亞胺活化英光微球，優(yōu)選地，將英光微球的水分散液或MES緩沖液分散 液經(jīng)超聲波處理并與碳二亞胺混合，從而活化所述英光微球；
[0099] b)洗涂步驟a)所獲得的活化的英光微球，優(yōu)選地，將步驟a)所獲得的活化的英光 微球用N-輕基硫代玻巧醜亞胺-巧樣酸緩沖液洗涂、分散，并經(jīng)超聲波處理；
[0100] C)用步驟b)所獲得的英光微球標(biāo)記第一 LP-PLA2單克隆抗體，優(yōu)選地，將步驟b) 所獲得的英光微球與第一 LP-PLA2單克隆抗體混合，用BSA-己醇胺緩沖液封閉，離也，用 BSA-吐溫水溶液分散，經(jīng)超聲波處理，從而得到標(biāo)記有英光微球的第一 LP-PLA2單克隆抗 體。
[0101] 在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述步驟1)包括：
[0102] a)用碳二亞胺活化英光微球，其中，取I (w/v) %的英光微球水分散液，10000巧m至 15000巧m低溫(例如IOC )離也5至10分鐘，去上清，將沉淀物分散到500 y 1的蒸觸水或 初洗緩沖液（0. IM的MES水溶液）中，超聲波（240W)處理1至2分鐘，重復(fù)W上過程H次， 加入碳二亞胺IOmg至50mg，攬拌10?15分鐘，從而活化所述英光微球；
[0103] b)洗涂步驟a)所獲得的活化的英光微球，其中，將步驟a)所獲得的活化的英光 微球在1000巧m至1500化pm下離也5至10分鐘，將沉淀物分散到Iml偶聯(lián)緩沖液（20? IOOmM的N-輕基硫代玻巧醜亞胺-巧樣酸緩沖液)）中，超聲波（240W)處理1至2分鐘，重 復(fù)W上過程H次；
[0104] C)用步驟b)所獲得的英光微球標(biāo)記第一 LP-PLA2單克隆抗體，其中，按照1 至 3 y 1抗體（lOmg/ml) /100 y 1所述活化的英光微球的比例，將步驟b)所獲得的英光微球與 第一 Lp-PLA2單克隆抗體混合，室溫（25°C )下攬拌1. 5?3小時(優(yōu)選2小時)，加入Iml封 閉緩沖液（1 (w/v)%BSA-〇. 05M己醇胺)，繼續(xù)攬拌1小時，在10000巧m至15000巧m下離也5 至10分鐘，重復(fù)離也3次，將沉淀物分散到500 y 1終洗緩沖液（0. 5 (w/v) %BSA-〇. 11 (v/v) % 吐溫水溶液）中，超聲波（240W)處理I至2分鐘，用所述終洗緩沖液定容至500 y 1。
[0105] 優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，所述步驟2)包括；將標(biāo)記有英光微球的第一 LP-PLA2 單克隆抗體用抗體稀釋液（l%(w/v)BSA-〇. OlMPBS (抑7. 2)緩沖液）進(jìn)行稀釋，W稀釋至 0. 5?2mg/ml，優(yōu)選為Img/ml，然后用微量移液器均勻噴涂在結(jié)合墊上，之后烘干或真空冷 凍干燥。在本發(fā)明的方法的步驟2)中，所述的標(biāo)記有英光微球的第一 LP-PLA2單克隆抗體 的包被濃度為0. 5?2mg/ml，優(yōu)選為1. 5mg/ml。
[0106] 優(yōu)選地，所述步驟3)包括；用噴金機將所述第二LP-PLA2單克隆抗體和抗抗體劃 到硝酸纖維素膜（固相載體）上W作為檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，使檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的間隔為3mm至 8mm，所述第二Lp-PLA2單克隆抗體和所述抗抗體的濃度分別為0. 5?2mg/ml，優(yōu)選為Img/ ml O
[0107] 優(yōu)選地，結(jié)果檢測利用專用的英光檢測儀(可購自深圳市安群生物工程有限公司， 型號AQ-3000)對質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)進(jìn)行檢測，檢測區(qū)與質(zhì)控區(qū)英光強度的比值和待測樣品中 的LP-PLA2的含量成正比。采用檢測區(qū)與質(zhì)控區(qū)英光強度的比值而不是直接采用檢測區(qū)的 絕對英光值可盡可能地減少反應(yīng)條件、基質(zhì)等的影響，并盡量避免背景干擾。
[010引 W下通過例子的方式進(jìn)一步解釋或說明本發(fā)明的內(nèi)容，但該些例子不應(yīng)被理解為 對本發(fā)明的保護范圍的限制。
[0109] 實施例
[0110] 除非另有說明，W下所述溶液均為水溶液，溶液中的百分?jǐn)?shù)均為體積百分?jǐn)?shù)。
[01川實施例1 ;Lp-PLA2抗原表位膚（1)和（2)的制備。
[0112] 制備方法用化學(xué)合成法：利用美國ABI431A型多膚自動合成儀，通過固相法分別 合成LP-PLA2抗原表位膚（1)和（2)。抗原表位膚的純度用高效液相色譜進(jìn)行評定，并測定 膚段的濃度。本發(fā)明的抗原表位膚（1)和（2)的分子量分別為1690. 09U623. 92,利用質(zhì)譜 進(jìn)行確定，通過多膚序列測定鑒定所合成的多膚序列。
[0113] 一、LP-PLA2抗原表位膚（1)和（2)的合成
[0114] 上述膚段采用固相法合成。固相膚合成的主要思想是：先將所要合成膚鏈的駿基 末端氨基酸的駿基W共價鍵形式同一個不溶性的高分子化合物（樹脂）相連接，然后W此 結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份，經(jīng)過脫去氨基保護基并同過量的活化駿基組份 反應(yīng)，接長膚鏈。該樣的步驟可W反復(fù)地多次進(jìn)行下去，最后達(dá)到所需要合成的膚鏈的長 度。該個合成過程如下所示。

【權(quán)利要求】
1. 一種用于定量檢測待測物中人LP-PLA2蛋白的熒光免疫層析試紙，該試紙通過雙抗 體夾心法檢測所述人Lp-PLA2蛋白，其中 ： 所述雙抗體夾心法采用標(biāo)記有熒光微球的第一 Lp-PLA2單克隆抗體作為捕獲抗體，所 述第一 Lp-PLA2單克隆抗體來源于人Lp-PLA2抗原表位肽（1)和（2)中的一者；并且 所述雙抗體夾心法采用第二Lp-PLA2單克隆抗體作為檢測抗體，所述第二Lp-PLA2單 克隆抗體來源于人Lp-PLA2抗原表位肽（1)和（2)中的另一者； 所述人Lp-PLA2抗原表位肽（1)和（2)分別為： (1) Thr-Lys-Ile-Pr〇-Arg-Gly-Asn-Gly-Pr〇-Arg-Ser-Lys-Glu-Ser-Tyr ； (2) Tyr-Lys-Gly-Asp-Ile-Asp-Ser-Asn_Val-Ala-Ile-Asp-Leu-Ser-Asn〇
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析試紙，其中所述第一 Lp-PLA2單克隆抗體是由 第一 Lp-PLA2抗原制備而成的，該第一 Lp-PLA2抗原是通過使所述人Lp-PLA2抗原表位肽 (1)和（2)中的一者與載體蛋白偶聯(lián)制備而成的；并且 所述第二Lp-PLA2單克隆抗體是由第二Lp-PLA2抗原制備而成的，該第二Lp-PLA2抗 原是通過使所述人Lp-PLA2抗原表位肽（1)和（2)中的另一者與載體蛋白偶聯(lián)制備而成 的。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析試紙，其中所述熒光微球的粒徑為320nm至 400nm〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析試紙，其中所述熒光微球上的熒光物質(zhì)為異硫 氰酸熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明或X-羅丹明，其中優(yōu)選為X-羅丹明；所 述熒光微球的微球材料為聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯的共聚物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析試紙，其中所述熒光微球的激發(fā)波長為350? 600nm，優(yōu)選為390nm ;發(fā)射波長為500?700nm，優(yōu)選為615nm。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析試紙，其中所述試紙具有底板，并且在該底板 上沿使用時的層析方向依次以接觸方式設(shè)置有：樣品墊、結(jié)合墊、反應(yīng)膜、吸水濾紙，所述結(jié) 合墊設(shè)置有所述的標(biāo)記有熒光微球的第一 Lp-PLA2單克隆抗體，所述反應(yīng)膜包括檢測區(qū)和 質(zhì)控區(qū)，所述檢測區(qū)包被有所述第二Lp-PLA2單克隆抗體，所述質(zhì)控區(qū)包被有能與所述的 標(biāo)記有熒光微球的第一 Lp-PLA2單克隆抗體特異性結(jié)合的抗抗體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的熒光免疫層析試紙，其中所述反應(yīng)膜為在大于550nm的波長 下基本上不發(fā)熒光的硝酸纖維素膜。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的熒光免疫層析試紙，其中所述底板基本上不具有熒光性質(zhì)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的熒光免疫層析試紙，其中所述抗抗體為羊抗鼠 IgG單克隆抗 體或兔抗鼠 IgG單克隆抗體，其中優(yōu)選為羊抗鼠 IgG單克隆抗體。
10. -種制備根據(jù)權(quán)利要求1至9中任意一項所述的熒光免疫層析試紙的方法，其包括 以下步驟： 1) 提供標(biāo)記有突光微球的第一 Lp-PLA2單克隆抗體； 2) 提供結(jié)合墊，其中在所述結(jié)合墊上包被所述的標(biāo)記有熒光微球的第一 Lp-PLA2單克 隆抗體； 3) 提供反應(yīng)膜，其中在所述反應(yīng)膜上沿使用時的層析方向間隔固定第二Lp-PLA2單克 隆抗體和抗抗體，以分別形成檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)；和 4)在底板上沿使用時的層析方向依次以接觸方式設(shè)置樣品墊、所述結(jié)合墊、所述反應(yīng) 膜、吸水濾紙，從而制成所述熒光免疫層析試紙。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述步驟1)包括： a) 用碳二亞胺活化熒光微球，優(yōu)選地，將熒光微球的水分散液或MES緩沖液分散液經(jīng) 超聲波處理并與碳二亞胺混合，從而活化所述熒光微球； b) 洗滌步驟a)所獲得的活化的熒光微球，優(yōu)選地，將步驟a)所獲得的活化的熒光微球 用N-羥基硫代琥珀酰亞胺-檸檬酸緩沖液洗滌、分散，并經(jīng)超聲波處理； c) 用步驟b)所獲得的熒光微球標(biāo)記第一 Lp-PLA2單克隆抗體，優(yōu)選地，將步驟b)所 獲得的熒光微球與第一 Lp-PLA2單克隆抗體混合，用BSA-乙醇胺緩沖液封閉，離心，用 BSA-吐溫水溶液分散，經(jīng)超聲波處理，從而得到標(biāo)記有熒光微球的第一 Lp-PLA2單克隆抗 體。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中在所述步驟2)中，所述的標(biāo)記有熒光微球的第 一 Lp-PLA2單克隆抗體的包被濃度為0. 5?2mg/ml。
13. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中在所述步驟3)中，所述檢測區(qū)和所述質(zhì)控區(qū)間 隔3mm至8_，所述第二Lp-PLA2單克隆抗體和所述抗抗體的包被濃度分別為0. 5?2mg/ ml〇
【文檔編號】G01N33/577GK104237517SQ201310242801
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月18日
【發(fā)明者】朱建安 申請人:深圳市安群生物工程有限公司